Name: Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines elektrochemischen mikrofluidischen Biosensors mit Trockenfilm-Photoresist-Technologie für Point-of-Care-Tests. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die sensitive Quantifizierung verschiedener Analyte.

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Die Autoren möchte der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die teilweise Finanzierung dieser Arbeit unter Grant Zahlen UR 70/10-01 und UR 70/12-01.

1. Herstellung von mikrofluidischen Biosensor verwenden DFR Technologie <ol><li>Vorbereitung der PI Wafer.
	<ol><li>Schnitt ein PI Substrat in 6 - In Runde Waffeln. Setzen den PI-Wafer in einem Ofen bei 120 ° C für etwa 1 h für eine Austrocknung backen.</li>
	</ol></li> <li>Photolithographie zunächst für den Lift-off-Prozess.
	<ol><li>Programm der Spin Coater auf eine 30-s Spinnerei Zeit bei 3.000 u/min, bei einer Beschleunigung von 2.000 u/min/s. Ort der PI-Wafer auf der Spin Coater und befestigen, Anlegen eines Vakuums. 2 mL einer Resist, ermöglichen die Lift-off, zu verzichten und das Spin Coater-Programm starten. Entfernen Sie die Wafer aus der Spin Coater und Soft-backen den PI-Wafer auf einer heißen Platte für 2 min bei 100 ° c</li>
		<li>Stellen Sie die gewünschte Maske für die Strukturierung der Elektroden auf die PI-Wafer mit bloßem Auge und setzen Sie es 400 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm). Ort der Wafer in einer Schüssel mit einem Resist-matching-Entwickler auf einem Orbitalschüttler gefüllt und lassen Sie es Schütteln leicht für 1 min.</li>
		<li>Nach dem Entfernen der überschüssigen Resist verwenden eine Dusche auf den PI-Wafer mit entionisiertem Wasser (VE-Wasser) auf einer nassen Bank spülen und trocknen Sie es anschließend mit Druckluft.</li>
	</ol></li> <li>Ablagerung von Platin für die Bildung der Elektroden.
	<ol><li>Verwenden eine standard körperliche Dampf-Abscheidung auf Kaution 200 nm von Platin auf den Wafer 19.</li>
		<li>Den Wafer in eine Schüssel legen. Geben Sie die passenden Entferner in die Schüssel und entfernen Sie der Lift-off-Resist unter leicht schütteln des Wafers auf einem Orbitalschüttler, bis alle überschüssigen Platin entfernt wird. Spülen und trocknen den PI-Wafer, wie unter Schritt 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Zweiten Photolithographie Schritt: bilden die Isolationsschicht.
	<ol><li>Setzen den PI-Wafer in einem Ofen auf 120 ° C für 5 min zu it. dehydrieren vorgewärmt</li>
		<li>Programm der erste Schritt von einem Spin Coater, 5 s der Zeit bei 500 u/min drehen. Programmieren Sie den zweiten Schritt für 30 s bei 4.000 u/min, bei einer Beschleunigung von 700 u/min/s.</li>
		<li>Den PI-Wafer auf der Spin Coater und befestigen, Anlegen eines Vakuums. 4 mL einer entsprechenden Epoxy-basierte Photoresist vor dem Spin Coater Programmstart zu verzichten.</li>
		<li>Soft-Backen der beschichteten Wafer für 3 min bei 95 ° C auf einer heißen Platte.</li>
		<li>Stellen Sie die Maske für die Dämmschicht auf dem Wafer mit den jeweiligen Ausrichtungsmarken und ein Okular. Aussetzen den Wafer zu 100 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm).</li>
		<li>Für eine Post-Exposition Backen legen die Wafer auf einer vorgeheizten Herdplatte für 2 min bei 95 ° c</li>
		<li>Legen den Wafer in eine Schüssel geben und mit einem geeigneten Entwickler (z. B. 1-Methoxy-2-Propyl-Acetat für 2 min bei SU-8) auf einem Orbitalschüttler entwickeln.</li>
		<li>Den PI-Wafer zunächst mit Isopropanol abspülen und dann spülen und trocknen wie unter Schritt 1.2.3.</li>
		<li>Hard-Backen der Fotolack in einem Ofen für 3 h bei 150 ° c</li>
	</ol></li> <li>Plasmaunterstützte Reinigung der Elektroden.
	<ol><li>Die Photoresist-Rückstände zu entfernen, verwenden Sie Sauerstoffplasma mit einem standard-Plasma-Gerät. Starten Sie das Reinigungsprogramm mit 200-W-Niederfrequenz macht mit 100 % O 2 fließen, eine Rate von 250 Sccm und einer Gesamtzeit von 3 min.</li>
		<li>Legen Sie den PI-Wafer in der Plasmakammer, beheben die Wafer auf der geerdeten Platte mit Glasdeckel und starten das Plasmaverfahren.</li>
	</ol></li> <li>Silber und Silberchlorid Ablagerung: schaffen die auf dem Chip Bezugselektrode.
	<ol><li>Passivierungsschicht Platin Kontakt Pads von der Wafer mit einem Klebeband UV-empfindlich. Die Folie 5 mm Breite und 11 cm lange Streifen geschnitten und bringen Sie sie auf den Wafer, schützt die Teile nicht mit Silber hinterlegt werden.</li>
		<li>Für die silberne Abscheidung einen Laborabzug sonic Badewanne (35 kHz) hineingesteckt und legen Sie einen Behälter mit Silber Elektrolyt-Lösung (100 g/L Ag, pH 12,5) in das Bad. Das sonic Bad auf Raumtemperatur und der Leistung auf 10 % festgelegt. 
		Achtung: Silber Elektrolytlösungen sind sehr giftig und sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Die Dämpfe sollten nicht eingeatmet werden.</li>
		<li>Schließen Sie den Masse-Kontakt der Referenzelektroden an eine Konstantstromquelle. Schließen Sie die Gegenelektrode ein Silberdraht, die in der silbernen Elektrolytlösung an die Stromquelle mit standard Verbindungskabel eingetaucht ist.</li>
		<li>Setzen die Stromquelle DC und eine Stromdichte von -4,5 mA/cm 2, wodurch in einer silbernen Abscheiderate von etwa 0,3 µm/min starten die sonic Bad und lassen Sie die Stromquelle für 10 min. Spülen der Wafer mit VE-Wasser laufen</li>
		<li>Für die Chlorierung der Bezugselektrode, stecken Sie ein Schiff von 0,1 M Kaliumchlorid (KCl) Lösung der sonic Bad. Schließen Sie den Masse-Kontakt der Wafer und eine Platin-Elektrode, die in der KCl-Lösung mit der Konstantstromquelle eingetaucht ist.</li>
		<li>Setzen die Stromquelle DC und eine Stromdichte von 0,6 mA/cm 2, wodurch eine Abscheiderate von ca. 0,075 µm/min starten die sonic Bad und lassen Sie die Stromquelle für 7,5 min. laufen</li>
		<li>Nachspülen und Trocknen der PI wafer, wie unter Schritt 1.2.3.</li>
		<li>Entfernen Sie das UV-Sensitive-Band nach einer UV (365 nm) Exposition von 300 mJ/cm 2 und spülen und Trocknen der PI-Wafer, wieder wie beschrieben Schritt 1.2.3.</li>
	</ol></li> <li>Dritten Photolithographie Schritt: Verwendung von DFRs mikrofluidische Kanäle erstellen.
	<ol><li>Schneiden Sie die benötigten DFR-Schichten auf eine Größe ähnlich dem des Wafers (20 x 20 cm 2). Beheben Sie die gewünschte Maske auf die Belichtungseinheit zu und richten Sie die DFR-Schicht auf die Maske mit dem bloßen Auge. Beleuchten mit 250 mJ/cm 2 UV-Licht (365 nm).</li>
		<li>Entfernen Sie die Schutzfolie von der Fotolack und entwickeln der Resist für etwa 2 min (abhängig von den Strukturen) in einer 1 % Natriumcarbonat (Na 2 CO 3) Lösung mit einem standard sonic Bad (35 kHz) auf 42 ° C und einer Klanggewalt vorgewärmt von 100 %. Um die Reaktion sofort zu stoppen, Schütteln des Resists für 1 min in einem 1 % HCl Bad auf einem Orbitalschüttler. Spülen und trocknen jede DFR-Schicht, wie unter Schritt 1.2.3. 
		Hinweis: Insgesamt vier DFR Schichten verarbeitet werden müssen wie in Schritt 1.7 erwähnt: ein Kanal-Ebene, einer Decklage und Rückseite zweilagig (verhindert, dass der Biosensor Biegung am Ende).</li>
	</ol></li> <li>Kaschierung von DFR "layers" auf dem Substrat PI.
	<ol><li>PI-Wafer auf eine Transparenz-Overhead-Folie und befestigen es mit standard Klebeband. Passen Sie die Kanalschicht DFR auf dem PI-Wafer unter dem Mikroskop, Nutzung der jeweiligen Ausrichtung Strukturen.</li>
		<li>Für die Laminierung, verwenden Sie einen standard heißen Roll Laminator und Heizen Sie die Oberwalze auf 100 ° C und der unteren Rolle bis 60 ° c Stellen Sie den Druck bis 3 Bar, mit einer Vorwärtsgeschwindigkeit von 0,3 m/min statt den Wafer mit festen DFR-Schicht in der Mitte das Laminiergerät und Starten Sie es; der DFR wird durch das Gerät geschoben. Wiederholen Sie den Schritt nach der Wafer um 180° drehen.</li>
		<li>Um zu verhindern, die Biegung der Biosensor, Laminat die beiden entwickelten Rückseite Schichten auf dem Wafer, die folgenden Schritte 1.8.1-1.8.2.</li>
	</ol></li> <li>Mit hydrophoben anhalten Barriere und Abdichtung des Chips.
	<ol><li>Entfernen legen die Schutzschicht von der Vorderseite des DFR-Kanalsäh indem standard Klebeband an einem Ende des DFR und nach oben herausziehen. Verwenden Sie einen Hand Dispenser mit 0,004-in Tuben um kleine Tröpfchen von gelösten Polytetrafluorethylen in die Vertiefungen der Isolierungsschicht zu verzichten. Um der Mikrofluidik-Chip zu versiegeln, Laminat DFR Deckschicht auf der Kanal-Ebene, wie in Schritt 1,8 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>Hard-Backen der mikrofluidischen Biosensor.
	<ol><li>Entfernen Sie alle schützende Folien auf dem Cover und Rückseite DFR Schichten. Schneiden Sie die Biosensoren in Streifen mit einer gewöhnlichen Schere. Heilen die Chips im Backofen bei 160 ° C für 3 h</li>
	</ol></li></ol> 2. Immobilisierung Testverfahren auf dem Chip <ol><li>Adsorption von Avidin im Bereich Immobilisierung des Kanals.
	<ol><li>Bereiten die 100 µg/mL Avidin Lösung in 10 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Verzichten 2 µL der Avidin-Lösung auf den Einlass der Biosensor. 
		Hinweis: Der Kanal durch Kapillarkräfte gefüllt, bis die Flüssigkeit die hydrophoben anhalten Barriere erreicht.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die fluidische hält Halt an der Barriere während der ganzen Inkubationszeit 2 µL VE-Wasser am Ausgang des Chips verzichten. Den Chip bei 25 ° C für 1 h in einem geschlossenen Behälter inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssige Reagenzien durch den Einlass des Chips durch Anlegen eines Vakuums. Waschen Sie den Kanal mit 50 µL Waschpuffer (PBS mit 0,05 % Tween 20), verzichtet auf die Steckdose während das Vakuum angewendet wird. Trocknen Sie den Kanal für 30 s, während das Vakuum angewendet wird.</li>
	</ol></li> <li>Blockieren die Kanal-Oberfläche, um unspezifische Bindung hemmen.
	<ol><li>Bereiten die Lösung 1 % Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Pipette 2 µL der 1 % BSA Lösung auf den Einlass und 2 µL VE-Wasser am Ausgang des Kanals. Inkubieren Sie den Chip bei 25 ° C für 1 h in einem geschlossenen Behälter. Entfernen Sie überschüssige Reagenzien und den Kanal zu trocknen, wie unter Schritt 2.1.4.</li>
	</ol></li> <li>Inkubation von DNA Oligos beschriftet mit Biotin und 6-FAM.
	<ol><li>Bereiten verschiedene Konzentrationen (0,001 bis 5 µM) der DNA-Lösung in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Verzichten 2 µL von einer Konzentration der DNA-Lösung am Einlass und 2 µL VE-Wasser am Ausgang. Den Chip bei 25 ° C für 15 min in einem geschlossenen Behälter inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 für die anderen DNA-Konzentrationen mit zusätzlichen Biosensor Chips.</li>
		<li>Entfernen überschüssige Reagenzien und trocknen Sie den Kanal, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben.</li>
	</ol></li> <li>6-FAM-Antikörper mit der Bezeichnung der Immobilisierung von GOx.
	<ol><li>Formulieren eine 5 µg/mL Konzentration von 6-FAM-Antikörpern in 10 mM PBS bei einem pH-Wert von 7,4.</li>
		<li>Einführen 2 µL der Antikörper-Lösung für den Einlass und 2 µL VE-Wasser an den Auslass des Kanals. Inkubieren Sie die beschriftete Antikörper bei 25 ° C für 15 min in einem geschlossenen Behälter. Entfernen Sie überschüssige Reagenzien, wie unter Schritt 2.1.4.</li>
	</ol></li></ol> 3. Konduktometrische Signal Erkennung mit Hilfe der Stop-Flow-Technik <ol><li>Vorbereitung der Substrat-Lösung zur elektrochemischen Detektion.
	<ol><li>Formulieren eine 40 mM Glukoselösung in 0,1 M PBS bei einem pH-Wert von 7,4 in Reinstwasser.</li>
		<li>Für die Vorbehandlung, bereiten Sie eine 0,1 M PBS-Lösung bei einem pH-Wert von 7,4 in Reinstwasser.</li>
	</ol></li> <li>Vorbehandlung der Elektroden arbeiten.
	<ol><li>Benutzen Sie den maßgeschneiderten Chip-Halter ermöglicht die einfache Platzierung des Chips und fluidische und elektrische Verbindung.</li>
		<li>Elektrisch verbinden der Biosensor zu dem Potentiostaten. Die fluidischen Kontakt des mikrofluidischen Kanals über eine Spritzenpumpe bis das Reagenz Reservoir mit maßgeschneiderten Adapter und Schläuche zu gewährleisten. Starten Sie das Notebook, das mit dem Potentiostaten verbunden ist und starten Sie die Spritze Pumpensteuerung, Steuerung durch den Chip fluidische.</li>
		<li>Die Spritzenpumpe manuell, mit 0,1 M PBS bei einer Durchflussmenge von 20 µL/min starten. An der Arbeitselektrode gegen die auf dem Chip Bezugselektrode, gelten eine Wechselspannung von 0,8 und -0,05 V für 5 s 30 Zyklen. Im Anschluss daran, oxidieren die Arbeitselektrode durch Anlegen einer Spannung von 0,8 V 60 s.</li>
	</ol></li> <li>Assay auslesen mit Hilfe der Stop-Flow Technik.
	<ol><li>Die Assay-Signal-Anzeige starten, warten, bis das aktuelle Messsignal stabilisiert. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und wechseln Sie das Reagenz von 0,1 M PBS, die 40-mM Glukoselösung und starten Sie die Software auf die Spritze Pumpe Controller; Es stoppt automatisch den Fluss für 1, 2 oder 5 min und startet dann den Fluss wieder. Beobachten, die sich daraus ergebenden Spitzenstrom. 
		Hinweis: Für die Analyse der Daten, die Stromspitze oder die Ladung des Peaks kann berücksichtigt werden, wie beschrieben in das Modell ein elektrochemisches Signal auslesen ( Abbildung 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll für die Herstellung von einem mikrofluidischen elektrochemische Biosensor hier vorgestellten ermöglicht die Entwicklung einer Low-Cost, kompakt und einfach zu bedienende Plattform für die Erkennung von Biomolekülen. Abhängig von der Test anschließend auf der Biosensor verwendet können mehrere verschiedene Biomarker erkannt werden. Dies macht die Plattform sehr vielseitig und bietet breite Zugriff auf verschiedene Anwendungsbereiche von standard-diagnostische Tests (z. B. das Vorhandensein von besti...

In den letzten zwei Jahrzehnten sind diagnostische Anwendungen für eingehende Studien über die Entwicklung der globalen öffentlichen Gesundheit elementar geworden. Traditionell werden Labor-Diagnose-Tools zur Erkennung von Krankheiten verwendet. Obwohl sie nach wie vor eine wichtige Rolle bei der Diagnose von Krankheiten spielen, Point-of-Care testing (POCT) durchgeführt, in der Nähe des Patienten oder durch den Patienten selbst in den letzten Jahren mehr und mehr alltäglich geworden. Vor allem in solchen Fällen, die eine sofortige Behandlung, wie akutem Myokardinfarkt oder Diabeteskontrolle, erfordern unbedingt die rasche Bestätigung der klinischen Befund. Daher gibt es ein wachsender Bedarf für POCT-Geräte, die von Laien bedient werden und sind gleichzeitig in der Lage präzise in-vitro- diagnostische Tests in kurzer Zeit1,2,3,4 .
Auf dem Gebiet der POCT haben bereits bemerkenswerte Verbesserungen erzielt werden. Allerdings gibt es noch viele Herausforderungen zu überwinden,5,6,7,8. Für POCT Plattform erfolgreich auf den Markt gebracht werden und mit Labordiagnostik wettbewerbsfähig zu sein, muss das Gerät streng die folgenden Anforderungen erfüllen: (i) liefern präzise und quantitative Testergebnisse, die mit Labor übereinstimmen Ergebnisse; (Ii) haben Sie kurze Beispielergebnis Zeiten, ermöglicht die sofortige Behandlung des Patienten; (Iii) verfügen über unkomplizierte und einfache Handhabung, auch wenn von ungeschulten Personen betrieben, und minimale Benutzereingriffe erfordern; und (iv) bestehen aus einer kostengünstigen Sensoreinheit für Einweg-Anwendungen konzipiert. Darüber hinaus sind Ausrüstung-kostenlose Diagnose günstig, vor allem in ressourcenarmen Umgebungen3,4,6.
Durch diese strengen Anforderungen haben nur zwei POCT-Systeme basierend auf elektrochemischen Detektion (z. B. Blutzuckerteststreifen) und lateral Flow Immunoassays (z. B. Schwangerschaftstests) erfolgreich auf dem Markt so eingeführt weit. Beide Systeme leiden jedoch Nachteile, wie schlechte Leistung (z. B. Blutzucker-monitoring hat ungenaue Testergebnisse und lateral Flow Assays liefern nur qualitative (positiv oder negativ) Messergebnisse)4, 6. Diese Nachteile herkömmlicher POCT-Systeme führten zu einer steigenden Nachfrage auf die Erforschung neuer Technologies, die schnelle, kostengünstige und quantitative Erfassung am Point of Care4,5anbieten.
Um diese Herausforderungen POCT-Geräte zu erfüllen, ist DFR Technologie vor kurzem für die Herstellung von Einweg- und kostengünstige Biosensoren9,10,11,12, beschäftigt 13 , 14. im Vergleich zu weich und flüssig lithografischen Materialien, wie z. B. PDMS oder SU-8, DFRs präsentieren viele Vorteile: sie (i) sind erhältlich in einer Vielzahl von Kompositionen und stärken (von wenigen µm bis mehrere Millimeter); (Ii) haben Sie eine sehr raue Oberfläche, die Haftung auf verschiedenen Materialien erleichtert; (Iii) Feature ausgezeichnete Dicke Gleichförmigkeit; (iv) bieten Sie billige, einfache und Hochdurchsatz-Fertigung für die Massenproduktion; (V) sind leicht mit verschiedenen kostengünstigen Tools, wie eine einfache Schere schneiden; und (vi) für die Erstellung von dreidimensionalen Strukturen, z. B. mikrofluidische Kanäle ermöglichen durch mehrere DFR Schichten übereinander stapeln.
Auf der anderen Seite haben DFRs im Allgemeinen eine relativ schlechte Auflösung im Vergleich zu flüssigen Photoresists, hervorgerufen vor allem durch die Schichtdicke und der erhöhten Abstand zwischen der Maske und der DFR aufgrund der Schutzfolie, die zusätzlich Licht ermöglicht Streuung. Dennoch sind für die Fertigung von integrierten mikrofluidischen Biosensoren, DFRs bestens geeignet für die kostengünstige Massenproduktion.
Deshalb arbeiten wir in diesem vorliegenden die Herstellung und Anwendung von einem elektrochemischen mikrofluidischen DFR-basierten Biosensor. Das ausführliche Protokoll beschreibt jeden Produktionsschritt der Biosensor-Plattform, die auf dem Chip Immobilisierung von einem DNA-basierte Modell-Assay und seinen elektrochemischen auslesen mit Hilfe der Stop-Flow-Technik. Dieses universelle Plattform ermöglicht die Erkennung von zahlreichen Arten von Biomolekülen, mit verschiedenen Assay-Technologien (z. B. Genomik, Cellomics und Proteomics) oder Assay-Formate (z.B. Wettbewerb, Sandwich, oder direkt). Basierend auf einer DFR Plattform, zeigte unsere Fraktion zuvor erfolgreich die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten, einschließlich Antibiotika13,15,16 (Tetracyclin, pristinamycinresistente, und ß-Lactam-Antibiotika), Troponin ich17und Substanz P18.

<table><tbody><tr><td><stark>Material</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>AP8525R</td><td>Wird als Polyimidsubstrat</td></tr><tr><td>verwendet MA-N 1420</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MA-N1420</td><td>Lift-off resit zur Definition der Platinabscheidung</td></tr><tr><td>Ma-D 533s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaD533S</td><td>Entwickler für MA-N1420</td></tr><tr><td>Platin</td><td>-</td><td>-</td><td>Material Elektroden und Kontaktpad</td></tr><tr><td>Ma-R 404s</td><td>Micro Resist Technology</td><td>MaR404S</td><td>Entferner für MA-N1420</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8-3005</td><td>Fotolack zur Definition des Elektrodenbereichs und als Isolierung</td></tr><tr><td>1-Methoxy-2-propanolacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-65-6</td><td>Entwickler für SU-8 3005</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>8.18766.2500</td><td>Entfernen des SU-8 Entwickler</td></tr><tr><td>1020R</td><td>Ultron Systems Inc.</td><td>1020R</td><td>UV-empfindliches Klebeband zum Schutz von Kontaktpads</td></tr><tr><td>Arguna S</td><td>Degussa</td><td>1935</td><td>Für die Silberabscheidung auf der Referenzelektrode</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Methrom</td><td>62308.020</td><td>Für die Chloridierung der Silber-Referenzelektrode</td></tr><tr><td>Pyralux</td><td>DuPont</td><td>PC1025</td><td>Trockenfilm-Fotolack</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>Fluka</td><td>71352</td><td>Entwickler für Pyralux PC1025</td></tr><tr><td>Chlorwasserstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30720</td><td>Um die Entwicklung des DFR</td></tr><tr><td>Teflon AF 1600</td> zu toppen <td>DuPont</td><td>AF1600</td><td>Für den Einsatz der Bremsbarriere</td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PA104</td><td>Mega</td><td></td> <td>Electronics-Bubble Ätztank</td></tr><tr><td>FED 53</td><td>Binder</td><td>9010-0018</td><td>Ofen</td></tr><tr><td>SPIN150</td><td>APT-Spin</td><td></td> <td>Coater</td></tr><tr><td>Pr&auml; zitherm</td><td>Harry Gestigkeit GmbH</td><td>PZ 28-2</td><td>Heizplatte</td></tr><tr><td>Hellas</td><td>Bungard Elektronik</td><td>40000</td><td>Belichtungseinheit</td></tr><tr><td>Tetra30-LF-PC</td><td>Diener-Plasmaanlage</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Univex 500</td><td>Leybold-Physikalische</td><td></td> <td>Gasphasenabscheidungsanlage Schüttler</td></tr><tr><td>S4</td><td>ELMI-Orbitalschüttler</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sonorex Super 10 P</td><td>Bandelin</td><td>783</td><td>Schallbad</td></tr><tr><td>6221 DC und AC</td><td>Keithley-Stromquelle</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>HRL 350</td><td>Ozatec-Laminiereinheit</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Vakuumstift</td><td>EFD-Vakuumstift</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

trockenen film photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen biosensor plattform: gerät fertigung, on-chip-test vorbereitung und systembetrieb

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In den letzten Jahren wurde die Biomarker-Diagnose ein unverzichtbares Werkzeug für die Diagnose der Krankheit beim Menschen, vor allem für die Point-of-Care-Diagnostik. Eine einfach zu bedienende und kostengünstige Sensorplattform ist sehr erwünscht, um verschiedene Arten von Analyten (z. B. Biomarker, Hormonen und Medikamenten) quantitativ und speziell zu messen. Aus diesem Grund wurde trockenen Film Photoresist Technologie - billig, oberflächlich und Hochdurchsatz-Fertigung - die hier vorgestellten mikrofluidischen Biosensor Herstellung verwendet. Abhängig von der Bioassay anschließend verwendet ist die vielseitige Plattform in der Lage, verschiedene Arten von Biomolekülen zu erkennen. Für die Herstellung des Geräts sind Platin-Elektroden auf eine flexible Polyimid (PI) Folie im Prozessschritt nur Reinraum-strukturiert. Die PI-Folie dient als Substrat für die Elektroden, die mit einem Epoxy-basierte Photoresist isoliert sind. Der Mikrofluidik-Kanal wird später durch die Entwicklung und Kaschierung von trockenen Film Fotolack (DFR) Folien auf die PI-Wafer erzeugt. Mithilfe einer hydrophoben anhalten Barriere im Kanal der Kanal ist aufgeteilt in zwei Bereiche: eine Immobilisierung Abschnitt für die Enzym-linked-Assay und eine elektrochemische Messzelle für die konduktometrische Signal Anzeige.
Die auf dem Chip Bioassay Immobilisierung erfolgt durch die Adsorption von Biomolekülen, die Kanal-Oberfläche. Die Glukose-Oxidase-Enzym dient als ein Wandler für elektrochemische Signalerzeugung. In Anwesenheit des Substrates, Glukose, entsteht Wasserstoffperoxid, nachgewiesen ist, auf die Platin Arbeitselektrode. Die Stop-Flow-Technik wird angewendet, um die Signalverstärkung zusammen mit schnellen Nachweis zu erhalten. Verschiedenen Biomolekülen können quantitativ mit Hilfe des eingeführten mikrofluidischen Systems, geben einen Hinweis auf verschiedene Arten von Krankheiten oder in Bezug auf therapeutische Drug monitoring, erleichtert eine personalisierte Therapie gemessen werden.

Design und Herstellung von mikrofluidischen Biosensor-Plattform:
Die Herstellung von mikrofluidischen Biosensor Chips wird durch photolithographische Standardtechniken beschäftigen DFR Mehrschichtigkeit auf Wafer-Ebene realisiert. Diese Herstellung Strategie stützt sich auf die Laminierung der entwickelten Schichten des DFRs auf einem Platin-gemusterten PI Substrat, Bildung von mikrofluidischen Kanälen. Eine kurze Zusammenfassung z...

Eine mikrofluidischen Biosensor-Plattform wurde entworfen und hergestellt mit kostengünstigen trocken Photoresist Filmtechnik für die rasche und sensible Quantifizierung der verschiedenen Analyten. Diese Einweg-System ermöglicht das elektrochemische Auslesen der Enzym-linked-Assays auf den Chip immobilisiert mittels der Stop-Flow-Technik.

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine vielseitige elektrochemische mikrofluidische Biosensorplattform einzuführen, die auf kostengünstiger Trockenfilm-Photolack-Technologie basiert und je nach anschließend eingesetztem immobilisierten Enzym-gekoppelten Assay verschiedene Arten von Analyten messen kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Point-of-Care-Testens zu beantworten, beispielsweise die Quantifizierung unterschiedlicher Arzneimittel wie Antibiotika oder die Diagnose verschiedener Erkrankungen wie Krebs. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der hier vorgestellte Biosensor hauptsächlich aus kostengünstigen Materialien besteht, einfach in der Handhabung ist und in Bezug auf seine Anwendung äußerst vielseitig einsetzbar ist.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte im Zusammenhang mit Trockenfolien-Photolacken schwer zu beherrschen sind, weil die Handhabung viel Übung und Erfahrung erfordert. Die Demonstration der Immobilisierung und Messung des On-Chip-Assays wird Eva Grether, eine studentische Hilfskraft aus meiner Gruppe, durchführen. Zunächst schneiden Sie ein Polyimid- oder PI-Substrat in sechs Zoll große runde Wafer. Danach den PI-Wafer etwa eine Stunde lang bei 120 Grad Celsius in einen Ofen stellen, um eine Dehydratisierungsbehandlung durchzuführen. Um den ersten Schritt der Photolithographie für den Liftoff-Prozess durchzuführen, programmieren Sie den Spin- Beschichtungsautomaten auf eine Spinnzeit von 30 Sekunden bei 3000 U/min mit einer Beschleunigung von 2000 U/min pro Sekunde. Stellen Sie den PI-Wafer auf den Spin- Beschichtungsautomaten und befestigen Sie ihn durch Anlegen eines Vakuums.Starten Sie dann das Spin-Coder-Programm und geben Sie zwei Milliliter eines Resistes aus, um den Liftoff-Prozess zu ermöglichen. Entfernen Sie die Wafer aus dem Spin-Coder und trocknen Sie die PI-Wafer zwei Minuten lang bei 100 Grad Celsius auf einer Heizplatte vor. Richten Sie die gewünschte Maske zur Strukturierung der Elektroden auf dem PI-Wafer mit bloßem Auge aus und belichten Sie sie mit 400 Millijoule pro Quadratzentimeter UV-Licht.Legen Sie dann das Wafer in eine Schale, die mit einem zum Resist passenden Entwickler gefüllt ist, auf einen Rotationsrührer und lassen Sie es etwa eine Minute lang leicht schütteln. Nachdem der überschüssige Resist entfernt wurde, spülen Sie das PI-Wafer an einer Nassbank mit entionisiertem Wasser ab, bevor Sie es mit Druckluft trocknen. Danach scheidet man Platin zur Bildung der Elektroden durch einen Standardprozess der physikalischen Gasphasenabscheidung ab, wobei 200 Nanometer Platin auf das Wafer aufgebracht werden.Nachdem das Wafer in eine Schale gelegt wurde, das passende Entfernungsmittel zur Schale hinzufügen und den Liftoff-Resist entfernen, wobei das Wafer leicht auf einem Orbitalschüttler geschüttelt wird, bis der gesamte überschüssige Platin entfernt ist. Nach dem Spülen und Trocknen des PI-Wafers wie zuvor beschrieben, den zweiten Schritt der Photolithographie durchführen und die Elektroden wie im Textprotokoll beschrieben reinigen. Danach die Platin-Kontaktflächen des Wafers mit einem UV-empfindlichen Klebeband passivieren.Um dies zu tun, schneiden Sie die Folie in Streifen, die fünf Millimeter breit und elf Zentimeter lang sind, und befestigen Sie sie auf dem Wafer, wobei die Bereiche, die nicht mit Silber beschichtet werden sollen, geschützt werden. Für die Silberabscheidung stellen Sie ein Ultraschallbad in einen Abzug und geben einen Behälter mit Silberelektrolytlösung in das Bad. Stellen Sie das Ultraschallbad auf Raumtemperatur ein und reduzieren Sie die Leistung auf 10 %. Schließen Sie den Massenkontakt der Referenzelektroden an eine Konstantstromquelle an.Verbinden Sie dann die Gegenelektrode, einen Silberdraht, der in die Silberelektrolytlösung eingetaucht ist, mithilfe von Standardverbindungskabeln mit der Stromquelle. Stellen Sie die Stromquelle auf Gleichstrom und eine Stromdichte von etwa 4,5 Milliampere pro Quadratzentimeter ein, was einer Silberabscheidungsrate von ungefähr 0,3 Mikrometer pro Minute entspricht. Schalten Sie das Ultraschallbad ein und lassen Sie die Stromquelle 10 Minuten lang laufen.Nach 10 Minuten das Wafer mit entionisiertem Wasser abspülen. Um den dritten Photolithographieschritt durchzuführen, schneiden Sie zunächst die Trockenfolien-Photoresist-Schichten auf eine ähnliche Größe wie das Wafer zu. Befestigen Sie die gewünschte Maske am Belichtungsgerät und richten Sie die DFR-Schicht mit bloßem Auge auf die Maske aus.Beleuchten Sie dann den Lack mit 250 Millijoule pro Quadratzentimeter UV-Licht. Entfernen Sie die Schutzfolie des Fotolacks und entwickeln Sie den Lack etwa zwei Minuten lang in einer 1%igen Natriumcarbonatlösung unter Verwendung eines standardmäßigen Ultraschallbades, das auf 42 Grad Celsius vorgewärmt und auf eine Ultraschallleistung von 100 % eingestellt ist. Um die Reaktion sofort zu stoppen, schütteln Sie den Lack eine Minute lang in einem 1%igen Salzsäurebad auf einem Rüttelschüttler. Spülen und trocknen Sie jede DFR-Schicht wie zuvor.Um die DFR-Schichten auf das PI-Substrat zu laminieren, platzieren Sie die PI-Wafer auf eine Transparentfolie und befestigen Sie diese mit handelsüblichem Klebeband. Passen Sie die DFR-Schicht für den Kanal unter dem Mikroskop auf der PI-Wafer mit Hilfe der entsprechenden Ausrichtungsstrukturen an. Verwenden Sie für die Lamination einen handelsüblichen Heißwalz-Laminator und heizen Sie die obere Walze auf 100 Grad Celsius und die untere Walze auf 60 Grad Celsius vor. Stellen Sie den Druck auf drei bar bei einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,3 Metern pro Minute ein. Legen Sie das Wafer mit der fixierten DFR-Schicht in die Mitte des Laminators und starten Sie ihn, sodass die DFR durch den Laminator befördert wird. Wiederholen Sie den Schritt nach einer Drehung des Wafers um 180 Grad.Entfernen Sie anschließend die Schutzschicht von der Vorderseite der DFR-Kanalschicht, indem Sie an einem Ende des DFR normales Klebeband anbringen und nach oben abziehen. Verwenden Sie eine manuelle Dosiereinheit mit 0,004-Zoll-Röhrchen, um kleine Tröpfchen gelöstes Polytetrafluorethylen in die Vertiefungen der Isolationsschicht abzugeben. Um den mikrofluidischen Chip zu versiegeln, laminieren Sie die abdeckende DFR-Schicht wie zuvor auf die Kanalschicht. Backen Sie dann den mikrofluidischen Biosensor durch Entfernen aller Schutzfolien auf den Deckschichten und der rückseitigen DFR-Schicht. Schneiden Sie die Biosensoren mit einer gewöhnlichen Schere in Streifen. Schlussendlich härten Sie die Chips drei Stunden lang bei 160 Grad Celsius in einem Ofen aus.Um Avidin in den Immobilisierungsbereich des Kanals einzubringen, pipettieren Sie zwei Mikroliter der Avidin-Lösung in den Eingang des Biosensors. Um sicherzustellen, dass die Flüssigkeit während der gesamten Inkubationszeit an der Barriere stoppt, geben Sie zwei Mikroliter entionisiertes Wasser am Ausgang des Chips ab. Inkubieren Sie den Chip eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius in einem geschlossenen Behälter.Entfernen Sie überschüssige Reagenzien über den Eingang des Chips, indem Sie ein Vakuum anlegen. Spülen Sie anschließend den Kanal mit 50 Mikrolitern Waschpuffer, der am Ausgang appliziert wird, während das Vakuum angelegt ist. Trocknen Sie den Kanal 30 Sekunden lang unter Vakuum.Blocken Sie die Kanaloberfläche, um unspezifische Bindung zu inhibieren, indem Sie zwei Mikroliter einer 1 %igen BSA-Lösung am Einlass und zwei Mikroliter deionisiertes Wasser am Auslass des Kanals aufbringen. Inkubieren Sie den Chip eine Stunde bei 25 Grad Celsius in einem geschlossenen Behälter, bevor Sie die Zugangsreagenzien entfernen und den Kanal wie zuvor trocknen. Anschließend inkubieren Sie DNA-Oligos, die mit Biotin und sechs FAM markiert sind, indem Sie zwei Mikroliter einer bestimmten Konzentration der DNA-Lösung am Einlass und zwei Mikroliter deionisiertes Wasser am Auslass applizieren.Die Chip bei 25 Grad Celsius für 15 Minuten in einem geschlossenen Behälter inkubieren, bevor die Zugangsreagenzien entfernt und der Kanal getrocknet werden. Um die mit Glucose-Oxidase markierten sechs FAM-Antikörper zu immobilisieren, zwei Mikroliter der Antikörperlösung am Einlass und zwei Mikroliter deionisiertes Wasser am Auslass des Kanals zugeben. Die markierten Antikörper erneut bei 25 Grad Celsius für 15 Minuten in einem geschlossenen Behälter inkubieren, bevor die überschüssigen Reagenzien entfernt werden.Bringen Sie den fluidischen PMMA-Abstandshalter auf dem Biosensor auf und verbinden Sie den Biosensor elektrisch mit dem Potentiostaten. Stellen Sie die fluidische Verbindung zwischen der Spritzenpumpe und dem Biosensor mithilfe des fluidischen Adapters her. Starten Sie die Spritzenpumpe manuell mit einer 0,1-molaren PPS-Lösung bei einer Flussrate von 20 Mikrolitern pro Minute.Am Arbeitselektroden gegenüber der On-Chip-Referenzelektrode 30 Zyklen einer alternierenden Spannung von 0,8 und 0,05 Volt jeweils fünf Sekunden lang anlegen. Danach die Arbeitselektrode oxidieren, indem eine Spannung von 0,8 Volt für 60 Sekunden angelegt wird. Um die Signalablesung des Assays zu starten, warten, bis sich das gemessene Stromsignal stabilisiert hat.Stoppen Sie die Spritzenpumpe und wechseln Sie das Reagenz von 0,1 molarer PPS zu einer 40 Millimolar-Glucoselösung, bevor Sie die Software am Spritzenpumpencontroller starten. Nachdem der Fluss automatisch für eine, zwei oder fünf Minuten angehalten wurde, startet die Spritzenpumpe den Fluss erneut. Beobachten Sie das Auftreten der Stromspitzen.Der elektrochemische Biosensor enthält einen einzigen mikrofluidischen Kanal mit zwei unterschiedlichen Bereichen, die durch eine hydrophobe Stoppbarriere getrennt sind. Der Immobilisierungsbereich, in dem der Assay durch einfache Absorption der Biomoleküle fixiert wird, und die elektrochemische Zelle, in der die amperometrische Auslesung des Assays erfolgt. Für die amperometrische Auslesung des Biosensors wird die sogenannte Stop-Flow-Technik verwendet.Zunächst wird ein konstanter Fluss des Enzymsubstrats Glukose zugeführt. Nachdem sich das Signal stabilisiert hat, wird der Fluss gestoppt. Während der Stopp-Phase wird die Glukose in Wasserstoffperoxid umgewandelt und im Kanal angereichert.Durch das erneute Starten des Flusses wird das Wasserstoffperoxid durch die elektrochemische Zelle gespült, wo es detektiert wird und einen Stromspitzenwert erzeugt. Abhängig von der Menge des gebundenen Analyten und somit der Menge der gebundenen Glucose-Oxidase variiert die Signalamplitude, was zu einer beispielhaften Kalibrierungskurve führt, wie hier dargestellt. Sobald der Vorgang beherrscht ist, kann die Herstellung des Biosensors bei korrekter Durchführung in etwa 10 Stunden abgeschlossen werden.Während die Inkubations- und Auslesezeit des Assays von dem verwendeten Assay abhängt, kann diese gewöhnlich innerhalb von drei Stunden realisiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Herstellung, die Probenvorbereitung auf dem Chip und den Betrieb elektrochemischer Biosensoren auf Basis von trocken aufgetragenem Fotolack haben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass alle Protokollschritte streng befolgt und mit großer Vorsicht durchgeführt werden.Da die Leistung des Sensors stark vom Herstellungsverfahren abhängt, reichen die Auswirkungen dieser Technik bis hin zur personalisierten Medizin, die die vor-Ort-Diagnose verschiedener Krankheiten und Arzneimittel umfasst und somit eine individualisierte Therapie erleichtert. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit silberhaltigen Elektrolytlösungen äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrille und geeigneten Handschuhen, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

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Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb (Video) | JoVE Journal

Trockenen Film Photoresist-basierte elektrochemische mikrofluidischen Biosensor Plattform: Gerät Fertigung, On-Chip-Test Vorbereitung und Systembetrieb

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