Name: Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die dopaminerge Homöostase bei Mäusen durch synaptosomale Dopamin-Aufnahme und HPLC-Analyse untersuchen. Diese Methoden ermöglichen die Bewertung von Dopamin-Transporter-Funktion und Gewebekonzentration.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die UCPH 2016 Program Of Excellence (UG, A.R, k.j.), die Lundbeck Foundation (m.r.) die Lundbeck-Stiftung Zentrum für Biomembranen in Nanomedizin (UG), die nationale Institute der Gesundheit Stipendien P01 DA 12408 (UG), die dänische Rat für unabhängige Forschung - medizinische Wissenschaften (UG).

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<li>Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+phasic+changes+in+extracellular+dopamine+concentration+in+freely+moving+rats+by+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry.</a> Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Manuskript beschreibt nützliche experimentelle Protokolle um DA Homöostase in jeder Maus-Modell der Wahl abzugrenzen. Wir bieten ausführliche Protokolle für Messhöhen DA im Gehirngewebe von Mäusen mit HPLC und synaptosomal DA Aufnahme um zu beurteilen, funktionale DA Transport durch DAT. Verfahren, Protokolle und Grenzwerte für die HPLC-Experiment und synaptosomal DA Aufnahme Assay werden unten ausgearbeitet.
Die synaptosomal Aufnahme Protokoll bieten nützliche Einblicke in die Funktion...

Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter für motor Verhalten, Belohnung und kognitive Funktion1,7,8,9von entscheidender Bedeutung. Ungleichgewichte in DA Homöostase sind in mehreren neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung, Drogensucht, Depressionen und Parkinson-Erkrankung1verwickelt. DA erscheint aus der präsynaptischen Neuron in den synaptischen Spalt, wo er bindet an und aktiviert Rezeptoren auf der Prä- und postsynaptischen Membran, dadurch weiter vermitteln das Signal. Das Niveau der DA in der Synapse nach Veröffentlichung räumlich und zeitlich gesteuert DAT3,10. Der Transporter Sequester DA aus dem extrazellulären Raum und trägt somit physiologische DA Level3,11. Genetischer Entfernung von DAT bei Mäusen verursacht einen Hyperdopaminergic Phänotyp gekennzeichnet durch erhöhte synaptische DA, Abbau der intrazellulären DA Pools und tief greifende Veränderungen im postsynaptischen DAergic Signalisierung10,12.
Hier zwei getrennte Protokolle werden vorgestellt, eine Methode zu messen DA Gewebe Inhalten und anderen zu beurteilen, die Funktionalität der DAT.-kombinierte mit der Oberfläche Biotinylierungen Assay von Gabriel Et Al.13 beschrieben diese beiden Methoden geben Auskunft über DA Inhalte und funktionalen Ebenen der DAT für eine gründliche Bewertung der DA Homöostase. Mit diesen Methoden kann DA Homöostase der verschiedenen transgenen Mäusen oder Krankheitsmodelle charakterisiert und beschrieben werden. Diese Werkzeuge wurden implementiert und optimiert und sind standard in unseren Labors. Aktuelle Tests dienten dazu, die Konsequenzen auf die DA Homöostase der Änderung der C-terminalen DAT14 oder mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase unter die Tyrosin-Hydroxylase (TH) Veranstalter 5zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>COMT-Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich, Deutschland</td><td>RO-41-0960</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>[3H]-Dopamin</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA</td><td>NET67-3001MC</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>Glasmikrofaserfilter</td><td>GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire</td><td>1822-024</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>HiSafe Szintillationsflüssigkeit</td><td>Perkin Elmer</td><td>1200-437</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>MicroBeta2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>23225</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Life Science</td><td>S7903</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>S3014</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Life Science</td><td>P9541</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck KGaA</td><td>10043-52-4</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Life Science</td><td>63065</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Life Science</td><td>A0278</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G7021</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>Pargyline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-8013</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td></tr><tr><td>Desipramin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3900</td><td>Für die synaptosomale DA-Aufnahme Protokoll</td></tr><tr><td>Dopamin</td><td>Sigma Life Science</td><td>H8502</td><td>Für synaptosomale DA-Aufnahmeprotokolle</td></tr><tr><td>Cocain</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5776</td><td>Für synaptosomale DA-Aufnahmeprotokolle</td></tr><tr><td>Gehirnmatrix-ASI-Instrumente</td><td>RBM2000C</td><td>Für synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll</td><td></td></tr><tr><td>Cafano mechanischer Teflon-Disruptor</td><td>Buch & Holm</td><td>Eingestellt</td><td>Für das synaptosomale DA-Aufnahmeprotokoll (Homogenisierung)</td></tr><tr><td>Antec Decade (amperometrischer Detektor)</td><td>Antec, Leiden, Niederlande</td><td>Eingestellt: neues Modell DECADE Elite / Lite&Trade; Elektrochemischer Detektor Typ 175 und 176</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Avantec 0,22 &mu; m Glasfilter</td><td>Frisenette ApS, Dänemark</td><td>13CP020AS</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Säule: Prodigy 3 &mu; ODS-3 C18</td><td>Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Deutschland</td><td>Teilenummer: 00A-3300-E0</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>LC-Lösungssoftware</td><td>Shimadzu</td><td>LabSolutions Series Workstation</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Perchlorsäure 0,1 M</td><td>Fluka Analytical</td><td>35418-500 ml</td><td>Für HPLC-Protokoll (Gewebevorbereitung)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-50g</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphar</td><td>Bie& Berntsen</td><td>1.06346 1000g</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Natrium-1-Octansulfonat-Monohydrat</td><td>Aldrich</td><td>74885 -10g</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Acetonitril, isokratische HPLC-Qualität</td><td>Scharlau</td><td>AC03402500</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Filtre 0,22um</td><td>Frisenette ApS, Dänemark</td><td>Avantec 13CP020AS</td><td>Für HPLC-Protokoll (Gewebevorbereitung)</td></tr><tr><td>ortho-Phosphorsäure 85%</td><td>Merck</td><td>1.00563. 1000ml</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr><tr><td>Elektrode</td><td>Antec, Leiden, Niederlande</td><td>AN1161300</td><td>Für HPLC-Protokoll (siehe Handbuch online)</td></tr><tr><td>Detektorprogramm auf dem elektrochemischen Detektor DECADE II</td><td>Antec, Leiden, Niederlande</td><td>Lite&Handel; Elektrochemischer Detektor Typ 175 und 176</td><td>Für HPLC-Protokoll</td></tr></tbody></table>

bewertung der dopaminergen homöostase bei mäusen durch verwendung von high-performance liquid chromatography analyse und synaptosomal dopamin-aufnahme

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter, die Steuerung der Motorik, Belohnung Prozesse und kognitive Funktion. Wertminderung (DAergic) dopaminergen Neurotransmission ist stark verbunden mit mehreren zentralen Nervensystems-assoziierten Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Aufmerksamkeit-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung und Drogensucht1,2 ,3,4. Abgrenzung von Krankheitsmechanismen, bei denen DA Ungleichgewicht hängt entscheidend von Tiermodellen, Aspekte der Krankheiten imitieren und somit Protokolle, die bestimmte Teile der DA Homöostase zu beurteilen sind wichtig, damit die neue Einblicke und mögliche therapeutische Ziele für diese Krankheiten.
Hier präsentieren wir zwei nützliche experimentelle Protokolle, die in Kombination bieten eine funktionale Auslesung des DAergic Systems bei Mäusen. Biochemische und funktionelle Parameter auf DA Homöostase werden durch Bewertung der DA Ebenen und Dopamin-Transporter (DAT) Funktionalität5gewonnen. Bei der Untersuchung von DA-System ist die Fähigkeit, zuverlässig endogenen DA von Erwachsenen Gehirn messen unerlässlich. Deshalb präsentieren wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ausführen auf Gehirngewebe von Mäusen zu ermitteln der DA. Wir führen das Experiment auf Gewebe aus dorsalen Striatum (dStr) und Nucleus Accumbens (NAc), aber die Methode ist auch geeignet für andere DA innerviert Hirnareale.
DAT ist essentiell für Reuptake von DA in die präsynaptischen Terminal, dadurch Steuerung der zeitlichen und räumlichen Aktivität von freigegebenen DA. Zu wissen, die Ebenen und die Funktionalität der DAT im Striatum ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung DA Homöostase. Hier bieten wir ein Protokoll, das ermöglicht, gleichzeitig Informationen über Ebenen Oberfläche und Funktion mit einem synaptosomal6 DA Aufnahme Assay abzuleiten.
Aktuelle Methoden in Verbindung mit standard Immunoblotting Protokolle geben die Forscher mit entsprechenden Tools zur Charakterisierung des DAergic-Systems.

Aktuelle DA Aufnahme Protokoll (Abbildung 1) beinhaltet alle notwendigen Schritte, um die Funktionalität der DAT in Synaptosomes von Mäusen zu beurteilen. Unsere repräsentativen Daten DA Aufnahme Methode (Abbildung 2) zeigt eine Sättigungskurve mit unbereinigten Daten (Abb. 2 b) und Daten (Abbildung 2A). Der Sättigungskurve zeigt Aufnahme von Wildtyp-Mäusen. In der Regel...

Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

In diesem Protokoll stellen wir zwei Techniken vor. Das Ziel der ersten besteht darin, die Funktion des Dopamintransporters durch die Messung der Dopaminaufnahme aus synaptosomalen Präparationen zu beurteilen. Die zweite dient der Bestimmung der Dopaminkonzentrationen im Gewebe mittels HPLC-Analyse.Diese Methoden liefern wichtige Parameter der Dopamin-Homöostase, indem sie zeigen, wie der Dopamingehalt im Gewebe gemessen und die Funktionalität des Dopamintransporters bei Mäusen bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie nach in-vivo-Manipulationen durchgeführt werden können, wie beispielsweise chemogenetische Eingriffe, in-vivo-Behandlungen mit Wirkstoffen oder Verhaltensschulung der Tiere. Die HPLC-Methode wird Pia Weikop, außerordentliche Professorin am Labor für Neuropsychiatrie, demonstrieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie den Schädel frei, indem Sie die Haut schneiden und überschüssiges Gewebe entfernen. Schneiden Sie anschließend den Schädel entlang der Sagittalfuge vollständig bis nach anterior. Führen Sie die Scherenspitzen in die Augen ein und entfernen Sie den verbleibenden Schädel, indem Sie durch diesen hindurchschneiden.

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Ein Protokoll zur Durchführung einseitige 6-OHDA Läsionen der mediale Vorderhirnbündel in Mäusen beschrieben. Dieses Verfahren hat eine niedrige Mortalitätsrate (13,3%) mit 89% der überlebenden Tiere mit&gt; 95% Verlust von striatalen Dopamin und 90,63 ± -4,02% ipsiversive Drehvorspannung nach der Seite der Läsion.

Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

Der amperometrische Technik misst Dopamin-Freisetzung aus einer einzelnen Zelle durch Detektieren der aktuellen durch spontane oxidative Dopamin Oxidation produziert. Gleichzeitige Voltage-Clamp und Amperometrie Methodik zeigen die mechanistische Beziehung zwischen der Gesamt-Wertung "Aktivität" Dopamin-Transporter und die regulatorische Rolle dieser Aktivität auf den Rücktransport von Dopamin.

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dieses Video zeigt die Bewertung der Dopaminaufnahme in Synaptosomen, die aus Mäusegehirnen gewonnen wurden. Es werden Schritte zur Vorbereitung von Synaptosomen auf die Dopaminaufnahme über Dopamintransporter, zur Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von radioaktiv markiertem Dopamin, zur Isolierung der Synaptosomen und zur Messung der Radioaktivität zur Quantifizierung der Dopaminaufnahme beschrieben.

Messung der Dopaminaufnahme in Synaptosomen des Gehirns von Mäusen mit radioaktiv markiertem Dopamin

Bei der Parkinson-Erkrankung und Bewegungsstörungen in der Regel sind empfindlich und zuverlässig Verhaltensstörungen Assays die zum Testen neue potentielle Therapeutika. Hier beschreiben wir eine überschaubare Batterie sensomotorische Tests bei Mäusen, die empfindlich auf unterschiedlichem Grad der Schädigung des nigrostriatalen und nützlich für präklinische Studien sind.

Beurteilung der Sensomotorik in Maus-Modellen der Parkinson-Krankheit

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu...

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Lipoxygenase (LOX) Isozyme können Produkte erzeugen, die Neuroinflammation und Neurodegeneration erhöhen oder verringern können. Eine Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie konnte LOX-isozymespezifische Effekte identifizieren. Die Verwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-Modells der Nigrostriatalschäden in zwei LOX-Isozymen-defizienten transgenen Linien ermöglicht einen Vergleich des Beitrags von LOX-Isozymen zur dopaminergen Integrität und Entzündung.

Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit

Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.

Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster

Wir präsentieren eine bequeme Festphasen-Extraktion gekoppelt an Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit elektrochemischen Detektion (ECD) für die gleichzeitige Bestimmung von drei Monoamin-Neurotransmittern und zwei ihrer Metaboliten im Urin von Säuglingen. Wir erkennen auch der Metabolit MHPG als potenzielle Biomarker für die Früherkennung von Schädigungen des Gehirns für Kleinkinder.

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Erfahren Sie, wie Sie die dopaminerge Homöostase bei Mäusen durch synaptosomale Dopamin-Aufnahme und HPLC-Analyse untersuchen. Diese Methoden ermöglichen die Bewertung von Dopamin-Transporter-Funktion und Gewebekonzentration.

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme (Video) | JoVE Journal

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

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