Screening bioaktiver Nanopartikel in phagozytischen Immunzellen für Inhibitoren der Toll-like Receptor Signaling

Das übergeordnete Ziel dieses Screening-Verfahrens ist es, neuartige bioaktive Nanopartikel zu identifizieren, die die Signalübertragung von Toll-like-Rezeptoren hemmen können. Diese Methode kann Ihnen helfen, neuartige Nanoinhibitoren physisch zu identifizieren, die auf die Signalübertragung von Toll-like-Rezeptoren in angeborenen Immunzellen abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und robust ist und mit Reporterzellsystemen einfach durchzuführen ist.

Die Anwendungen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie vieler entzündlicher Erkrankungen, da festgestellt wurde, dass die Toll-like-Rezeptor-Signalgebung an der Pathogenese dieser Krankheiten beteiligt ist. Obwohl diese Methode ein hohes Screening auf Gold-Nanopartikel bieten kann, kann sie auch auf andere Nanopartikelsysteme sowie auf therapeutische kleine Moleküle und die Biologie angewendet werden. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Nährmedien wie im Textprotokoll beschrieben vor.

Geben Sie anschließend 100 Milliliter hochreines endotoxinfreies Wasser in einen sauberen 125-Milliliter-Glaskolben. Fügen Sie einen Beutel mit sekretiertem embryonalem alkalischen Phosphatase-Substratpulver hinzu und schwenken Sie die Lösung vorsichtig, bis sie vollständig aufgelöst ist. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um eine vollständige Auflösung der Substrate zu gewährleisten.

Filtrieren Sie die Lösung mit einer 0,2-Mikrometer-Membran. Bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Geben Sie anschließend einen Beutel mit Luciferase-Substratpulver in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das 25 Milliliter ultrareines endotoxinfreies Wasser enthält.

Nachdem sich das Pulver vollständig aufgelöst hat, bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern. Bereiten Sie dann die Stammlösungen aller anderen Reagenzien vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem Sie die Zellen kultiviert und vorbereitet haben, werden sie aus dem Kulturkolben in ein Zentrifugenröhrchen überführt.

Schleudern Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem 300-fachen G herunter. Dann resuspendieren Sie sie im R-10-Medium in einer Konzentration von 1 x 10 auf die 6 Zellen pro Milliliter. Aliquote der PMA-Lösung werden der Zellsuspension so zugegeben, dass die Endkonzentration 50 Nanogramm pro Milliliter beträgt.

Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reagenzreservoir. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit flachem Boden. Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie danach einen Vakuumsauger, um das Nährmedium vorsichtig zu entfernen. Überprüfen Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die abgeleiteten Makrophagen am Boden der Vertiefung haften. Waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 100 Mikrolitern PBS pro Vertiefung für jede Wäsche.

Geben Sie dann 100 Mikroliter frisches R-10-Medium in jede Vertiefung. Lassen Sie die Zellen zwei Tage lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius ruhen, bevor Sie den Reporter-Assay durchführen. Bestimmen Sie zunächst die optimale LPS-Dosis, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie anschließend 180 Mikroliter vorgewärmte Quanti-Blue-Lösung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Flachbodenplatte. Übertragen Sie dann 20 Mikroliter Überstand von jeder Probe in die Platte. Inkubieren Sie ein bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius, damit sich die Farbe von Rosa zu Dunkelblau entwickeln kann.

Nachdem die optische Dichte über eins liegt, verwenden Sie ein Plattenlesegerät, um die Absorption bei 655 Nanometern zu bestimmen. Um mit der Analyse der IRF-Aktivierung zu beginnen, übertragen Sie 10 Mikroliter frischen Überstand aus jeder Probe in eine frische 96-Well-Platte mit klarem Flachboden. Geben Sie mit der Autoinjektion 50 Mikroliter der Luciferase-Lösung in jede Vertiefung

Sammeln Sie dann sofort die Lumineszenz Well für Well, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen, um die optimale LPS-Konzentration für das Nanopartikel-Screening zu bestimmen. Als nächstes zentrifugieren Sie 20 Volumina der Peptid-GMP-Hybridlösung in 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen bei 18.000 G für 30 Minuten. Entsorgen Sie die Überstände vorsichtig.

Gib die Hybriden in eine einzige frische Tube und wasche sie zweimal mit einem Milliliter PBS. Danach resuspendieren Sie die gewaschenen Hybriden in einem Volumen R-10-Medium. Mischen Sie gleiche Volumina der konzentrierten Hybriden und des LPS, das R-10-Medium enthält, so dass die Endkonzentration der Hybriden und des LPS 100 Nanomolar bzw. 10 Nanogramm pro Milliliter beträgt.

Entfernen Sie anschließend das Nährmedium von der Makrophagen-Kulturplatte. Geben Sie 100 Mikroliter des Hybrid-LPS-Gemischs in jede Vertiefung, mit drei Replikaten für jede Erkrankung. Fügen Sie eine Negativkontrolle und eine LPS-Kontrolle hinzu.

Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie dann das Medium jeder Vertiefung in ein separates Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.000 G und vier Grad Celsius für 30 Minuten.

Übertragen Sie die Überstände in eine frische runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Um mit dem Reporter-Assay an diesen Proben zu beginnen, geben Sie 180 Mikroliter vorgewärmte Quanti-Blue-Lösung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-Platte mit flachem Boden. Übertragen Sie dann 20 Mikroliter der Überstände aus jeder Probe in diese Platte.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden, bis sich die dunkelblaue Farbe zu einer optischen Dichte über eins entwickelt. Danach wird die Absorption mit einem Plattenleser bei 655 Nanometern aufgezeichnet. Übertragen Sie als Nächstes 10 Mikroliter frischen Überstand von jeder Probe in eine 96-Well-Platte mit klarem flachem Boden.

Geben Sie mit einem automatischen Injektor 50 Mikroliter der Luciferase-Lösung in jede Vertiefung und zeichnen Sie die Lumineszenz sofort Vertiefung für Vertiefung auf. Validieren Sie dann die inhibitorische Wirkung der potenziellen Kandidaten und bewerten Sie die TLR-Spezifität, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird die Aktivierung von NF-Kappa B AP1 mit dem kolorimetrischen SEAP-Assay nachgewiesen, wobei die TLR-4-Aktivierung durch LPS zur Aktivierung von NF-Kappa B AP1 und zur Produktion von SEAP führt.

Das freigesetzte SEAP wandelt das Substrat um, was zu einer Farbänderung führt, die proportional zur Menge an SEAP ist, die bei der Stimulation freigesetzt wird. Dies wird durch Messung der Extinktion bei 655 Nanometern quantifiziert. Als nächstes führte die LPS-vermittelte Aktivierung von IRF zur Expression von Luciferase, die das Substrat katalysierte, um Lumineszenz zu erzeugen.

Aus diesen Dosiswirkungen wird eine optimale LPS-Konzentration von 10 Nanogramm pro Milliliter bestimmt, um eine zuvor etablierte Bibliothek von Peptid-GMP-Hybriden zu screenen. Daraus wird eine Gruppe von Hybriden identifiziert, die die LPS-getriggerte Aktivierung sowohl für NF-Kappa B AP1 als auch für IRF hemmen können. Die Validierung dieser inhibitorischen Aktivität zeigt, dass mit zunehmender LPS-Konzentration die inhibitorischen Wirkungen des Hybrids erwartungsgemäß abnehmen.

Anschließend wird eine Immunoblottierung durchgeführt, um die Hemmaktivität zu bestätigen. Es wird angenommen, dass der Leithybrid die p65-Phosphorylierung reduziert, den Abbau von I-Kappa B alpha hemmt und die IRF3-Phosphorylierung verzögert, was bestätigt, dass der Leithybrid P12 in der Lage ist, die LPS-vermittelnde TLR-4-Signalübertragung zu hemmen. Weitere Untersuchungen zeigen, dass P12 auch die TLR-2- und TLR-5-vermittelte NF-Kappa B AP1-Signalgebung sowie die TLR-3-vermittelte IRF-Aktivierung reduziert, was darauf hindeutet, dass P12 eine starke inhibitorische Aktivität auf mehreren TLR-Signalwegen hat.

Im Anschluss an dieses Verfahren sind weitere Maßnahmen wie Immunblotting und der Zytotoxizitätstest durchzuführen, um die Screening-Ergebnisse zu validieren und falsch positive Entdeckungen zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für andere Forscher auf dem Gebiet der Nanomedizin, um Nanoinhibitoren in der Toll-like-Rezeptor-Signalübertragung als Therapeutika der nächsten Generation und informatorische Therapeutika zu erforschen.