Name: Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung primärer Ratten-Ventil-Interstitialzellen (VICs) zur Untersuchung der Mechanismen der verkalkenden Aortenklappenkrankheit. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Verkalkungsprozesse in vitro.

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CD31 Antikörper verwendet wurde ein großzügiges Geschenk von Dr. Karen Tan, University of Edinburgh. Diese Studie wurde unterstützt durch Mittel aus der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC) in Form von einem Institut strategische Programm Grant (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (VEM und CF), ein Institut Karriere Pfad Fellowship BB/F023928/1 (VEM) und Zugehörigkeit Finanzierung über eine BBSRC Fall Zugehörigkeit BB/K011618/1 (LC).

Alle Tierversuche wurden das Roslin-Institut Tier Benutzer Ausschuss angenommene, und die Tiere waren im Einklang mit Home Office (UK) Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren gepflegt. Für das Protokoll beschrieben wurden 5 - Woche alte, männlichen Sprague-Dawley Ratten verwendet.
(1) Reagenz Rezepte
<ol><li>Bereiten Sie das Kulturmedium mit Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und nahrhafte Mischung f-12 (DMEM/F12). Fügen Sie 10 % sterilisiert Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Gentamicin.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verkalkung Medium mit Nährmedium und 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi.<ol>
<li>Bereiten Sie 1 M-Kalzium-Chlorid (CaCl2) durch wiegen, 555 mg CaCl2 und in 5 mL destilliertem Wasser 5 mL 1 M CaCl2zu lösen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm Spritze Filter um die Lösung zu sterilisieren.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Natriumphosphat durch Wiegen 710 mg wasserfreiem Diabas-Natriumphosphat (Na2HPO4) und 600 mg wasserfreiem monobasic Natriumphosphat (NaH2PO4) Auflösung jeweils separat in 5 mL destilliertem Wasser. Kombinieren Sie 3.870 µL Na2HPO4 und 1.130 µL NaH2PO4und Filter durch einen 0,22 µm Spritze Filter Lösung zu sterilisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie den Puffer zu waschen mit Hank es ausgewogen Salz-Lösung (HBSS) und 1 % Gentamicin.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Dissektion Haube
<ol><li>Führen Sie alle Sektionen in einem belüfteten Haube, vorher desinfiziert mit 70 % Ethanol zur Sterilität der Proben und Reagenzien zu gewährleisten.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Dissektion Werkzeuge durch Autoklavieren, die ihnen folgten durch Eintauchen der Tipps der Werkzeuge in einem Becher mit 70 % Ethanol vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie Becher mit Waschpuffer vor, und genießen Sie die Dissektion Werkzeuge Waschpuffer vor Kontakt mit dem Tier oder Gewebe. Behalten Sie stets den Waschpuffer auf Eis.</li>
</ol>3. Gewinnung von primären Ratte VICs
Hinweis: Für das Protokoll beschrieben, wurden 5 - Woche alte, männlichen Sprague-Dawley Ratten verwendet.
<ol><li>Die Ratten zu Keulen (~ 100 g) durch zervikale Dislokation nach UK Home Office-Richtlinien.</li>
	<li>Um das Herz der jede Ratte zu sezieren, legen Sie das Tier auf eine Dissektion Glastafel Rückenlage und desinfizieren der Haut durch Besprühen mit 70 % Ethanol.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt von 4 cm in der Mittellinie der Ratte mit Hilfe der Dissektion Schere zu entlarven die Bauchhöhle, und entfernen vorsichtig den Brustkorb und die Lungen, das Herz aussetzen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Herz mit einem Paar von Sharp, Frühling gebogene Schere und seziert Herzen im Eis Kaltwäsche Puffer speichern, bis alle Brutto Sezierungen der Ratten abgeschlossen sind.</li>
	<li>Um Mikro-jedes Herz sezieren, Letzteres Transfer in eine Petrischale in Waschpuffer abgedeckt. Trimmen des Herzmuskels mit der Frühling gerade Schere (6 mm Klinge) mit einer kleinen Umgebung der Aorta ascendens und die Aortenwurzel gelassen werden.</li>
	<li>Mit den gleichen Frühling gerade Schere (6 mm Klinge), vorsichtig aufschneiden der Aorta ascendens in Richtung des linken Ventrikels und entlarven die Aortenklappe Flugblätter.</li>
	<li>Übertragung der eröffneten Aorta in eine frische, sterile Petrischale gefüllt mit HBSS. Sezieren Sie Flugblättern der Aortenklappe, gekennzeichnet durch ihre einzigartige 'U'-Form an der Basis der Aorta mit einer Vannas-Typ Kapsulotomie Mikro-Schere (3 mm Klinge).</li>
	<li>Speichern Sie alle Merkblätter in 1 mL Eis kalt Waschpuffer in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch bis alle Sezierungen abgeschlossen sind.</li>
	<li>Sobald alle Merkblätter geerntet worden sind, Zentrifugieren sie 100 X g für 1 min bei 4 ° C, die Waschpuffer zu entfernen.</li>
	<li>Nachfolgende Schritte in eine Zelle Kultur Kapuze Sterilisation sicherzustellen. Entfernen Sie die VECs verdauen Sie die Flugblätter in 100 µL 425 U/mL Kollagenase II für 5 min bei 37 ° C. Stören Sie die Verdauung, indem es sanft nach oben und unten mit einer Spitze 200 µL Pipette pipettieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 100 X g für 30 s, pellet-Flugblätter und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig. Zweimal mit 500 µL Waschpuffer waschen und neu pellet der Zellen durch Zentrifugation bei 100 X g für 30 s.</li>
	<li>Um die VICs aus Flugblätter zu ernten, mit 100 µL 425 U/mL Kollagenase II für 2 h zu verdauen Sie, und lassen Sie die VICs durch sanft nach oben und unten mit einer Spitze 200 µL Pipette pipettieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kollagenase II in 19 mL Kulturmedium und Zentrifuge bei 670 X g für 5 min um die VICs und restlichen Ventil Broschüre Schutt pellet. Überstand verwerfen, und übertragen Sie Flugblätter und VICs auf Platten/Kulturflaschen entsprechend (Tabelle 1).</li>
	<li>Kultur der VICs für 5-7 Tage in Kulturmedium, bis Konfluenz bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % (Kohlendioxid) CO2, ändern des Mediums nach 72 h erreicht ist. Für eine spätere Verwendung in in-vitro- Experimenten Passage bis zu 5 Mal nach confluency 100 % erreicht.</li>
</ol>(4) Induktion von Verkalkung der Ratte VICs
Hinweis: Für alle Experimente zählen Sie Zellen mit einem Hemocytometer.
<ol><li>Führen Sie alle Primärzelle seeding und Passagierung in sterilisierten Hauben um Kontaminationen zu vermeiden. Um primäre Ratte VICs für in-vitro- Verkalkung Experimente vorzubereiten, Samen der Zellen bei einer Dichte von 150.000 Zellen/Brunnen in 6-Well Platten. Pflegen Sie im Kulturmedium bis ≥ 90 % Konfluenz (in der Regel 72 h).</li>
	<li>Behandeln Sie die VICs mit Verkalkung versus Steuermedium und Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO2, für weitere 72 h.</li>
	<li>Um die verkalkten primären Ratte VICs für spätere nachgelagerte Analysen zu untersuchen, entfernen Sie die Verkalkung/Steuermedium zu und waschen Sie Monolagen mit Waschpuffer, nicht gebundenen Ca und Pi-Ionen zu entfernen.</li>
</ol>(5) Ratte VIC Charakterisierung
<ol><li>Immunostaining für phänotypische Markierungen zu überwachen, wie z. B. Vimentin und α-SMA, Samen die Ratte VICs bei einer Dichte von 150.000 Zellen/Brunnen in 6 Well-Platten, enthalten in Deckel rutscht (Zellen wachsen auf der Oberfläche der Abdeckung), und bis zu 50 % Konfluenz wachsen lassen.</li>
	<li>Aspirieren das Kulturmedium und fixieren der Zelle Monolagen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 10 min vor dem Waschen sie 3 Mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), für 5 min jedes Mal. Achtung: PFA ist giftig und muss sorgfältig behandelt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zelle Monolage mit Blockierung und Permeabilisierung Puffer (1 X PBS, 5 % des normalen Serum aus der gleichen Art wie der Sekundärantikörper, 0,3 % Triton x-100) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zelle Monolagen mit Maus Anti-Vimentin und Kaninchen Anti-α-SMA-Antikörper Antikörper Verdünnungspuffer verdünnt (1 % Rinderserumalbumin + 0,3 % Triton x-100 mit PBS-Puffer) über Nacht bei 4 ° C, sanft schütteln auf einer Wippe. Hinweis: Negative Kontrollen bestand aus nicht konjugiert Maus IgG und Kaninchen IgG, unter Verwendung der gleichen Verdünnungen als der Prüflinge.</li>
	<li>Am nächsten Tag die primären Antikörper 3 Mal mit PBS für 5 min jedes Mal abwaschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zelle Monolagen mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur, sanft schütteln auf einer Wippe.</li>
	<li>3 Mal mit PBS waschen und vorsichtig tweeze, Deckgläsern (die Ratte VICs enthalten) mit ein paar Zangen und Platz auf einem Deckgläschen mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Lassen Sie die Folien für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C zu heilen, bevor die Visualisierung mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Für Western-Blot Analyse Samen der Ratte, die Vics bei einer Dichte von 150.000 Zellen/Brunnen in 6 Well-Platten und in Kulturmedium bis 100 % konfluierende wachsen lassen.</li>
	<li>Verwenden Sie 8 µg Protein zum Ausführen ein Western-Blot zur Messung des Ausdrucks der CD31 und Verunreinigungen VEC ausschließen. Hinweis: Ein standard-Western-Blot-Protokoll folgte bereits9beschrieben.</li>
	<li>Gen Studien extrahieren Sie Ribonukleinsäure (RNA) mithilfe eines kommerziellen Kits nach den Richtlinien des Herstellers.</li>
	<li>Erhalten cDNA mit reversen Transkription um zu messen, Zielgene Ausdruck mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Real-Time PCR (RT-PCR; auch bekannt als qPCR) mit grünen Fluorophor-Erkennung, mit Gapdh als Referenz gen, als zuvor 10beschrieben.<ol>
<li>Verwenden Sie das folgende Programm für PCR-Analysen: 1 Zyklus von 94 ° C für 3 min 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 63 ° C für 30 s, 72 ° C für 35 s und schließlich 1 Zyklus von 72 ° C für 5 Minuten.</li>
		<li>Verwenden Sie das folgende Programm für qPCR-Analyse: 1 Zyklus von 95 ° C für 10 min, 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min und einen zusätzlichen Kreislauf von 95 ° C für 1 min, 55 ° C für 30 s und 95 ° C für 30 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine Gelelektrophorese PCR-Produkte mit einem 2 % Agarose-Gel in Tris/Borat/EDTA (TBE) Puffer zu analysieren.</li>
</ol>(6) Ratte VIC Verkalkung Studien
<ol><li>Alizarin Rot S und biochemische Verkalkung Studien folgen Sie bitte säen und Verkalkung Richtlinien in Abschnitt 4 beschrieben.</li>
	<li>Die Zelle Monolagen mit 5 % rote Alizarin S-Lösung auf einem Shaker, 20 min sanft schaukelnden Fleck. Anschließend waschen Sie 3 Mal mit destilliertem Wasser für 5 min jedes Mal. Bilder von jedem Bohrloch zu erwerben.</li>
	<li>Um Ca Ablagerung zu quantifizieren, verwenden Sie eine biochemische Ca Assay Kit. Lauge Ca2 + -Ionen mit 0,6 M Salzsäure (HCl) für 24 h bei 4 ° C, mit sanften Agitation.</li>
	<li>Ernte der Überstand und messen die Ca-Konzentration über einen Ca-Assay kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Richtlinien des Herstellers.</li>
	<li>Berechnen Sie die Calcium-Konzentration als Bruchteil der zellulären Gesamtprotein. Denaturieren Sie zelluläre Proteine aus der Zelle Monolagen mit 0,1 M Natronlauge (NaOH) + 0,1 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Bestimmen Sie die Gesamt-Protein-Konzentration mit einem Waschmittel kompatibel (DC) Protein Assay nach den Richtlinien des Herstellers.</li>
</ol>

<ol><li>Dweck, M. R., Boon, N. a, Newby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+stenosis%3A+a+disease+of+the+valve+and+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic stenosis: a disease of the valve and the myocardium.</a> J Am Coll Cardiol. 60 (19), 1854-1863 (2012).</li>
<li>Freeman, R. V., Otto, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+calcific+aortic+valve+disease%3A+Pathogenesis%2C+disease+progression%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies.</a> Circulation. 111, 3316-3326 (2005).</li>
<li>Mohler, E. R., Gannon, F., Reynolds, C., Zimmerman, R., Keane, M. G., Kaplan, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+formation+and+inflammation+in+cardiac+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bone formation and inflammation in cardiac valves.</a> Circulation. 103 (11), 1522-1528 (2001).</li>
<li>Monzack, E. L., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+valvular+interstitial+cells+become+true+osteoblasts%3F+A+side-by-side+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Valve+Dis%22%5BJournal%5D)">Can valvular interstitial cells become true osteoblasts? A side-by-side comparison.</a> J Heart Valve Dis. 20 (4), 449-463 (2011).</li>
<li>Osman, L., Yacoub, M. H., Latif, N., Amrani, M., Chester, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human+valve+interstitial+cells+in+valve+calcification+and+their+response+to+atorvastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of human valve interstitial cells in valve calcification and their response to atorvastatin.</a> Circulation. 114 (Suppl 1), (2006).</li>
<li>Gu, X., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Rho+pathway+in+regulating+valvular+interstitial+cell+phenotype+and+nodule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of the Rho pathway in regulating valvular interstitial cell phenotype and nodule formation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (2), H448-H458 (2011).</li>
<li>Rodriguez, K. J., Masters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+valvular+interstitial+cell+calcification+by+components+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of valvular interstitial cell calcification by components of the extracellular matrix.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (4), 1043-1053 (2009).</li>
<li>Rattazzi, M., Iop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clones+of+interstitial+cells+from+bovine+aortic+valve+exhibit+different+calcifying+potential+when+exposed+to+endotoxin+and+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Clones of interstitial cells from bovine aortic valve exhibit different calcifying potential when exposed to endotoxin and phosphate.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (12), 2165-2172 (2008).</li>
<li>Zhu, D., Hadoke, P. W. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+androgen+receptor+from+vascular+smooth+muscle+cells+demonstrates+a+role+for+testosterone+in+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ablation of the androgen receptor from vascular smooth muscle cells demonstrates a role for testosterone in vascular calcification.</a> Sci Rep. 6 (April), 24807(2016).</li>
<li>Zhu, D., Mackenzie, N. C. W., Millan, J. L., Farquharson, C., Macrae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+IGF2+expression+during+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of IGF2 expression during vascular calcification.</a> J Mol Endocrinol. 52 (2), 77-85 (2014).</li>
<li>Latif, N., Quillon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+valve+interstitial+cell+phenotype+and+function+using+a+fibroblast+growth+factor+2+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Modulation of human valve interstitial cell phenotype and function using a fibroblast growth factor 2 formulation.</a> PLoS ONE. 10 (6), (2015).</li>
<li>Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+valve+interstitial+cell+phenotypes+in+regulating+heart+valve+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology.</a> Am J Pathol. 171 (5), 1407-1418 (2007).</li>
<li>Katwa, L. C., Ratajska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+converting+enzyme+and+kininase-II-like+activities+in+cultured+valvular+interstitial+cells+of+the+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Angiotensin converting enzyme and kininase-II-like activities in cultured valvular interstitial cells of the rat heart.</a> Cardiovasc Res. 29 (1), 57-64 (1995).</li>
<li>Shao, J. S., Cheng, S. L., Pingsterhaus, J. M., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P., Towler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Msx2+promotes+cardiovascular+calcification+by+activating+paracrine+Wnt+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Msx2 promotes cardiovascular calcification by activating paracrine Wnt signals.</a> J Clin Invest. 115, 1210-1220 (2005).</li>
<li>Mackenzie, N. C. W., Zhu, D., Longley, L., Patterson, C. S., Kommareddy, S., MacRae, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOVAS-1+cell+line%3A+a+new+in+vitro+model+of+vascular+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MOVAS-1 cell line: a new in vitro model of vascular calcification.</a> Int J Mol Med. 27, 663-668 (2011).</li>
<li>Kiffer-Moreira, T., Yadav, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+PHOSPHO1+suppresses+vascular+smooth+muscle+cell+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of PHOSPHO1 suppresses vascular smooth muscle cell calcification.</a> J Bone Miner Res. 28, 81-91 (2013).</li>
<li>Cui, L., Rashdan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End+stage+renal+disease-induced+hypercalcemia+may+promote+aortic+valve+calcification+via+Annexin+VI+enrichment+of+valve+interstitial+cell+derived-matrix+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physio%22%5BJournal%5D)">End stage renal disease-induced hypercalcemia may promote aortic valve calcification via Annexin VI enrichment of valve interstitial cell derived-matrix vesicles.</a> J Cell Physio. , (2017).</li>
<li>Tsang, H., et al. Exploiting novel valve interstitial cell lines to study calcific aortic valve disease. Mol Med Rep. , In press (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses ausführliche Protokoll beschreibt eine praktische Methode zur Erfassung von primären Ratte VICs, wodurch die Isolation dieser Zellen von Ratte Herzklappen durch enzymatische Verdauung. Unsere Methode weiter unterstützt und erweitert die Nutzung eines zuvor gemeldeten Ratte in Vitro Modell Aortenklappe Verkalkung13zu studieren. Die Isolierung von VICs von der Aortenklappe stellt das Potential für Verunreinigung von benachbarten VECs. Unsere Immunfluoreszenz Daten bestätigen jedoch, dass der erste Verdauung Schritt um die VECs Rendern die isolierten Zellen negativ für die Endothelzellen Marker, CD31 zu entfernen. Darüber hinaus bestätigt α-SMA Färbung den aktivierten Phänotyp VICs, was für Verkalkung12erforderlich ist.
VIC Isolationen zuvor gemeldet wurden großen Tiermodelle6,7,8. Diese Arten sind jedoch durch die genetischen und molekularbiologischen Werkzeugen für nachgeschaltete Studie sowie deren eingeschränkte Zugänglichkeit in den Labors auf der ganzen Welt zur Verfügung eingeschränkt. Im Gegensatz dazu sind solche Tools etabliert in leicht zugänglich Nagetiere und daher die Fähigkeit, Ratte abgeleitet VICs ermöglicht eine größere Kapazität der Versuchsplanung isolieren. Die Benutzung von VICs aus jungen Ratten bedeutet auch, dass die Zellen relativ mehr proliferative als ältere Ratten, erfordert daher weniger Tiere mehr Zellen zu liefern. Obwohl Mäuse ohne weiteres zugänglich sind, aber aufgrund von Mäusen vor allem kleinere Herzen, die Isolation der primäre Maustaste VICs wäre mehr Zeit in Anspruch und wesentlich mehr Tiere wäre erforderlich, um die gleiche Ausbeute an Zellen als die Rattenmodell zu isolieren.
Ein wesentlicher Vorteil dieser beschriebene Vorgehensweise ist, dass VICs zeitlich vom Wildtyp und transgene Ratten sowie Ratte Modelle von Herz-Kreislauf-Krankheiten und Ventil Verletzungen isoliert werden können. Mit der Rattenmodell würde erfordern eine größere Anzahl von Tieren für groß angelegte Versuche daher, um Tierversuche zu reduzieren, primäre Ratte VICs umgewandelt werden kann, um eine Zelllinie zu produzieren, sobald es gut charakterisiert worden ist.
Während die schweren klinischen Implikationen der CAVD allgemein anerkannt sind, müssen die zugrunde liegenden ursächlichen Mechanismen noch bestimmt werden. Darüber hinaus präsentieren wirksame Medikamente, die Therapien, die verhindern, dass potenziell heilen Verkalkung der Aortenklappe können nicht verfügbar sind. Die Kultur von VICs unter kalzifizierende Bedingungen bietet daher eine hochrelevante in Vitro Modell der CAVD. Wir zeigen, dass erhöhte Ca und Pi-Werte der in-vitro- Verkalkung der isolierten Ratte VICs mit einem gleichzeitigen Anstieg der Ausdruck der knochenbildenden Gen Marker Msx2, Alplund Phospho1induzieren. Weit feststeht, dass diese Marker des pathologischen Prozesses Gefäßverkalkung14,15,16zugeordnet sind. Unsere Daten zeigen also, dass die Kultur der Ratte VICs in Kalkschalen Medium ein geeignetes Modell zur Aortenklappe Verkalkung in-vitro-Studie. Aktuelle Studien aus unserem Labor verwendet in der Tat, haben dieses Modell zu zeigen, dass Ca Verkalkung der Aortenklappe durch Annexin VI Anreicherung von VIC abgeleitet Matrix Vesikel17fördert.
Trotz der Vorteile der Verwendung von Ratte VICs und deren effiziente Charakterisierung gibt es noch einige Einschränkungen. Zuerst, VIC Einwohnerzahl innerhalb Ratte Ventile ist sehr klein, und daher viele Tiere sind notwendig, um ausreichende Zellzahlen für umfangreiche in-vitro- Studien zu generieren. Es ist jedoch möglich, diese Beschränkung zu überwinden, indem Unternehmen Vorstudien in verewigt Ventil interstitielle Zelllinien, wie vor kurzem von uns18 berichtet, und anschließend mit Primärkulturen zu überprüfen und diese Erkenntnisse zu erweitern.
Zusammenfassend lässt sich sagen erklärt die beschriebene Methode erfolgreich isoliert, Kultur und Verkalkung der primären Ratte VICs, die anschließend bewertet werden kann, mit einer Vielzahl von Analysen sowie biochemischen Assays, Protein und RNA. Dieses Modell bietet eine zuverlässige und komfortable System, in dem CAVD in Vitrountersucht und stellt ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der molekularen Mechanismen für diese zerstörerische Krankheit verantwortlich.

Die gesunde Aortenklappe besteht aus drei Broschüren, die die Verteilung der mechanischen Beanspruchung beim Öffnen und Schließen des Ventils gleichmäßig aufgeteilt wird. Die Ventil-Broschüre hat eine definierte Struktur aus drei unterschiedlichen Schichten: die Fibrosa, Spongiosa und Ventricularis, welches Haus Ventil interstitielle Zellen (VICs) als die vorherrschenden Zelltyp. Diese drei Schichten sind eingeklemmt zwischen zwei Betten von Valve Endothelzellen (VECs)1.
VICs spielen eine entscheidende Rolle bei der Progression von Schulterarthrose Aortic Valve Verkalkung (CAVD), in der westlichen Welt die häufigste Herzklappenerkrankung. CAVD bezeichnet man als eine fortschreitende Erkrankung, die durch das Herzklappenfehler Gewebe und seine umliegenden Mikroumgebung aktiv geregelt ist. Zellveränderungen verursachen zunächst fibrotische Verdickung und schließlich eine umfangreiche Verkalkung der Aortenklappe Flugblätter. Dies führt dann zu erheblichen Aortenklappe Stenose und letztlich left ventricular Abfluß Obstruktion2, chirurgische Klappenersatz als die einzig mögliche Behandlung verlassen.
Die Pathophysiologie der CAVD ist komplex, aber ähnliche Mechanismen zur physiologischen Knochen Mineralisierung3teilt. Während eine Reihe von Studien die von VICs osteogene Trans-Differenzierung und Verkalkung4,5unterziehen bewiesen haben, die Mechanismen für diesen Prozess müssen erst noch vollständig aufgeklärt werden, Hervorhebung der entscheidende Voraussetzung für ein machbar und relevanten in-vitro- Modell der CAVD.
Frühere Arbeiten von verschiedenen Labors hat erfolgreich VICs von Schweinen und Rindern Modelle isoliert und kultiviert diese Zellen unter Bedingungen6,7,8Kalkseife. Aufgrund der Größe der Aortenklappe in diesen Modellen wurde Isolation von Zellen durch enzymatische Verdauung hochwirksame reine Bevölkerungen der Zellen zu generieren. Jedoch können diese Modelle aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit von molekulare Werkzeuge für große Tierarten restriktiv sein. Im Gegensatz dazu bleiben die Nager-Modelle vorteilhaft aufgrund der relativ geringeren Kosten, Potenzial für Genmanipulation und die umfangreiche Palette von molekulare Werkzeuge, die zur Verfügung stehen. Jedoch ist die Isolierung von VICs von kleiner Tiermodelle nicht weit verbreitet eingesetzt ist eine wahrscheinliche Folge der Schwierigkeiten bei der Arbeit mit kleinen Gewebeproben.
Dieses ausführliche Protokoll meldet eine umfassende Methode für die direkte Lokalisierung der Ratte VICs. Durch sorgfältige Präparation des Ventils, gefolgt von einer Reihe von enzymatischen Verdauung können VICs isoliert und in einer Vielzahl von experimentellen Techniken, einschließlich der Zelle Kultur, Verkalkung und gen Ausdruck eingesetzt werden. Dieses hochaktuellen in Vitro Modell der CAVD wird zweifellos einen wesentlichen Beitrag zur Erhöhung der unser Wissen über diesen pathologischen Prozess machen.

<table><tbody><tr><td>Sezierschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>Autoklav vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Feder gerade (8 mm Klinge)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15905</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch.</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas Schere (5 mm Klinge, 8 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14003</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch.</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette (11 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>Autoklav vor dem Gebrauch.</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>vor der Zugabe zum Nährmedium filtern.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td> In <td>destilliertem Wasser auf 70 % v/v verdünnen.</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1150PB17</td> Mit <td>destilliertem Wasser auf 0,6 M verdünnen.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UN1823</td><td>Mit destilliertem Wasser auf 0,1 M verdünnen.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>1/250 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungspuffer.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>1/250 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungspuffer.</td></tr><tr><td>Superscript II Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P/N58875</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18038026</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Borat/EDTA (TBE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9863</td><td>Verdünnen auf 1x mit vor Gebrauch entfeuchtetes Wasser.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16500</td><td>2% in 1x Tris/Borat/EDTA(TBE).</td></tr><tr><td>Lysepuffer (RIPA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 156472</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kolben</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>159920</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Platten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0990</td><td></td></tr><tr><td>Rat Msx2 Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT01084090</td><td></td></tr><tr><td>Rat Alpl Primer</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00190680</tr><tr><td>Ratte Enpp1 Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT00181426</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>Sigma</td><td>CLS430639</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Phosphat</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisches</td><td>Phosphat Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>5030</td><td>Mit 0,1 % NaOH auf 0,1 % verdünnen.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Mit PBS auf 4% verdünnen.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin rot S</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td>Mit destilliertem Wasser bis zu 2 % herstellen und auf pH 4,2 einstellen.</td></tr><tr><td>TGF&beta;-1 Primerpaar: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA</td><td>Verwendete Sigma-Konzentration</td><td></td><td>: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>TGF&beta;-2 Primerpaar: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGAGATGTTAG</td><td>Sigma</td><td></td><td>Verwendete Konzentration: 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-&beta;-Aktin&minus; Peroxidase-Antikörper, hergestellt in der Maus</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1/50000, Verdünnung in 5 % BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung + 0,1 % Tween (TBS/T).</td></tr><tr><td>Maus-Anti-Vimentin-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>v6389</td><td>1/900 Verdünnung in <stark>Antikörperverdünnungspuffer</stark> (1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,3% Triton X-100).</td></tr><tr><td>Maus-IgG</td><td>Sigma</td><td>I5381</td><td>Vor der Verdünnung in Antikörperverdünnungspuffer auf die gleiche Stammkonzentration wie Maus-Antivimentin-Antikörper verdünnt.</td></tr><tr><td>Kaninchen-IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX35035</td><td>Vor der Verdünnung in Antikörperverdünnungspuffer auf die gleiche Stammkonzentration wie Kaninchen-Anti-&Alpha;-Aktin-Antikörper für die glatte Muskelmuskulatur verdünnt.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-&Alpha;-Aktin-Antikörper für glatte Muskeln</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>1/200 Verdünnung in Antikörper-Verdünnungspuffer.</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>1/50 Verdünnung in 5% BSA inTBS/T.</td></tr><tr><td>HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Dako</td><td>P0448</td><td>1/3000 Verdünnung in 5% BSA in TBS/T.</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>41512862</td> Mit <td>destilliertem Wasser auf 425 U/ml einstellen und dann filtrieren.</td></tr><tr><td>SYBR grüner Mastermix</td><td>Primerdesign</td><td>PrecisionPLUS-MX-SY</td><td></td></tr><tr><td>Calcium-Assay-Kit</td><td>Randox</td><td>CA590</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein-Assay-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111 ECL-Reagenz</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2109</td><td></td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td>10600007</tr><tr><td>PCR-Leiter</td><td>Bioline</td><td>BIO-33057</td><td></td></tr><tr><td>Ladefarbstoff für die Gelelektrophorese</td><td>New England Biolabs</td><td>B7025S</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (0,22 &mu; m)</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser Wissenschaftlicher</td><td>Laborbedarf LTD</td><td>MIC3100</td><td></td></tr><tr><td>Hämatozytometer</td><td>Marienfeld Superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Kamera eingestellt für Alizarin rot Bilder:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Nikon D800</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionszange 10 cm, gebogene Enden</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td>Autoklav vor Gebrauch.</td></tr></tbody></table>

isolierung und charakterisierung von primären ratte ventil interstitielle zellen: ein neues modell zur verkalkung der aortenklappe

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Schulterarthrose Aortenklappe Krankheit (CAVD) zeichnet sich durch die fortschreitende Verdickung der Aortenklappe Flugblätter. Es ist eine Bedingung, die häufig bei den älteren und terminaler Niereninsuffizienz (ESRD) Patienten, leiden häufig unter Hyperphosphatämie und Hyperkalzämie gefunden. Derzeit gibt es keine Medikamente-Therapien, die ihr Fortschreiten aufhalten kann. Die Mechanismen, die diesen pathologischen Prozess zugrunde liegen bleiben unklar. Die Aortenklappe Broschüre besteht aus eine dünne Schicht aus Endothelzellen Ventil (VECs) an den Außenflächen der aortalen Höckern, mit Ventil interstitiellen Zellen (VICs) eingeklemmt zwischen den VECs. Die Verwendung von einem Rattenmodell ermöglicht die in-vitro- Studie ektopische Verkalkungen auf Basis der in Vivo pathophysiologischen Serum-Phosphat (Pi) und Kalzium (Ca) der Patienten, die leiden Hyperphosphatämie und Hyperkalzämie. Das beschriebene Protokoll beschreibt die Isolation einer reinen Ratte VIC Bevölkerung dargestellt durch die Expression von VIC Marker: Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA) Vimentin und Gewebe Wachstumsfaktor Beta (TGFβ) 1 und 2 und das Fehlen des Clusters der Differenzierung (CD) 31, eine VEC Marker. Durch den Ausbau dieser VICs, können biochemische, genetische und bildgebende Untersuchungen durchgeführt werden, um zu studieren und die wichtigsten Vermittler zugrunde liegenden CAVD zu entwirren.

Das Ziel dieses Protokolls war zu beschreiben, die Isolation der primären Ratte VICs und Kultur sie für in-vitro- Experimente der Verkalkung. Durch den Einsatz der oben beschriebenen Methode, Ratte VICs erfolgreich isoliert und für die Erforschung der Mechanismen verantwortlich für CAVD erweitert.
Ratte primäre VICs gemeinsam mit etablierten VIC Marker zu lokalisieren:
Der VIC-Phänotyp der isolierten Zellen wurde bestätigt durch Immunfluoreszenz durch Sondierung für den VIC-Marker: Vimentin und α-SMA (rot und grün, bzw. Abbildung 1A), und ist in Übereinstimmung mit früheren Berichte11,12. Die repräsentative Negativkontrollen mit nicht konjugiert Maus und Kaninchen IgG sind in Abbildung 1 bdargestellt. Darüber hinaus wurde der Ausdruck des VIC-Wachstumsregulator TGFβ-1 und TGFβ-2 bestätigt mittels PCR-Analyse (Abbildung 1). Um zu bestätigen, dass die isolierte Ratte primäre VICs waren frei von endothelialen Verunreinigungen, Western-Blot Analyse wurde durchgeführt, um zu überprüfen, diese Ratte waren VICs negativ für die Endothelzellen Marker, CD31, Eckzahn mitral VECs als Positivkontrolle ( mit Abbildung 1).
Ca und Pi induzieren Ratte VIC Verkalkung:
Erhöhte systemischen Ca und/oder Pi Konzentrationen fahren in der Regel die Verkalkung der VICs in Vitro. Um das Potenzial der Verkalkung der isolierten Ratte VICs zu schätzen, waren die Zellen ausgesetzt erhöhten Ca und Pi, die pathologische Bedingungen Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie ESRD-Patienten zu imitieren. Behandlung von VICs mit 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induzierte Verkalkung, wie bestimmt durch Alizarin Rot S Färbung für Ca Ablagerung (Abbildung 2A) und farbmetrische Bestimmung der Ca nach HCl Auswaschung (81 Falte; p < 0,05 mit der Student t-Test; Abbildung 2 b).
Veränderungen der Genexpression VIC Verkalkung zugeordnet:
Die Verkalkung der vaskulären Zellen in Vitro ist eine deutliche molekulare Profil zugeordnet. In der vorliegenden Studie, die Behandlung von VICs mit 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi induziert eine deutliche Zunahme der mRNA Ausdruck der knochenbildenden Marker: Msh Homeobox 2, Msx2 (2,04 Falte ändern; p < 0,01; ( Abbildung 3A), alkalische Phosphatase, Alpl (1,49 Falte ändern; p < 0,001; Abb. 3 b), und Phosphoethanolamine/Phosphocholin Phosphatase, Phospho1 (4.7 Falte ändern; mit One-Way ANOVA p < 0,01; Abbildung 3). Der Ausdruck der knochenbildenden Marker, Runx2und Verkalkung Inhibitor Ectonucleotide Pyrophasphatase, Enpp1, blieb jedoch unverändert (Abbildung 3D–E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig1.jpg"> Abbildung 1: Ausdruck von VIC Markern. (A) Immunfluoreszenz zeigt doppelte Färbung und NS1 der Alpha-Glattmuskel Aktin (α-SMA; grün) und Vimentin im Ventil interstitiellen Zellen (VICs). (B) repräsentatives Bild der Negativkontrollen mit Maus und Kaninchen IgG. Kerne sind in blau mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) gefärbt. Maßstabsleiste = 50 µm. (C) das Vorhandensein der Umwandlung Wachstumsfaktor Beta 1 (TGFβ-1) und TGFβ-2 in VICs (Bahnen 1 - 3) Dargestellt durch PCR-Analyse. Bahn 4 ist das Wasser-Steuerelement. Referenz-gen verwendet wurde Gapdh. (D) Western-Blot Analyse zeigt den reichlichen Ausdruck von CD31 in Eckzahn Mitralklappe Endothelzellen (VECs) im Vergleich zu keinen Ausdruck in VICs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig2.jpg"> Abbildung 2. In-vitro- Verkalkung der Ratte VICs. Ca-Ablagerung in VICs behandelt mit 2,7 mM Ca/2.5 mM Pi bestimmt: (A) Foto zeigt Alizarin Rot S ganze Zelle Monoschichten in den Brunnen und (B) farbmetrische Bestimmung der Ca nach HCl Auslaugung Färbung. Der Student t-Test wurde durchgeführt, um die Bedeutung zwischen den beiden Gruppen zu analysieren. Ergebnisse werden wie meine ± S.E.M *p < 0,5 verglichen mit Kontrolle; (n = 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56126/56126fig3.jpg"> Abbildung 3. Veränderungen der Genexpression mit VIC Verkalkung verbunden. Falte in der mRNA Expression von knochenbildenden Marker zu ändern, (A) Msx2, (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2und (E) Enpp1 in VICs behandelt mit 2,7 mM Ca/2.5 mM für Pi 48 h. mRNA Ausdruck erscheint als Falte Änderung im Vergleich zu den endogenen Referenz-gen Gadph. Einfache ANOVA mit allgemeines lineares Modell mit paarweisen Vergleiche wurde durchgeführt, um die Bedeutung zwischen mehreren Gruppen zu analysieren. Ergebnisse werden wie meine ± S.E.M **p < 0,01; p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle; (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56126/56126fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anzahl der Klappensegel</td>
			<td>Kultur-Platte/Kolben</td>
		</tr>
<tr>
<td>9 bis 15</td>
			<td>1 in 12-Well-Platte</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 bis 30</td>
			<td>1 in 6-Well-Platte</td>
		</tr>
<tr>
<td>30 +</td>
			<td>T25</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Allgemeine Richtlinien für die Anzahl der Prospekte für die erste Aussaat erforderlich.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, die Kultur und die Verkalkung der Ratte abgeleitet Ventil interstitiellen Zellen, ein höchst physiologischen in Vitro Modell der Schulterarthrose Aortenklappe Krankheit (CAVD). Ausbeutung von diesem Rattenmodell erleichtert die CAVD Forschung in der Erforschung der Zelle und der molekularen Mechanismen, die diese komplexen Krankheitsgeschehen zugrunde liegen.

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, Rattenklappen-interstitielle Zellen oder VICs zu isolieren, um die Mechanismen der kalkifizierenden Aortenklappenerkrankung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Klappenverkalkung zu beantworten, beispielsweise warum sich VICs verkalken und was wir tun können, um diese Zellen an der Verkalkung zu hindern. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen in der einfachen Zugänglichkeit und dem Potenzial, Zelllinien für weitere Studien zu erzeugen.Führen Sie alle Dissektionen in einer belüfteten Abzugshaube durch, die zuvor mit 70 % Ethanol desinfiziert wurde, um die Sterilität der Proben und Reagenzien sicherzustellen. Sterilisieren Sie die Dissektionswerkzeuge, indem Sie sie autoklavieren, und tauchen Sie anschließend die Spitzen der Werkzeuge vor Gebrauch in ein Becherglas mit 70 % Ethanol. Lassen Sie die Dissektionswerkzeuge in Bechergläsern mit Waschpuffer einweichen, bevor sie mit dem Tier oder den Geweben in Kontakt kommen.Nachdem die Ratten wie im Textprotokoll beschrieben getötet wurden, legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Glas-Präparationsbrett und desinfizieren Sie die Haut durch Besprühen mit 70 % Ethanol. Um das Herz zu entnehmen, führen Sie mit Hilfe einer Präzisionsschere einen vier Zentimeter langen Schnitt in der Mittellinie der Ratte durch, um die Bauchhöhle freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig das Rippengeflecht und die Lungen, um das Herz freizulegen. Entfernen Sie das Herz mit einem Paar scharfer Scheren.Bewahren Sie das präparierte Herz in eiskaltem Waschpuffer auf, bis alle makroskopischen Präparationen der Ratten abgeschlossen sind. Um jedes Herz mikroskopisch zu präparieren, überführen Sie das präparierte Herz in eine mit Waschpuffer bedeckte Petrischale. Beschneiden Sie das Herzmuskelgewebe mit einer geraden Feder-Schere, sodass ein kleiner Bereich um die aufsteigende Aorta und die Aortenwurzel verbleibt.Öffnen Sie mit derselben chirurgischen Schere vorsichtig die aufsteigende Aorta in Richtung des linken Ventrikels und legen Sie die Aortenklappenblätter frei. Überführen Sie anschließend die geöffnete Aorta in eine frische, sterile Petrischale, die mit Hank's Balanced Salt Solution gefüllt ist. Präparieren Sie mit einer Vannas-Schere die Aortenklappenblätter aus, die sich an ihrer charakteristischen U-Form an der Basis der Aorta erkennen lassen.Lagern Sie alle Segel in einem Milliliter eiskaltem Waschpuffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, bis alle Dissektionen abgeschlossen sind. Sobald alle Segel gewonnen wurden, zentrifugieren Sie sie bei 100 × g für eine Minute bei vier Grad Celsius, um den Waschpuffer zu entfernen. Um die Klappenendothelzellen oder VECs zu entfernen, verdauen Sie die Segel in 100 Mikrolitern 425 Einheiten pro Milliliter Collagenase II für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.Lösen Sie die Verdauung auf, indem Sie vorsichtig mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf- und abpipettieren. Zentrifugieren Sie 30 Sekunden bei 100 × g, um die Blättchen zu pelletieren. Nach dem vorsichtigen Entsorgen des Überstandes waschen Sie die Blättchen mit 500 Mikrolitern Waschpuffer und pelletieren die Zellen erneut durch Zentrifugation bei 100 × g für 30 Sekunden.Um die VICs aus den Segeln zu gewinnen, mit 100 Mikrolitern der Kollagenase II für 1,5 bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius verdauen. Setzen Sie die VICs anschließend durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze frei. Verdünnen Sie die Kollagenase II in 19 Milliliter Kulturmedium und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 670 × g, um die VICs und verbleibende Klappensegel-Rückstände zu pelletieren.Nach dem Verwerfen des Überstandes die Segel und die VICs in Kulturplatten oder -kolben überführen. Die VICs fünf bis sieben Tage im Kulturmedium bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % CO2 bis zur Konfluenz kultivieren, wobei das Medium nach 72 Stunden gewechselt wird. Um primäre VICs von Ratten für In-vitro-Kalzifikationsexperimente vorzubereiten, die Zellen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Vertiefung in Sechs-Loch-Platten ansäen.Kultivieren Sie die Zellen im Kulturmedium, bis eine Konfluenz von mehr als 90 % erreicht ist. Behandeln Sie die VICs mit einem Verkalkungs- oder Kontrollmedium und inkubieren Sie sie für weitere 72 Stunden bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % CO2. Um die verkalkten primären VICs der Ratte für nachfolgende Downstream-Analysen zu untersuchen, entfernen Sie das Verkalkungs- oder Kontrollmedium.Spülen Sie die Zellschichten mit Waschpuffer, um nicht gebundene Calcium- und Phosphationen zu entfernen, bevor die Charakterisierung der VICs der Ratte gemäß dem schriftlichen Protokoll durchgeführt wird. Für Kalzifizierungsstudien an VICs der Ratte färben Sie die Zellschichten mit 5 %iger Alizarinrot-S-Lösung unter vorsichtigem Schütteln für 20 Minuten. Anschließend waschen Sie dreimal mit destilliertem Wasser je fünf Minuten lang.Um die Kalziumablagerung zu quantifizieren, verwenden Sie ein biochemisches Kalzium-Assay-Kit. Lösen Sie Kalziumionen mit 0,6 molarer Salzsäure über 24 Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Kalziumkonzentration mit einem Kalzium-Assay-Kit gemäß den Herstelleranweisungen.Berechnen Sie abschließend die Kalziumkonzentration als Bruchteil des gesamten zellulären Proteins, wie im Textprotokoll beschrieben. Das VIC-Phänotyp der isolierten Zellen wurde mittels Immunfluoreszenz bestätigt, wobei auf die VIC-Marker Vimentin und alpha glatte Muskel-Aktin getestet wurde. Zusätzlich wurde die Expression des VIC-Wachstumsregulators, des Gewebewachstumsfaktors Beta-1 und 2, mittels PCR-Analyse überprüft.Mittels Western Blot-Analyse wurde außerdem überprüft, ob die VICs der Ratte negativ für das Endothelzell-Markerprotein CD 31 waren, wobei canine mitrale VECs als positiver Kontrollansatz dienten. Die VICs der Ratte wurden erhöhten Konzentrationen an Calcium und Phosphat ausgesetzt, die pathologische Zustände der Hyperkalzämie und Hyperphosphatämie nachahmen. Die Behandlung der VICs mit Calcium und Phosphat induzierte eine Verkalkung, wie durch Alizarinrot-Färbung zur Detektion von Calciumablagerungen sowie durch eine farbmetrische Bestimmung der Calciumkonzentration nach Salzsäure-Auszug festgestellt wurde.Die Behandlung von VICs mit Calcium und Phosphat führte zu einem signifikanten Anstieg der mRNA-Expression der osteogenen Marker MSX2, ALPL und PHOSPHO1. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, ausgenommen die Verdauung von 18 Herzklappenblättchen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Sterilität während der Dissektion und Verdauung sicherzustellen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre VICs aus Ratten isoliert und sie verwendet, um die Mechanismen hinter der VIC-Kalzifizierung zu untersuchen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Durchflusszytometrie und mikroskopische Analysen durchgeführt werden, um die Physiologie und das Verhalten von VICs zu studieren. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik für Forscher auf dem Gebiet der kardiovaskulären Forschung den Weg ebnen, die Mechanismen der Aortenklappenklassifizierungen beim Menschen unter Verwendung des Rattenmodells zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von reinen Populationen von Herzklappen-Endothelzellen (VEC). VEC von beiden Seiten der Höcker oder Prospekt isoliert werden können und unmittelbar nach ist zugrundeliegenden interstitiellen Zellen (VIC) Isolierung einfach.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von interstitiellen Zellen der Aortenklappe aus dem Herzen einer erwachsenen Maus mit einem zweistufigen Kollagenase-Verfahren und deren anschließende Kultivierung in einem geringen Volumen an Wachstumsmedien.

Isolierung von interstitiellen Zellen der Mausklappe: Eine enzymatische Methode zur Isolierung und Kultivierung von VICs aus der Aortenklappe der Maus

Dieses Video zeigt eine Assay-Technik zur Beurteilung der Verkalkung der interstitiellen Zellen der Aortenklappe in vitro. Der Assay hilft bei der Quantifizierung der Calciumkonzentration mit dem Arsenazo III-Reagenz, einem calciumsensitiven Farbstoff, der mit Calciumionen reagiert und einen violett gefärbten Calcium-Arsenazo-Komplex bildet.

Kalzifizierungsassay zur Messung der Kalziumkonzentration in interstitiellen Zellen der Aortenklappe

Die Fähigkeit, Herzklappen-Endothelzellen (VECs) zu isolieren, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen der Klappenentwicklung, -erhaltung und -erkrankung.  Hier beschreiben wir die Isolierung von VECs aus embryonalen und adulten Tie2-GFP-Mäusen mittels FACS, die Studien zur Bestimmung des Beitrags von VECs zu Entwicklungs- und Krankheitsprozessen ermöglichen wird.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Gefäßverkalkung ist ein wichtiger Prädiktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen und trägt dazu bei. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Induktion der Verkalkung von kultivierten primären vaskulären glatten Muskelzellen und zur Quantifizierung der Verkalkung und Makrophagenbelastung in tierischen Aorten mittels Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung.

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme menschlicher Aortenklappen, die während chirurgischer Aortenklappenersatzverfahren oder aus Leichengewebe extrahiert werden, und die anschließende Isolierung, Expansion und Charakterisierung patientenspezifischer primärer Klappenendothel- und interstitieller Zellen. Enthalten sind wichtige Details zu den Prozessen, die erforderlich sind, um die Zelllebensfähigkeit und Phänotypspezifität sicherzustellen.

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Transplantation von Aortenklappenblättchen unter die Nierenkapsel, um die Alloreaktivität von Herzklappen untersuchen zu können.

Ein vereinfachtes Modell für die heterotope Herzklappentransplantation bei Nagetieren

Ein geeignetes Tiermodell ist erforderlich, um die pathologischen Mechanismen, die der Aortenklappenstenose (AVS) zugrunde liegen, zu verstehen und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Entwicklung des AVS-Kaninchenmodells über eine direkte Ballonverletzung in vivo.

Ein Modell der Aortenklappenstenose eines Kaninchens, das durch eine direkte Ballonverletzung induziert wird

Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung primärer Ratten-Ventil-Interstitialzellen (VICs) zur Untersuchung der Mechanismen der verkalkenden Aortenklappenkrankheit. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Verkalkungsprozesse in vitro.

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe (Video) | JoVE Journal

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

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