Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, interstitielle Zellen der Rattenklappe (VICs) zu isolieren, um die Mechanismen der kalziziellen Aortenklappenerkrankung zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen auf dem Gebiet der Klappenverkalkung zu beantworten, z. B. warum VICs verkalken und was wir tun können, um diese Zellen vor Verkalkung zu schützen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Zugänglichkeit und das Potenzial, sich für weitere Studien in Zelllinien umzuwandeln.

Führen Sie alle Dissektionen in einer belüfteten Haube durch, die zuvor mit 70 % Ethanol desinfiziert wurde, um die Sterilität der Proben und Reagenzien zu gewährleisten. Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge, indem Sie sie autoklavieren, und tauchen Sie die Spitzen der Werkzeuge vor der Verwendung in ein Becherglas mit 70 % Ethanol. Weichen Sie die Sezierwerkzeuge in Bechern mit Waschpuffer ein, bevor Sie mit dem Tier oder dem Gewebe in Kontakt kommen.

Nach der Keulung der Ratten, wie im Textprotokoll beschrieben, legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Sezierbrett aus Glas und desinfizieren Sie die Haut durch Besprühen mit 70%igem Ethanol. Um das Herz zu präparieren, machen Sie mit Hilfe einer Präparierschere einen vier Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie der Ratte, um die Bauchhöhle freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig den Brustkorb und die Lunge, um das Herz freizulegen. Entfernen Sie das Herz mit einer scharfen Schere.

Lagern Sie das präparierte Herz in eiskaltem Waschpuffer, bis alle groben Dissektionen der Ratten abgeschlossen sind. Um jedes Herz zu mikrodissezieren, geben Sie das präparierte Herz in eine Petrischale, die mit Waschpuffer bedeckt ist. Kürzen Sie den Herzmuskel mit einer geraden Federschere so, dass er links ist und einen kleinen Bereich um die aufsteigende Aorta und die Aortenwurzel herum hat.

Schneiden Sie mit der gleichen geraden Federschere vorsichtig die aufsteigende Aorta in Richtung linker Herzkammer auf und legen Sie die Flügel der Aortenklappe frei. Als nächstes geben Sie die geöffnete Aorta in eine frische sterile Petrischale, die mit Hank's Balanced Salt Solution gefüllt ist. Präparieren Sie die Aortenklappensegel, die sich durch ihre einzigartige U-Form an der Basis der Aorta auszeichnen, mit einer Vannas-Schere.

Lagern Sie alle Packungsbeilagen in einem Milliliter eiskaltem Waschpuffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, bis alle Sektionen abgeschlossen sind. Sobald alle Blättchen geerntet sind, zentrifugieren Sie sie bei 100 g für eine Minute bei vier Grad Celsius, um den Waschpuffer zu entfernen. Um die Klappenendothelzellen oder VECs zu entfernen, verdauen Sie die Segel in 100 Mikrolitern à 425 Einheiten pro Milliliter Kollagenase II für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Unterbrechen Sie den Aufschluss, indem Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei 100 g, um die Faltblätter zu pelletieren. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entsorgt haben, waschen Sie die Segel mit 500 Mikrolitern Waschpuffer und pelletieren Sie die Zellen erneut durch Zentrifugation bei 100 g für 30 Sekunden.

Um die VICs aus den Blättchen zu ernten, verdauen Sie mit 100 Mikrolitern der Collagenase II für 1,5 bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann die VICs frei, indem Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren. Verdünnen Sie die Kollagenase II in 19 Millilitern Nährmedium und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 670 g, um die VICs und die restlichen Rückstände der Ventilsegel zu pelletieren.

Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Fiageln und die VICs auf Kulturplatten oder -kolben umgefüllt. Die VICs werden fünf bis sieben Tage lang in Kulturmedium kultiviert, bis die Konfluenz bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % CO2 erreicht ist, und wechseln Sie das Medium nach 72 Stunden. Um primäre Ratten-VICs für In-vitro-Kalzifizierungsexperimente vorzubereiten, säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Well in Sechs-Well-Platten aus.

Halten Sie die Zellen im Kulturmedium bis zu einer Konfluenz von mehr als 90 %. Behandeln Sie die VICs mit Verkalkungs- oder Kontrollmedium und inkubieren Sie weitere 72 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % CO2. Um die verkalkten primären VICs der Ratte für nachfolgende Analysen zu untersuchen, entfernen Sie das Verkalkungs- oder Kontrollmedium.

Waschen Sie die Monoschichten mit Waschpuffer, um ungebundene Calcium- und Phosphationen zu entfernen, bevor Sie die VIC-Charakterisierung der Ratte durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Für VIC-Verkalkungsstudien an Ratten färben Sie die Zellmonoschichten mit 5%iger Alizarinrot S-Lösung und wiegen Sie sie 20 Minuten lang sanft auf einem Shaker. Anschließend dreimal jeweils fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser waschen.

Um die Kalziumablagerung zu quantifizieren, verwenden Sie ein biochemisches Kalzium-Assay-Kit. Entziehen Sie Calcium-Ionen mit 0,6 molare Salzsäure für 24 Stunden bei vier Grad Celsius unter sanftem Rühren. Entnehmen Sie den Überstand und messen Sie die Kalziumkonzentration mit einem Kalzium-Assay-Kit gemäß den Richtlinien des Herstellers.

Berechnen Sie abschließend die Kalziumkonzentration als Bruchteil des gesamten zellulären Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Der VIC-Phänotyp der isolierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenz bestätigt, wobei auf die VIC-Marker, Vimentin und Alpha-Aktin der glatten Muskulatur untersucht wurde. Zusätzlich wurde die Expression des VIC-Wachstumsregulators, des Gewebewachstumsfaktors beta-1 und 2, mittels PCR-Analyse bestätigt.

Es wurde auch eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um zu überprüfen, ob die VICs der Ratte negativ für den Endothelzellmarker CD 31 waren, wobei Mitral-VECs bei Hunden als Positivkontrolle verwendet wurden. VICs an Ratten wurden erhöhten Konzentrationen von Kalzium und Phosphat ausgesetzt, die pathologische Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie nachahmen. Behandlung von VICs mit Calcium- und Phosphat-induzierter Verkalkung, bestimmt durch Alizarinrot-Färbung für die Calciumablagerung und kolorimetrische Bestimmung des Calciumgehalts nach Salzsäurelaugung.

Die Behandlung von VICs mit Calcium und Phosphat führte zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression der osteogenen Marker MSX2, ALPL und PHOSPHO1. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, ohne den Aufschluss von 18 Klappensegeln. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Sterilität während der Dissektion und Verdauung zu gewährleisten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie primäre VICs von Ratten isoliert werden und wie Sie sie verwenden können, um die Mechanismen hinter der VIC-Verkalkung zu untersuchen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Durchflusszytometrie und Mikroskopieanalyse durchgeführt werden, um die Physiologie und das Verhalten der VIC zu untersuchen. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik Forschern im Bereich der Herz-Kreislauf-Forschung den Weg ebnen, um die Mechanismen der Aortenklappenklassifikation beim Menschen anhand des Rattenmodells zu erforschen.