Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die heteromere Proteinkomplex-DNA-Interaktion in einem heterologen System für jede funktionelle genomische Studie in einer regulären Laborumgebung zu untersuchen und zu validieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der funktionellen Genomik zu beantworten, wie z. B. die geplante Genomik. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Protein-DNA-Wechselwirkungen erkennt, an denen mehr als ein Protein oder ein Transkriptionsfaktor beteiligt ist.

Beginnen Sie diese Prozedur am Nachmittag dessen, was als erster Tag bezeichnet wird. Starten Sie eine 5 Milliliter Kultur in synthetischem definiertem oder SD-Medium ohne Uracil aus einer frisch gestreiften Petrischale. Über Nacht in einem 30 Grad Celsius heißen Shaker inkubieren.

Am folgenden Nachmittag 10 Milliliter YPDA-Medium mit 500 Mikrolitern der Nachtkultur beimpfen und über Nacht in einem 30 Grad Celsius heißen Shaker inkubieren. Am frühen Morgen des Folgetages 100 Milliliter YPDA-Medium mit 2 Millilitern der Nachtkultur impfen. Wachsen Sie diese frische Kultur bei 30 Grad Celsius, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,8 erreicht.

Zentrifugieren Sie bei 1000 mal G und 21 Grad Celsius für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 10 Milliliter steriles Wasser hinzu und rekonstituieren Sie das Pellet durch Vortexen.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1000 g und 21 Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 2 Milliliter TE-Lithiumacetat hinzu und rekonstituieren Sie das Pellet durch Vortexen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1000 g und 21 Grad Celsius.

Entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 4 Milliliter TE-Lithiumacetat plus 400 Mikroliter Lachsspermien-DNA hinzu und resuspendieren Sie das Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Die Zellen sind nun bereit für die Transformation, wie im nächsten Segment gezeigt wird.

Die Co-Transformation der Zellen erfolgt in einer 96-Well-Mischplatte mit U-Boden. Verteilen Sie zunächst 20 Mikroliter kompetenter Zellen pro Vertiefung in der 96-Well-Platte. Geben Sie dann in die Vertiefungen jeweils 150 Nanogramm der beiden Plasmide und die Normalisierungskontrolle.

Dieses Schema zeigt die allgemeine Platte, die für die Co-Transformation der Hefezellen mit dem interessierenden Protein aufgebaut ist. Der Aufbau der Platte kann je nach den Anforderungen des Experiments und der Anzahl der getesteten DNA-Regionen oder -Fragmente geändert werden. Geben Sie 100 Mikroliter Lithiumacetat-Polyethylenglykol von TE pro Vertiefung hinzu und mischen Sie dreimal durch Pipettieren.

Decken Sie die Platte mit einem atmungsaktiven Verschluss ab und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für genau 20 Minuten. Nach dem Hitzeschock bei 1000 mal G und 21 Grad Celsius 5 Minuten lang zentrifugieren.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um den Überstand zu entfernen. 110 Mikroliter TE hinzufügen und mischen. Erneut 5 Minuten zentrifugieren.

Entfernen Sie 100 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung. Tauchen Sie einen Puncher in 100%iges Ethanol, flammen Sie ihn ab, warten Sie eine Minute, bis die Puncherstifte abgekühlt sind, und verwenden Sie dann den sterilen Puncher, um das Pellet wieder zu suspendieren. Übertragen Sie die Zellen auf SD-, Tryptophan- und Lucin-Drop-out-Schneckenplatten.

Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Holen Sie am Nachmittag des fünften Tages die Schneckenplatten aus dem Inkubator. Füllen Sie jede Vertiefung der sterilen 96-Well-Mischplatte mit U-Boden mit 50 Mikrolitern TE. Befeuchten Sie einen sterilen Puncher mit TE, stanzen Sie die Kolonien aus der SD-Tryptophan- und Lucin-Drop-out-Platte und resuspendieren Sie sie in der TE-gefüllten Platte.

Übertragen Sie die Kolonien auf neue SD-Tryptophan- und Lucin-Drop-out-Schneckenplatten, um eine optimale Oberflächenabdeckung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Platten 2 Tage lang bei 30 Grad Celsius. Holen Sie am Nachmittag von Tag 7 die Schneckenplatten aus dem Inkubator.

Füllen Sie jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Mischplatte mit U-Boden mit 50 Mikrolitern SD-Tryptophan und Lucin-Drop-out-Medium. Füllen Sie jede Vertiefung eines sterilen 96-Deep-Well-Blocks mit 180 Mikrolitern SD-Tryptophan- und Lucin-Drop-out-Medium. Sterilisieren Sie den Puncher, befeuchten Sie den Puncher und das Medium vor und übertragen Sie die Kolonien von der Platte in die Vertiefungen, die jeweils 50 Mikroliter Medium enthalten.

Übertragen Sie 20 Mikroliter Hefe auf die 180 Mikroliter SD-Tryptophan- und Lucin-Drop-out-Medium. Verschließen Sie den Block mit einer atmungsaktiven Versiegelung und inkubieren Sie ihn 36 Stunden lang bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Übertragen Sie am Morgen des neunten Tages 100 Mikroliter Kultur auf 500 Mikroliter YPDA-Medium in einem sterilisierten 96-Deep-Well-Block.

Mit einem atmungsaktiven Verschluss abdecken und bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 200 U/min drei bis fünf Stunden inkubieren. Nach drei bis fünf Stunden wird die Kultur wieder suspendiert und 125 Mikroliter aus jeder Vertiefung auf eine Spektralphotometerplatte übertragen. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern, um sicherzustellen, dass sie zwischen 0,3 und 0,6 liegt.

Zentrifugieren Sie die restlichen Zellen im Deep-Well-Block bei 3000 mal G und 21 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen. Geben Sie 200 Mikroliter Z-Puffer in jede Vertiefung und jeden Vortex.

Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 3000 g und 21 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen. Geben Sie 21 Mikroliter Z-Puffer in jede Vertiefung und jeden Vortex.

Decken Sie die Platte mit Siegelfolie ab, die gegen Frost-Tau-Zyklen beständig ist. Führen Sie in einem Abzug 4 Gefrier-/Auftauzyklen mit flüssigem Stickstoff und einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad durch. Geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete Z-Puffer-Beta-Mercaptoethanol-ONPG-Lösung in jede Vertiefung

Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für 17 bis 24 Stunden oder bis sich die Farbe entwickelt. Überprüfen Sie am Morgen des 10. Tages, ob sich die Farbe entwickelt hat. Geben Sie 110 Mikroliter eines molaren Natriumcarbonats in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen.

Notieren Sie die Zeit und wirbeln Sie die Platte. Zentrifugieren Sie bei 3000 mal G und 21 Grad Celsius für zehn Minuten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 125 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung auf eine Spektralphotometerplatte zu übertragen.

Messen Sie die optische Dichte bei 420 Nanometern. Berechnen Sie die Beta-Galactosidase-Aktivität in einer Tabellenkalkulation, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wurde die Promotorregion von 2600 Basenpaaren stromaufwärts vom Beginn der Transkriptionsstartstelle in sechs Regionen oder Fragmente segmentiert.

Dieses Foto ist ein Beispiel für eine gut gewachsene und positive Platte nach dem fünften Tag des Protokolls. In diesem repräsentativen Ergebnis zeigen die DNA-Fragmente eins und vier eine positive Interaktion mit dem Protein A- und B-Komplex. Bei der Messung der Beta-Golactisidase-Aktivität zeigt Fragment eins eine vierfache Induktion der Reportergenaktivität.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Verfahren empfohlen wird, um Informationen über DNA-Regionen erst nach der Bestätigung der vorgeschlagenen Protein-Protein-Interaktion zu erhalten, und nicht dazu gedacht ist, Informationen über Zielstellen zu liefern. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. Chip-Assay und Msar, vorgeformt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Zum Beispiel die Identifizierung der Zielstellen in vivo.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Rolle multimerer Proteinkomplexe, die an ein gemeinsames DNA-Ziel binden, testen und validieren können.