Name: Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine effektive Negativfärbungsmethode für Virusproben im Biocontainment mit innovativer Kapseltechnologie. Diese Technik ermöglicht sichere Handhabung von TEM-Gittern in BSL-2, -3 und -4 Laboren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. John Carra und Rowena Schokman für die Bereitstellung gereinigter Ebola Nano-VLPs, Dr. Rajini Mudhasani für die Bereitstellung von Chikungunya Virus und Dr. Charles (Jason) Schuhmacher für die Bereitstellung von Murine Leukämie VLPs, die Ebolavirus Glykoproteine ​​exprimieren. Wir möchten uns auch bei MAJ Carl Soffler für die Erleichterung des Summer Praktikumsprogramms (SIP) und des Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) und Dr. Catherine Wilhelmsen für die Laborsicherheitstraining bedanken.

1. Versuchsvorbereitung in einer BSL-2-Umgebung vor dem Arbeiten mit den Virusproben <ol><li> Vorbereiten oder kaufen Formvar und Kohlenstoff beschichtet TEM Kupfer Gitter, in der Regel 200-400 Mesh. </li><li> Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein. <ol><li> Verwenden Sie ein vergrößertes Objektiv, um diesen Vorgang einfach durchzuführen. Ein oder zwei Gitter können in jede Kapsel eingeführt werden. Vorgeladene Kapseln können gekauft werden, um diesen Schritt zu beseitigen, falls gewünscht. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die Kapseln mit eingefügten TEM-beschichteten Gittern, zusammen mit anderen Vorräten und Reagenzien, zur Biokontainmentierung, wo die Viren negativ gefärbt werden. </li></ol> 2. Das Kapselverfahren für die Negativfärbung im Biocontainment unter Verwendung von wässrigem Glutaraldehyd und 1% Osmiumtetroxiddampfinaktivierung <ol><li> Innerhalb des Biocontainment BSC saugt man 40 μl Virussuspension in die an eine Pipette gebundene Kapsel. HINWEIS: Die Pipette bleibt an thE Kapsel, bis der Prozess abgeschlossen ist. Virusvorbereitung erfolgt nach unserer vorherigen Publikation 14 . </li><li> Legen Sie die Pipette 10 Minuten lang mit Gittern auf die Seite. Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die beschichteten Gitter fördern. </li><li> Inaktivieren Sie das Virus innerhalb der Kapsel innerhalb des Biocontainment BSC. <ol><li> Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um die Viruslösung in einen Abfallbehälter zu geben. </li><li> 40 μl 2% Glutaraldehyd-Fixiermittel in die Kapseln geben. Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube. </li><li> Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang auf die Seite. Damit ist sichergestellt, dass die Proben gut fixiert sind. </li><li> Das Fixiermittel ausschütten und 40 μl dI Wasser in die Kapseln zu w absaugenAsche weg das Fixiermittel. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt 3 Spülzyklen. </li></ol></li><li> 40 μl entweder 1% Uranylacetat (UA) oder 1% Kaliumphosphowolframsäure (PTA) in die Kapseln geben und 30 s sitzen lassen. HINWEIS: Die Färbezeit kann von 10 s bis 1 min variieren, basierend auf Virusprobe. Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz. </li><li> Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter, indem Sie ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berühren, während die Gitter in der Kapsel verbleiben. </li><li> Osmium-Tetroxid-Dampf-Inaktivierungsverfahren. <ol><li> Legen Sie die Kapsel mit offenem Deckel in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Filterpapier enthält, das in einer 1% igen Osmiumtetroxidlösung eingetaucht ist. Achtung: Osmium-Tetroxid ist bei niedrigem Dampfdruck extrem giftig. Es muss in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube verwendet werden. Handhabung mit entsprechendem Schutz. PostwarnungInformationen im Arbeitsbereich. </li><li> Das 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 h abdichten, um eine vollständige Permeation des Osmiumtetroxiddampfs zu ermöglichen. Anschließend anschließend das Röhrchen aus dem Biocontainment in die BSL-2 EM-Anlage dekontaminieren und übertragen. </li></ol></li><li> EM-Gitter aus der Kapsel entfernen. <ol><li> In der BSL-2 EM-Anlage die Kapsel aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen und auf eine Pipette legen. </li><li> 40 μl dI Wasser in die Kapsel geben und das Wasser dreimal in einen Abfallbehälter geben. </li><li> Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter mit Filterpapier, um den Rand der Gitter zu berühren. </li><li> Nach der Lufttrocknung die Gitter für die anschließende TEM-Bildgebung aufbewahren. </li></ol></li></ol> 3. Die Kapselmethode zur Inaktivierung im Biokontainment mit 2% Glutaraldehyd, gefolgt von einer Negativfärbung in einem BSL-2-Labor <ol><li> Virusinaktivierungsverfahren. <ol><lI&gt; Innerhalb des Biocontainment BSC mischen Sie die Virus Suspension gut mit dem gleichen Volumen von 4% Glutaraldehyd, um eine Endkonzentration von 2% Glutaraldehyd zu erreichen. Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube. </li><li> Inaktivierung von Viren mit Fixiermittel für mindestens 24 Stunden vor der Verpackung, Dekontamination und Überführung an die BSL-2 EM-Anlage. </li></ol></li><li> In der BSL-2 EM-Anlage die Virus- und Fixiermischung in die Kapsel einspülen, die zwei TEM-Gitter enthält, die an einer Pipette befestigt sind. </li><li> Die Pipette für 10 min mit den horizontal ausgerichteten Gittern horizontal platzieren. HINWEIS: Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die TEM-Gitter fördern. </li><li> Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um das Virus in einen Abfallbehälter zu vertreiben. Ansaugen von 40 &amp; mgr; l dIWasser in die Kapseln geben und in den Abfallbehälter für 3 Spülzyklen ausstoßen. </li><li> 40 μl entweder 1% UA oder 1% PTA in die Kapseln für 30 s einatmen. HINWEIS: Die Färbezeit variierte von 10 s bis 1 min auf der Grundlage von Virusproben. Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz. </li><li> Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter durch Berühren der Kante der Gitter zu einem Stück Filterpapier. Die Gitter trocknen und für die nachfolgende TEM-Bildgebung aufbewahren. </li></ol>

<ol><li>Gentile, M., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+rapid+viral+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update.</a> New Microbiol. 37 (4), 403-422 (2014).</li>
<li>Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helmut+Ruska+and+the+visualisation+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helmut Ruska and the visualisation of viruses.</a> Lancet. 355 (9216), 1713-1717 (2000).</li>
<li>Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+transmission+electron+microscopy+to+the+clinical+study+of+viral+and+bacterial+infections%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future.</a> Micron. 37 (2), 91-106 (2006).</li>
<li>Goldsmith, C. S., Miller, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+uses+of+electron+microscopy+for+detection+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Modern uses of electron microscopy for detection of viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 22 (4), 552-563 (2009).</li>
<li>Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electron+Microsc+Rev%22%5BJournal%5D)">Negative staining of proteins.</a> Electron Microsc Rev. 3 (1), 43-72 (1990).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+of+thinly+spread+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative staining of thinly spread biological samples.</a> Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).</li>
<li>Bradley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+bacteriophage+and+bacteriocins%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins.</a> Bacteriol Rev. 31 (4), 230-314 (1967).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+two+negative+staining+methods+on+the+Chinese+atypical+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus.</a> Arch Virol. 94 (3-4), 305-308 (1987).</li>
<li>Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/S1431927615004407">Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules.</a> Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721(2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/capsulebased-processing-and-handling-of-electron-microscopy-specimens-and-grids/43059411AA8B965E6EA870B9ED9DFAC5">Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids.</a> Microscopy Today. 23 (5), 30-37 (2015).</li>
<li>Goodman, S. L., Kostrna, M. S. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-and-microanalysis/article/reducing-reagent-consumption-and-improving-efficiency-of-specimen-fixation-and-embedding-grid-staining-and-archiving-using-mprep-capsule-processing/BD909A4213DA1D65217A9CDDE93AB2C0">Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing.</a> Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).</li>
<li>Monninger, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viral+samples+within+biocontainment+for+ultrastructural+analysis%3A+Utilization+of+an+innovative+processing+capsule+for+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining.</a> J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).</li>
<li>Rossi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+ViroCyt%28R%29+Virus+Counter+for+rapid+filovirus+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation.</a> Viruses. 7 (3), 857-872 (2015).</li>
<li>Carra, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermostable%2C+chromatographically+purified+Ebola+nano-VLP+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine.</a> J Transl Med. 13, 228(2015).</li>
<li>Rein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+viruses%3A+objects+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virol%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia viruses: objects and organisms.</a> Adv Virol. , 403419(2011).</li>
<li>Barland,, Rojkind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+with+osmium+tetroxide+vapour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Negative staining with osmium tetroxide vapour.</a> Nature. 212 (5057), 84-85 (1966).</li>
</ol>

Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen im Artikel sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee oder dem Verteidigungsministerium unterstützt.

Negative Färbung ist eine wertvolle TEM-Technik zur Bewertung und Größenbestimmung von Viren, Proteinkomplexen und Nanopartikeln. Die Tröpfchenpräparation dieser Proben durch manuelles Bewegen von Gittern von Reagenz zu negativen Flecken ist seit mehr als einem halben Jahrhundert das klassische Protokoll. Es ist ein einfacher Prozess, aber erfordert Know-how durch Training für den erfolgreichen Abschluss gewonnen. Ausgezeichnete Negativfärbung gilt nach wie vor als hochmoderne Kompetenz und ist in vielen TEM-Labors sehr...

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein effektives Werkzeug für die Betrachtung der Morphologie und der Ultrastruktur von biologischen Proben, die zu klein sind, um mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 zu sehen . TEMs schießen Elektronen durch eine sehr dünne Probe, die ein Bild mit höherer Auflösung erzeugt, da Elektronen eine viel kürzere Wellenlänge als Licht haben. Regionen der Probe, die Elektronen biegen oder blockieren, erscheinen dunkel, während Regionen, die elektronen licht sind, weiß erscheinen. Mangel an Elektronen dichten Materie macht Viren schwer zu sehen unter einem TEM, weil sie nicht streuen können Elektronen. Negative Färbung ist die häufigste Methode, die verwendet wird, um Kontrast zu erzeugen und Viren mit einem TEM zu betrachten. Das erste Negativfärbeverfahren wurde von Brenner und Horne im Jahre 1959 vorgeschlagen, basierend auf einem Experiment, bei dem Hall (1955) und Huxley (1957) Beobachter warenVed das Auftreten von biologischen Strukturen im umgekehrten Kontrast beim Eintauchen in eine elektronendichte Substanz 5 . Der Prozess der negativen Färbung ist in der letzten Hälfte des Jahrhunderts nahezu unverändert gewesen. Negative Färbung beinhaltet das kurzzeitige Aufbringen einer Schwermetallsalzlösung auf eine Probe auf einem TEM-Gitter in einem Versuch, das Virus mit dichten Materialien zu umgeben, ohne das Virus 6 zu infiltrieren. Dies schafft eine dunkle Grenze und zeigt die Partikelform 5 . Diese Studie verwendet zwei Reagenzien für Negativfärbung, Uranylacetat (UA) und Kaliumphosphowolframsäure (PTA). Beide dieser Flecken werden gewöhnlich verwendet, um kleine biologische Proben, wie Viren, Proteinkomplexe und Nanopartikel 7 , 8 , 9 , negativ zu färben. Die herkömmliche Negativ-Färbetechnik ist die manuelle Tröpfchen-Negativ-FärbungstechnologieNique 7 Diese Methode erfordert eine präzise Handhabung von kleinen, zerbrechlichen TEM-Gittern mit einer Pinzette, um kleine Mengen an Virusproben, Flecken und Spülungen aufzutragen. Das typische Herstellungsprotokoll beinhaltet das Aufbringen eines Tröpfchens der Probensuspension auf die Oberfläche eines mit einem Film beschichteten TEM-Gitters ( 1A ). Nach dem Anbringen der Probe an die Filmoberfläche wird das Gitter gespült, um nicht-adhärente Viren zu entfernen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis zu einer Minute gefärbt zu werden, abhängig von der Art der Probe. Überschüssige Flüssigkeit wird vom Gitter weggerissen, indem man ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berührt. Die manuelle Tröpfchenmethode erfordert, dass jedes Raster individuell hergestellt wird. Wenn nicht sorgfältig behandelt, werden beschichtete TEM-Gitter leicht durchbohrt, gebogen oder verunreinigt. Die Verarbeitung mehrerer Proben kann zu Schwierigkeiten bei der Verfolgung der Gitter führen und eine gleichmäßige Färbung für jede Probe gewährleisten. Diese manuelle Färbung ist viel mehr dWenn es in den Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 Biocontainmentlaboratorien aufgrund der für diese Umgebungen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) fällig ist. PPE ist umständlich und die Biocontainment-Umgebung ist viel turbulenter im Vergleich zu einem regelmäßigen Labor. Das Personal, das in BSL-3 Biokontainmentlaboratorien arbeitet, muss 2 Paar Handschuhe tragen und in einem Biosicherheitsschrank (BSC) arbeiten. Diese doppelte Handschuhschicht reduziert die taktile Empfindlichkeit und beschränkt die Feinmotorik. Der Luftstrom des BSC, der den Benutzer schützt und hilft, die Kontamination der Proben zu verhindern, kann dazu führen, dass die Proben und Flecken zu schnell trocknen und so die Fleckenqualität beeinträchtigen. Der starke turbulente Luftstrom im BSC kann auch schnell ein Gitter wegblasen, das nicht gut gesichert ist. In BSL-4 Biocontainment-Labors gibt es zusätzliche Sicherheitsanforderungen. Das Personal muss einen positiven Druckanzug tragen, der die physische Bewegung und die Fähigkeit, deutlich zu sehen und zu manipieren, weiter einschränktGitter wässern. Der Techniker, der in BSL-4 arbeitet, trägt auch mindestens 2 Paar Handschuhe, wobei das äußere Paar ein dicker Handschuh ist, der die Geschicklichkeit und die taktile Empfindung stark reduziert. Schließlich ist die Pinzette, die verwendet wird, um TEM-Gitter zu handhaben, scharf, wodurch ein Risiko für den Techniker aufgrund ihrer Fähigkeit, Pünktchen Handschuhe. Bei Kapseln, die Gitter enthalten, sind keine Pinzetten notwendig, so dass eine sichere, zangenfreie Alternative zur Manipulation von Gittern in Biokontainmenten geschaffen wird. Schließlich bieten die Kapseln auch einen wirksamen Weg, um Gitter während der Verarbeitung, Osmiumdampf-Dekontamination und während der Lagerung zu speichern; Wodurch die Gitter organisiert und vor Schäden geschützt sind. In diesem Bericht stellen wir eine neue Methode zur Negativfärbung von TEM-Gittern in Biokontainmentlaboratorien vor, die mPrep / g-Kapseln, eine kapselbasierte Vorrichtung zur Netzhandhabung und Färbung 10 , 11 , 12, einsetzt . Die KapselModifiziert zwei TEM-Gitter, minimiert die direkte Handhabung und reduziert das Potenzial für Netzschäden. Die Kapsel haftet direkt an einer Einzel- oder Mehrkanalpipette in der gleichen Weise wie eine Pipettenspitze, so dass die Anwendung von verschiedenen Flüssigkeiten auf Gitter, die darin enthalten sind. Dies ermöglicht die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben mit doppelten Gittern ( Abbildung 1B ). Zu negativen Flecken mit Kapseln wird die Virusprobe in die Kapsel angesaugt und für 10 min gehalten, um die Viren auf die Gitteroberflächen adsorbieren zu lassen. Die Gitter mit adsorbiertem Virus werden anschließend mit deionisiertem (dI) Wasser gewaschen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis 1 min gefärbt. Dieses Verfahren verwendet dieselben Protokollschritte und Reagenzien wie die manuelle Tröpfchenmethode; Der Unterschied ist, dass alle Arbeiten innerhalb der Kapsel ohne physische Handhabung der Gitter auftreten. ( Fig. 1C , 1D ). Der Zweck dieser Studie war es, Kapseln als zu bewertenEine neue Methode zur Negativfärbung von Virusproben in Biokontainmentumgebungen. Diese Studie untersuchte auch die Qualität von TEM-Bildern, die aus zwei verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren hergestellt wurden: 1) schnelle Inaktivierung mit 1% Osmiumtetroxiddampf und 2) einer 24 h Inaktivierung mit 2% Glutaraldehyd. Beide wurden unter Verwendung der Kapseln durchgeführt. Schließlich haben wir zwei häufig verwendete Negativflecken, UA und PTA, zur Verwendung in der Kapsel ausgewertet. 13

<table><tbody><tr><td>Formvar/kohlenstoffbeschichtete TEM-Gitter</td><td>SPI</td><td>3420C-MB</td><td>200 Mesh Cu Pk/100</td></tr><tr><td>mPrep/g Kapseln</td><td>EMS</td><td>85010-01</td><td>Box</td></tr><tr><td>mPrep/f Koppler</td><td>EMS</td><td>85010-11</td><td>Standard 16/Pk</td></tr><tr><td>Glutaraldehdyd</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>50% Lösung, EM Klasse</td></tr><tr><td>Osmium Tetroxid</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>4% wässrige Lösung</td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Kaliumphosphotungssäure</td><td>EMS</td><td>19500</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1450-090</td><td>Größe 50</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>JEOL</td><td>JEM-1011</td><td>TEM</td></tr></tbody></table>

verwendung von kapseln zur negativfärbung von virusproben im biocontainment

Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) dient zur Beobachtung der Ultrastruktur von Viren und anderen mikrobiellen Pathogenen mit Nanometerauflösung. Die meisten biologischen Materialien enthalten keine dichten Elemente, die in der Lage sind, Elektronen zu streuen, um ein Bild zu erzeugen; Daher ist ein negativer Fleck, der dichte Schwermetallsalze um die Probe platziert, erforderlich. Um Viren in Suspension unter dem TEM zu visualisieren, müssen sie auf kleine Gitter aufgetragen werden, die mit einer transparenten Oberfläche beschichtet sind, die nur Nanometer dick ist. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Zerbrechlichkeit sind diese Gitter schwer zu handhaben und leicht durch Luftströme zu bewegen. Die dünne Oberfläche wird leicht beschädigt, so dass die Probe schwierig oder unmöglich abbilden kann. Infektionsviren müssen in einem Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden, und einige erfordern eine Biocontainment-Laborumgebung. Die Färbung von Viren in Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 ist besonders anspruchsvoll, da diese Umgebungen turbulenter sind und Techniker erforderlich sindO trage persönliche Schutzausrüstung (PSA), die Geschicklichkeit verringert. In dieser Studie haben wir ein neues Gerät zur Unterstützung von negativen Färbeviren im Biokontainment evaluiert. Das Gerät ist eine Kapsel, die als spezialisierte Pipettenspitze arbeitet. Sobald die Gitter in die Kapsel geladen sind, saugt der Benutzer Reagenzien einfach in die Kapsel, um das Virus und die Flecken an das verkapselte Gitter zu liefern, wodurch die Handhabung von Gittern eliminiert wird. Obwohl diese Technik speziell für die Verwendung in BSL-3 oder -4 Biocontainment entwickelt wurde, kann sie die Probenvorbereitung in jeder Laborumgebung erleichtern, indem sie eine leichte Negativfärbung des Virus ermöglicht. Dieselbe Methode kann auch angewendet werden, um negativ gefärbte TEM-Proben von Nanopartikeln, Makromolekülen und ähnlichen Proben herzustellen.

Die Kapselmethode produziert gute Qualität Negativfärbung für TEM-Bildgebung: Zuerst haben wir die Qualität der Bilder ausgewertet, die durch die Verwendung der manuellen Tröpfchenmethode und der Kapselmethoden für die Negativfärbung von Zaire ebolavirus erzeugt wurden. Ebolaviren sind Mitglieder der Filoviridae Familie, zusammen mit Marburg Virus. Ebolavirus hat typischerweise einen Durchmesser von 80 bis 100 nm und kan...

Dieses Protokoll liefert eine Anleitung für Negativfärbevirusproben, die leicht in BSL-2-, -3- oder -4-Laboratorien verwendet werden können. Es beinhaltet die Verwendung einer innovativen Verarbeitungskapsel, die das Transmissionselektronenmikroskopie-Gitter schützt und dem Anwender eine leichtere Handhabung in den turbulenteren Umgebungen im Biokontainment ermöglicht.

Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Transmission electron microscopy (TEM) is used to observe the ultrastructure of viruses and other microbial pathogens with nanometer resolution. Most ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein einfaches und effektives TEM-Negativfärbungsverfahren für Virusproben unter Biocontainment-Bedingungen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Virologie bezüglich der Morphologie und Struktur der untersuchten Viren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und effektive Handhabung von Elektronenmikroskopie-Gittern innerhalb von Biocontainment-Umgebungen ermöglicht. Diese Technik ist nützlich im Rahmen der TEM-Diagnose eines unbekannten Virus, da sie problemlos auf Virusproben in allen Umgebungen angewendet werden kann. Obwohl wir diese Methode hauptsächlich zur Unterstützung von Virus-TEM-Studien eingesetzt haben, ist sie weitaus breiter anwendbar und kann bei der EM-Untersuchung der meisten Nanopartikel verwendet werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da etwas Übung erforderlich ist, um sicherzustellen, dass die TEM-Gitter beim Einlegen und Entnehmen aus den Kapseln nicht beschädigt werden.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir Probleme beim Umgang mit kleinen EM-Gitterschalen unter Biocontainment-Bedingungen hatten. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Formvar- und kohlenstoffbeschichtete TEM-Kupfergitter vor oder kaufen Sie diese ein. Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein. Überführen Sie anschließend die beladenen Kapseln zusammen mit weiteren Hilfsmitteln und Reagenzien in die Biocontainment-Einrichtung. Befestigen Sie zunächst die Kapsel an einer Pipette. Aspirieren Sie 40 Mikroliter Virus-Suspension in die Kapsel. Legen Sie die Pipette seitlich ab, sodass die Gitter 10 Minuten lang horizontal ausgerichtet sind. Danach nehmen Sie die Pipette auf und geben die Viruslösung in einen Abfallbehälter ab. Aspirieren Sie 40 Mikroliter 2 % iger Glutaraldehyd-Fixierlösung in die Kapseln. Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang seitlich ab. Danach entfernen Sie die Fixierlösung und aspirieren 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapsel, um die Fixierlösung abzuwaschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.Als Nächstes 40 Mikroliter entweder 1 % Uranylacetat oder 1 % Kaliumphosphorwolframsäure in die Kapsel aufsaugen. Die Kapsel 30 Sekunden ruhen lassen. Anschließend die Kapsel vom Pipettiergerät entfernen.Berühren Sie die Gitter mit einem Stück Filterpapier am Rand, um sie abzutupfen. Überführen Sie das Filterpapier in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend wird das Filterpapier in eine 1 %ige Osmiumtetroxidlösung getaucht.Stellen Sie die Kapsel mit geöffnetem Deckel in das Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen für eine Stunde, um eine vollständige Durchdringung mit Osmiumtetroxid-Dampf zu ermöglichen. Danach entsorgen Sie das Röhrchen und bringen es aus der Biocontainment-Einrichtung in die BSL-2-EM-Anlage.Entfernen Sie die Kapselfläschchen aus dem Zentrifugenröhrchen und setzen Sie es dann auf eine Pipette auf. Saugen Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapselfläschchen auf und geben Sie das Wasser anschließend in einen Abfallbehälter ab. Wiederholen Sie diese Wasserwäsche dreimal.Entfernen Sie anschließend die Kappe von der Pipette. Trocknen Sie die Objektträger mit Filterpapier ab. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen und bewahren Sie sie anschließend in einer Objektträgerbox auf, bis die TEM-Aufnahme durchgeführt wird.Mischen Sie zunächst die Virensuspension mit einem gleichen Volumen 4 %iger Glutaraldehydlösung, um eine Endkonzentration von 2 % Glutaraldehyd zu erreichen. Inaktivieren Sie die Viren mit dem Fixans mittels einer Einwirkzeit von mindestens 24 Stunden. Desinfizieren Sie das Gefäß und bringen Sie es in die BSL-2-EM-Einrichtung. Befestigen Sie danach ein mit Capture beschichtetes Gitter an einer Pipette. Saugen Sie die Mischung in die Kapillare auf. Legen Sie die Pipette seitlich ab, sodass die Gitter horizontal ausgerichtet sind, und belassen Sie sie 10 Minuten in dieser Position.Nehmen Sie anschließend die Pipette auf und geben Sie die Virusmischung in einen Abfallbehälter ab. Saugen Sie 40 Mikroliter deionisiertes Wasser in die Kapillare auf und entsorgen Sie das Wasser in einem Abfallbehälter. Wiederholen Sie diese Spülung dreimal.Danach 40 Mikroliter entweder 1 % UA oder 1 % PTA für 30 Sekunden in die Kapsel aufsaugen. Die Kapsel von der Pipette nehmen. Mit Filterpapier die Gitter abtupfen, bis sie trocken sind.Anschließend lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen. In dieser Studie werden Proben des Ebola-Virus der Art Zaire mittels negativer Kontrastierung sowohl mit der manuellen Tropfenmethode als auch mit der Kapselmethode behandelt. Die aus diesen Methoden gewonnenen TEM-Aufnahmen zeigen jeweils deutlich erkennbare Details, darunter Nukleokapsidstrukturen im Zentrum des Virions sowie sichtbare Glykoproteine auf der Oberfläche. Somit ist die Kapselmethode in der Lage, TEM-Bilder von vergleichbarer Qualität zu erzeugen wie die manuelle Tropfenmethode. Anschließend werden verschiedene Methoden der Probendeaktivierung am Chikungunya-Virus verglichen. Die Deaktivierung der Proben erfolgt entweder schnell, durch 20-minütige Behandlung mit 2 % Glutaraldehyd und anschließende Einwirkung von 1 % Osmiumtetroxid für eine Stunde, oder über Nacht, durch 24-stündige Behandlung mit 2 % Glutaraldehyd. Wie zu erkennen ist, ermöglicht der längere Inaktivierungsprozess ohne Osmiumtetroxid eine detailliertere Darstellung ultrastruktureller Merkmale.Anschließend wurden mittels der Kapsel-Methode zwei Anfärbungen mit aldehyd-fixierten virusähnlichen Partikeln verglichen. Sowohl Uranylacetat als auch Phosphorwolframsäure zeigen Ergebnisse von hoher Qualität mit deutlich abgegrenzten Rändern und sichtbaren Glykoproteinen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa anderthalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Proben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete Fixier- und Färbereagenzien entsprechend den experimentellen Zielen auszuwählen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Partikelzählung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen durch die Berechnung von Virus-Konzentrationen zu beantworten.Diese Technik verbessert die Art und Weise, wie Virologen die Morphologie und Struktur von Viren einfacher untersuchen können, insbesondere bei Viren der Sicherheitsstufen BSL-3 und BSL-4. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie TEM-Gitter zur negativen Färbung innerhalb einer Biocontainment-Umgebung einfach gehandhabt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aldehyd, Osmiumtetroxid und Uranylacetat äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und einer chemischen Abzugshaube getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

utilization-capsules-for-negative-staining-viral-samples-within

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Quelle: Feltwell, T., et.al. Trennung von Bakterien nach Kapselmenge unter Verwendung eines diskontinuierlichen Dichtegradienten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Präparation und Charakterisierung von Bakterienstämmen mit unterschiedlicher Kapselproduktion. Pathogene Stämme, die unterschiedliche Mutationen in kapselbezogenen Genen tragen, werden kultiviert, in flüssigen Medien gezüchtet und einer Zentrifugation unterzogen, um Kapselphänotypen anhand der Pelletdichte zu unterscheiden.

Kultivierung und Isolierung kapselbildender pathogener Bakterienstämme

In diesem Video demonstrieren wir die negative Färbung von behüllten Virusproben mit einer Verarbeitungskapsel in der Biocontainment-Umgebung. Die negativ gefärbten Viren können mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden, um die Struktur und Morphologie der Viren mit Nanometerauflösung zu untersuchen.

Kapselbasierte Negativfärbung von Virusproben auf TEM-Gittern: Eine Schwermetallfärbetechnik zur Visualisierung der Ultrastruktur behüllter Viren

Routinemäßige Nachweismethoden nutzen virale Genom Verstärkung sind durch ihre Unfähigkeit, infektiöse von nicht-infektiöse Partikel unterscheiden begrenzt. Der Zweck dieses Artikels ist es, detaillierte Protokolle nach alternativen Methoden zur Diskriminierung von ansteckenden Norovirus Teilchen mit Aptamer Bindung, dynamische Lichtstreuung und Transmissions-Elektronenmikroskopie Unterstützung bieten.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Negativen Fleck EM ist eine kraftvolle Methode zur Visualisierung von makromolekularen Struktur, aber verschiedenen befleckenden Techniken können unterschiedliche Ergebnisse in eine Probe Weise produzieren. Hier sind mehrere negative Färbung Ansätze zu einer anfänglichen Workflow zur Bewältigung der Visualisierung der anspruchsvolle Systeme ausführlich beschrieben.

Variationen auf negativ Färben Elektronenmikroskopie Methoden: Werkzeuge für die Bekämpfung der anspruchsvolle Systeme

Wir zeigen die Verwendung von diskontinuierlichen Dichtegradienten Bakterienpopulationen basierend auf Kapselproduktion zu trennen. Diese Methode wird verwendet, zu vergleichen Kapsel Betrag zwischen Kulturen, durch Mutation entstehende Variationen mit einer speziellen Kapsel Phänotyp zu isolieren oder Kapsel Regulierungsbehörden zu identifizieren. Hier beschrieben ist die Optimierung und Durchführung des Tests.

Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten

Hier beschreiben wir eine einzellige Mikro-Aspirationsmethode zur Trennung infizierter Amöben. Um virale Subpopulationen in Vermamoeba vermiformis zu trennen, die mit Faustoviren und unbekannten Riesenviren infiziert sind, haben wir das unten beschriebene Protokoll entwickelt und seine Fähigkeit demonstriert, zwei neuartige Riesenviren mit geringem Überfluss zu trennen.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

Für eine eingehende mechanistische Analyse der RNA-Synthese des respiratorischen Synzytialvirus (RSV) berichten wir über ein Protokoll zur Verwendung des Chaperonphosphoproteins (P) zur Koexpression des RNA-freien Nukleoproteins (N0)für die anschließende in vitro-Assemblierung der virusspezifischen Nukleokapside (NCs).

Generierung und Aufbau virusspezifischer Nukleokapsiden des respiratorischen Synzytialvirus

Erfahren Sie eine effektive Negativfärbungsmethode für Virusproben im Biocontainment mit innovativer Kapseltechnologie. Diese Technik ermöglicht sichere Handhabung von TEM-Gittern in BSL-2, -3 und -4 Laboren.

Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Weitere Videos entdecken