Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein einfaches und effektives TEM-Negativfärbungsverfahren für Virusproben unter Biocontainment-Bedingungen bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Virologie bezüglich der Morphologie und Struktur der untersuchten Viren zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache und effektive Handhabung von Elektronenmikroskopie-Gittern innerhalb von Biocontainment-Umgebungen ermöglicht. Diese Technik ist nützlich im Rahmen der TEM-Diagnose eines unbekannten Virus, da sie problemlos auf Virusproben in allen Umgebungen angewendet werden kann. Obwohl wir diese Methode hauptsächlich zur Unterstützung von Virus-TEM-Studien eingesetzt haben, ist sie weitaus breiter anwendbar und kann bei der EM-Untersuchung der meisten Nanopartikel verwendet werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da etwas Übung erforderlich ist, um sicherzustellen, dass die TEM-Gitter beim Einlegen und Entnehmen aus den Kapseln nicht beschädigt werden.

Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir Probleme beim Umgang mit kleinen EM-Gitterschalen unter Biocontainment-Bedingungen hatten.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie Formvar- und kohlenstoffbeschichtete TEM-Kupfergitter vor oder kaufen Sie diese ein. Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein. Überführen Sie anschließend die beladenen Kapseln zusammen mit weiteren Hilfsmitteln und Reagenzien in die Biocontainment-Einrichtung. Befestigen Sie zunächst die Kapsel an einer Pipette. Aspirieren Sie 40 Mikroliter Virus-Suspension in die Kapsel. Legen Sie die Pipette seitlich ab, sodass die Gitter 10 Minuten lang horizontal ausgerichtet sind. Danach nehmen Sie die Pipette auf und geben die Viruslösung in einen Abfallbehälter ab. Aspirieren Sie 40 Mikroliter 2 % iger Glutaraldehyd-Fixierlösung in die Kapseln. Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang seitlich ab. Danach entfernen Sie die Fixierlösung und aspirieren 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapsel, um die Fixierlösung abzuwaschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.

Als Nächstes 40 Mikroliter entweder 1 % Uranylacetat oder 1 % Kaliumphosphorwolframsäure in die Kapsel aufsaugen. Die Kapsel 30 Sekunden ruhen lassen. Anschließend die Kapsel vom Pipettiergerät entfernen.

Berühren Sie die Gitter mit einem Stück Filterpapier am Rand, um sie abzutupfen. Überführen Sie das Filterpapier in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Anschließend wird das Filterpapier in eine 1 %ige Osmiumtetroxidlösung getaucht.

Stellen Sie die Kapsel mit geöffnetem Deckel in das Röhrchen. Verschließen Sie das Röhrchen für eine Stunde, um eine vollständige Durchdringung mit Osmiumtetroxid-Dampf zu ermöglichen. Danach entsorgen Sie das Röhrchen und bringen es aus der Biocontainment-Einrichtung in die BSL-2-EM-Anlage.

Entfernen Sie die Kapselfläschchen aus dem Zentrifugenröhrchen und setzen Sie es dann auf eine Pipette auf. Saugen Sie 40 Mikroliter entionisiertes Wasser in die Kapselfläschchen auf und geben Sie das Wasser anschließend in einen Abfallbehälter ab. Wiederholen Sie diese Wasserwäsche dreimal.

Entfernen Sie anschließend die Kappe von der Pipette. Trocknen Sie die Objektträger mit Filterpapier ab. Lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen und bewahren Sie sie anschließend in einer Objektträgerbox auf, bis die TEM-Aufnahme durchgeführt wird.

Mischen Sie zunächst die Virensuspension mit einem gleichen Volumen 4 %iger Glutaraldehydlösung, um eine Endkonzentration von 2 % Glutaraldehyd zu erreichen. Inaktivieren Sie die Viren mit dem Fixans mittels einer Einwirkzeit von mindestens 24 Stunden. Desinfizieren Sie das Gefäß und bringen Sie es in die BSL-2-EM-Einrichtung. Befestigen Sie danach ein mit Capture beschichtetes Gitter an einer Pipette. Saugen Sie die Mischung in die Kapillare auf. Legen Sie die Pipette seitlich ab, sodass die Gitter horizontal ausgerichtet sind, und belassen Sie sie 10 Minuten in dieser Position.

Nehmen Sie anschließend die Pipette auf und geben Sie die Virusmischung in einen Abfallbehälter ab. Saugen Sie 40 Mikroliter deionisiertes Wasser in die Kapillare auf und entsorgen Sie das Wasser in einem Abfallbehälter. Wiederholen Sie diese Spülung dreimal.

Danach 40 Mikroliter entweder 1 % UA oder 1 % PTA für 30 Sekunden in die Kapsel aufsaugen. Die Kapsel von der Pipette nehmen. Mit Filterpapier die Gitter abtupfen, bis sie trocken sind.

Anschließend lassen Sie die Objektträger an der Luft trocknen.

In dieser Studie werden Proben des Ebola-Virus der Art Zaire mittels negativer Kontrastierung sowohl mit der manuellen Tropfenmethode als auch mit der Kapselmethode behandelt. Die aus diesen Methoden gewonnenen TEM-Aufnahmen zeigen jeweils deutlich erkennbare Details, darunter Nukleokapsidstrukturen im Zentrum des Virions sowie sichtbare Glykoproteine auf der Oberfläche. Somit ist die Kapselmethode in der Lage, TEM-Bilder von vergleichbarer Qualität zu erzeugen wie die manuelle Tropfenmethode. Anschließend werden verschiedene Methoden der Probendeaktivierung am Chikungunya-Virus verglichen. Die Deaktivierung der Proben erfolgt entweder schnell, durch 20-minütige Behandlung mit 2 % Glutaraldehyd und anschließende Einwirkung von 1 % Osmiumtetroxid für eine Stunde, oder über Nacht, durch 24-stündige Behandlung mit 2 % Glutaraldehyd. Wie zu erkennen ist, ermöglicht der längere Inaktivierungsprozess ohne Osmiumtetroxid eine detailliertere Darstellung ultrastruktureller Merkmale.

Anschließend wurden mittels der Kapsel-Methode zwei Anfärbungen mit aldehyd-fixierten virusähnlichen Partikeln verglichen. Sowohl Uranylacetat als auch Phosphorwolframsäure zeigen Ergebnisse von hoher Qualität mit deutlich abgegrenzten Rändern und sichtbaren Glykoproteinen.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa anderthalb Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der Proben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, geeignete Fixier- und Färbereagenzien entsprechend den experimentellen Zielen auszuwählen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Partikelzählung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen durch die Berechnung von Virus-Konzentrationen zu beantworten.

Diese Technik verbessert die Art und Weise, wie Virologen die Morphologie und Struktur von Viren einfacher untersuchen können, insbesondere bei Viren der Sicherheitsstufen BSL-3 und BSL-4. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie TEM-Gitter zur negativen Färbung innerhalb einer Biocontainment-Umgebung einfach gehandhabt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aldehyd, Osmiumtetroxid und Uranylacetat äußerst gefährlich sein kann, und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und einer chemischen Abzugshaube getroffen werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.