Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Interaktion zwischen einem heteromeren Protein-Komplex und DNA in einem heterologen System für jede funktionelle genomische Untersuchung unter Standardlaborbedingungen zu untersuchen und zu validieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik zu beantworten, beispielsweise die gezielte Genomik. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Protein-DNA-Interaktionen nachweisen kann, an denen mehr als ein Protein oder Transkriptionsfaktor beteiligt ist.

Beginnen Sie dieses Verfahren am Nachmittag dessen, was als Tag eins bezeichnet wird. Starten Sie eine 5-Milliliter-Kultur in synthetischem definiertem oder SD-Medium ohne Uracil aus einer frisch bestrichenen Petrischale. Inkubieren Sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius.

Am folgenden Nachmittag 10 Milliliter YPDA-Medium mit 500 Mikrolitern der Übernachtkultur ansäen und über Nacht in einem Schüttler bei 30 Grad Celsius inkubieren. Am frühen Morgen des darauffolgenden Tages 100 Milliliter YPDA-Medium mit 2 Milliliter der Übernachtkultur ansäen. Diese frische Kultur bei 30 Grad Celsius wachsen lassen, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern einen Wert zwischen 0,4 und 0,8 erreicht.

Zentrifugieren Sie bei 1000 × g und 21 °C für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie 10 mL steriles Wasser hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Vortexen.

Zentrifugieren bei 1000 × g und 21 °C für fünf Minuten. Das Überstand entfernen, 2 Milliliter TE-Lithiumacetat hinzufügen und den Pellet durch Vortexen wiederaufnehmen. Zentrifugieren bei 1000 × g und 21 °C für fünf Minuten.

Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 4 Milliliter TE-Puffer mit Lithiumacetat sowie 400 Mikroliter DNA aus Lachssperma hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Die Zellen sind nun bereit für die Transformation, wie im nächsten Abschnitt gezeigt.

Die Ko-Transformation der Zellen erfolgt in einer 96-Well-U-Boden-Mischplatte. Verteilen Sie zunächst 20 µL kompetente Zellen pro Vertiefung in der 96-Well-Platte. Geben Sie dann in die Vertiefungen jeweils 150 Nanogramm der beiden Plasmide und der Normalisierungskontrolle.

Dieses Schema zeigt den allgemeinen Plattenansatz für die Ko-Transformation der Hefezellen mit dem Protein von Interesse. Der Plattenansatz kann je nach den Anforderungen des Experiments und der Anzahl der getesteten DNA-Bereiche oder -Fragmente angepasst werden. Geben Sie 100 µL TE-Lithiumacetat-Polyethylenglykol pro Vertiefung hinzu und mischen Sie dreimal durch Pipettieren.

Decken Sie die Platte mit einem atmungsaktiven Siegel ab und inkubieren Sie sie bei 30 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten. Führen Sie eine Hitzeschockbehandlung bei 42 Grad Celsius genau 20 Minuten lang durch. Nach dem Hitzeschock zentrifugieren Sie bei 1000 × g und 21 Grad Celsius für 5 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand mit einer Mehrkanalpipette. Geben Sie 110 Mikroliter TE hinzu und mischen Sie. Zentrifugieren Sie erneut für 5 Minuten.

Entfernen Sie 100 Mikroliter des Überstandes aus jedem Well. Tauchen Sie einen Locher in 100 % Ethanol, flämmen Sie ihn ab, warten Sie eine Minute, bis die Locherstifte abgekühlt sind, und verwenden Sie dann den sterilen Locher, um das Pellet erneut in Suspension zu bringen. Überführen Sie die Zellen auf SD-Tryptophan- und Leucin-ausgezählte Agarplatten.

Die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Am Nachmittag des fünften Tages die Auger-Platten aus dem Inkubator entnehmen. Jede Vertiefung der sterilen 96er-U-Boden-Mischplatte mit 50 Mikroliter TE füllen. Einen sterilen Puncher in TE vorbenetzen, die Kolonien von der SD-Tryptophan- und Lucin-Auswahlplatte ausstechen und in der mit TE gefüllten Platte resuspendieren.

Übertragen Sie die Kolonien auf neue SD-Tryptophan- und Leucin-Mangelplatten, um eine optimale Flächenbedeckung zu erzielen. Inkubieren Sie die Platten 2 Tage lang bei 30 Grad Celsius. Am Nachmittag des 7. Tages entnehmen Sie die Mangelplatten aus dem Inkubator.

Füllen Sie jedes Loch einer sterilen 96er-Platte mit u-förmigem Boden mit jeweils 50 Mikrolitern SD-Tryptophan- und Lucin-Auswahlmedium. Füllen Sie jedes Loch eines sterilen 96er-Tieflochblocks mit jeweils 180 Mikrolitern SD-Tryptophan- und Lucin-Auswahlmedium. Sterilisieren Sie den Kolonie-Puncher, benetzen Sie ihn vorab mit Medium und übertragen Sie Kolonien von der Platte in die Löcher, die jeweils 50 Mikroliter Medium enthalten.

Übertragen Sie 20 Mikroliter Hefe in 180 Mikroliter SD-Tryptophan- und Leucin-Mangelmedium. Versiegeln Sie den Block mit einer atmungsaktiven Folie und inkubieren Sie ihn 36 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Übertragen Sie am Morgen des neunten Tages 100 Mikroliter Kultur in 500 Mikroliter YPDA-Medium in einem sterilisierten 96-Tieflochblock.

Mit einer atmungsaktiven Versiegelung abdecken und bei 30 Grad Celsius unter Schütteln mit 200 U/min drei bis fünf Stunden inkubieren. Nach drei bis fünf Stunden die Kultur erneut suspendieren und 125 Mikroliter aus jedem Well in eine Spektrophotometer-Platte überführen. Die optische Dichte bei 600 Nanometern messen, um sicherzustellen, dass sie zwischen 0,3 und 0,6 liegt.

Zentrifugieren Sie die verbleibenden Zellen im Deep-Well-Block bei 3000 × g und 21 °C für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand durch Umkippen. Geben Sie 200 µL Z-Puffer in jedes Loch und wirbeln Sie kräftig um.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 3000 G und 21 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand durch Umkippen. Geben Sie 21 µL Z-Puffer in jede Vertiefung und wirbeln Sie um.

Decken Sie die Platte mit einer Dichtfolie ab, die gegen Einfrier- und Auftauzyklen beständig ist. Führen Sie in einer Abzugshaube 4 Einfrier- und Auftauzyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff und einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad durch. Geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete Z-Puffer-Beta-Mercaptoethanol-ONPG-Lösung in jedes Loch.

Bei 30 Grad Celsius 17 bis 24 Stunden inkubieren oder bis sich die Farbe entwickelt hat. Am Morgen des 10. Tages überprüfen, ob sich die Farbe entwickelt hat. Zur Stopptung der Reaktion 110 Mikroliter einer einmolarigen Natriumcarbonat-Lösung in jedes Loch geben.

Notieren Sie die Zeit und wirbeln Sie die Platte. Zentrifugieren Sie bei 3000 × g und 21 °C für zehn Minuten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 125 µL Überstand aus jedem Well in eine Spektrophotometer-Platte zu übertragen.

Messen Sie die optische Dichte bei 420 Nanometern. Berechnen Sie die Beta-Galactosidase-Aktivität in einer Tabellenkalkulation, wie im textbasierten Protokoll beschrieben. In dieser Studie wurde der Promotorbereich von 2600 Basenpaaren upstream der Transkriptionsstartstelle in sechs Bereiche oder Fragmente unterteilt.

Dieses Foto zeigt ein Beispiel für eine gut gewachsene und positive Platte nach Tag fünf des Protokolls. In diesem repräsentativen Ergebnis zeigen die DNA-Fragmente eins und vier eine positive Wechselwirkung mit dem Protein A- und B-Komplex. Nach der Messung der Beta-Galactosidase-Aktivität zeigt Fragment eins eine vierfache Induktion der Reportergen-Aktivität.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Verfahren nur zur Gewinnung von Informationen über DNA-Bereiche empfohlen wird, nachdem die vorgeschlagene Protein-Protein-Interaktion bestätigt wurde, und nicht dazu dient, Informationen über Zielstellen bereitzustellen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie ein Chip-Assay und Msar durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären. Zum Beispiel die Identifizierung der Zielstellen in vivo.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Rolle multimerer Protein-Komplexe, die an ein gemeinsames DNA-Ziel binden, testen und validieren kann.