Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein einfaches und effektives TEM-Negativfärbeverfahren für virale Proben im Rahmen des Biocontainments bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen der Virologie über die Morphologie und Struktur der untersuchten Viren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache und effektive Handhabung von Elektronenmikroskopiegittern in Biocontainment-Umgebungen ermöglicht.

Diese Technik wird im Rahmen der TEM-Diagnose eines unbekannten Virus verwendet, da sie leicht auf Virusproben in allen Umgebungen angewendet werden kann. Obwohl wir diese Methode in erster Linie zur Unterstützung von Virus-TEM-Studien verwendet haben, hat sie eine viel breitere Anwendung und kann bei der EM-Untersuchung der meisten Nanopartikel verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Übung erfordert, um sicherzustellen, dass die TEM-Gitter beim Be- und Entladen der Kapseln nicht beschädigt werden.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir Probleme beim Umgang mit kleinen EM-Gittern in der Bioabdichtung hatten. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie virale und kohlenstoffbeschichtete TEM-Kupfergitter vor oder kaufen Sie sie. Legen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein.

Übertragen Sie anschließend die geladenen Kapseln zusammen mit anderen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien in die biologische Abdichtung. Befestigen Sie zunächst die Kapsel an einer Pipette. Aspirieren Sie 40 Mikroliter Virusexpansion in die Kapsel.

Legen Sie die Pipette 10 Minuten lang auf die Seite, wobei die Gitter horizontal ausgerichtet sind. Nehmen Sie dann die Pipette auf und geben Sie die Viruslösung in einen Abfallbehälter. Aspirieren Sie 40 Mikroliter 2%iges Glutaraldehyd-Fixiermittel in die Kapseln.

Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang auf die Seite. Danach stoßen Sie das Fixiermittel aus und aspirieren Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapsel, um das Fixiermittel abzuwaschen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal.

Als nächstes aspirieren Sie 40 Mikroliter entweder 1 % Uranylacetat oder 1 % Kaliumphosphotungssäure in die Kapsel. Lassen Sie die Kapsel 30 Sekunden lang einwirken. Nehmen Sie dann die Kapsel aus der Pipette.

Berühren Sie ein Stück Filterpapier mit dem Rand der Gitter, um es trocken zu tupfen. Füllen Sie das Filterpapier in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Als nächstes tränken Sie das Filterpapier in 1%iger Osmiumtetroxidlösung.

Legen Sie die Kapsel mit offenem Deckel in die Tube. Verschließen Sie das Rohr für eine Stunde, um eine vollständige Permeation des Osmiumtetroxiddampfes zu ermöglichen. Danach dekontaminieren Sie das Röhrchen und überführen es aus dem Biocontainment in die BSL-2 EM-Anlage.

Nehmen Sie die Kapsel aus dem Zentrifugenröhrchen und legen Sie sie dann auf eine Pipette. Aspirieren Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapsel und geben Sie das Wasser dann in einen Abfallbehälter ab. Wiederholen Sie diese Wasserwäsche dreimal.

Entfernen Sie anschließend die Kapsel aus der Pipette. Tupfen Sie die Gitter mit Filterpapier trocken. Lassen Sie die Gitter an der Luft trocknen und lagern Sie sie dann in einer Gitterbox, bis sie für die TEM-Bildgebung bereit sind.

Mischen Sie zunächst die Virussuspension mit einem gleichen Volumen von 4 % Glutaraldehyd, um eine Endkonzentration von 2 % Glutaraldehyd zu erreichen. Inaktivieren Sie das Virus mit einem Fixiermittel für mindestens 24 Stunden. Dekontaminieren Sie das Rohr und übergeben Sie es an die BLS-2 EM-Anlage.

Befestigen Sie danach einen mit einem Raster geladenen Behälter an einer Pipette. Saugen Sie die Mischung in die Kapsel an. Legen Sie die Pipette 10 Minuten lang auf die Seite, wobei die Gitter horizontal ausgerichtet sind.

Nehmen Sie dann die Pipette auf und stoßen Sie die Virusmischung in einen Abfallbehälter aus. Aspirieren Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapsel und entsorgen Sie das Wasser dann in einem Abfallbehälter. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal.

Danach werden 40 Mikroliter entweder 1 % QA oder 1 % PTA 30 Sekunden lang in die Kapsel aspiriert. Nehmen Sie die Kapsel aus der Pipette. Tupfen Sie die Gitter mit Filterpapier trocken.

Lassen Sie die Gitter dann an der Luft trocknen. In dieser Studie wurden Zaire-Ebola-Virusproben sowohl mit der manuellen Tröpfchenmethode als auch mit der Kapselmethode negativ gefärbt. Die mit diesen Methoden erzeugten TEM-Bilder zeigen beide klar definierte Details, mit Nukleokapsidstrukturen im Zentrum des Varions und sichtbaren Glykoproteinen auf der Oberfläche.

Somit ist die Kapselmethode in der Lage, TEM-Bilder von ähnlicher Qualität zu erzeugen, wie sie mit der manuellen Tröpfchenmethode erzeugt werden. Als nächstes werden verschiedene Methoden der Probeninaktivierung anhand des Chikungunya-Virus verglichen. Die Inaktivierung der Probe wird entweder schnell erreicht, indem 2 % Glutaraldehyd für 20 Minuten verwendet und anschließend eine Stunde lang 1 % Osmiumtetroxid ausgesetzt wird, oder über Nacht durch 2 % Glutaraldehyd für 24 Stunden.

Wie zu sehen ist, ermöglicht der längere Inaktivierungsprozess ohne Osmiumtetroxid mehr ultrastrukturelle Details. Anschließend wurden mit der Kapselmethode zwei Färbungen mit aldehydfixierten virusähnlichen Partikeln verglichen. Sowohl Uranylacetat als auch Phosphowolframsäure zeigen qualitativ hochwertige Ergebnisse mit klar definierten Grenzen und sichtbaren Glykoproteinen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa anderthalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Proben. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die richtigen Fixier- und Färbereagenzien für Ihre experimentellen Ziele auszuwählen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. die Partikelzählung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen durch die Berechnung der Viruskonzentrationen zu beantworten.

Diese Technik verbessert die Art und Weise, wie Virologen die Virusmorphologie und Strukturinformationen einfacher untersuchen können, insbesondere bei BLS-3- und 4-Level-Viren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit TEM-Gittern für die negative Färbung im Rahmen der Bioabdichtung einfach umgehen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aldehyd, Osmiumtetroxid und Uranylacetat äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie eine geeignete persönliche Schutzausrüstung und ein chemischer Abzug getroffen werden sollten.