Messung In Vivo Veränderungen der extrazellulären Neurotransmitter während natürlich lohnende Verhaltensweisen in weiblichen syrischen Hamster
12. September 2017
Dieses Papier beschreibt behoben-Potential amperometrischen Bildaufzeichnungen mit Kohlefaser-Elektroden und enzymatische Biosensor-Technologie zur Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat mit hoher zeitlicher Auflösung während natürliche lohnende Verhalten in der weibliche Hamster.
Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, die Neurotransmitterfreisetzung bei wach verhaltenden Tieren zu messen. Obwohl dieses Video die Anwendung in den Verhaltensneurowissenschaften demonstriert und die Möglichkeit bietet, die spezifische Freisetzung von Neurotransmittern in Bezug auf bestimmte Verhaltensereignisse zu charakterisieren, kann diese Technik in einer Vielzahl anderer neurowissenschaftlicher Teildisziplinen eingesetzt werden, z. B. bei der Injektion von Medikamenten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern nahezu in Echtzeit in vivo messen kann.
Beginnen Sie damit, vier Stunden vor der Einführung des Mannes 500 Mikrogramm Progesteron in 0,1 Milliliter Baumwollsamenöl subkutan zu injizieren, um die sexuelle Empfänglichkeit zu induzieren. Achten Sie darauf, jedes Tier zu Beginn der dunklen Phase seines täglichen Zyklus zu testen, da sich das Sozialverhalten von Nagetieren unter Testbedingungen mit weißem und rotem Licht verändert. Machen Sie die Kalibrierlösungen am Tag der Prüfung in 20-Milliliter-Glaszentrifugenröhrchen frisch.
Für die Analytlösung lösen Sie 7,4 Milligramm L-Glutaminsäure in 10 Millilitern Reinstwasser, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen. Stellen Sie dann die Interferenzlösung her, indem Sie 176,1 Milligramm AA in 10 Millilitern ultrareinem Wasser auflösen. Richten Sie die Kalibrierung ein, indem Sie einen Magnetrührer auf die Basis eines einfachen Laborringständers stellen.
Setzen Sie einen 20-Milliliter-Becher mit Mantel auf den Magnetrührer und klemmen Sie ihn mit einer mittelgroßen zweipoligen Klemme fest. Schließen Sie das ummantelte Becherglas an ein zirkulierendes Wasserbad an, um die Pufferlösung auf 37 Grad Celsius zu erhitzen. Geben Sie einen magnetischen Rührstab und 20 Milliliter 100 Millimolar phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in das ummantelte Becherglas.
Setzen Sie anschließend den Sensorkalibrierungshalter auf den ummantelten Becher und setzen Sie einen vierkanaligen Kalibriervorverstärker darauf ein, den Sie mit einer rechtwinkligen Klemme befestigen. Schließen Sie dann den Vorverstärker an ein Datenaufbereitungs- und -erfassungsgerät an, um Kalibrierdaten aufzuzeichnen. Testen Sie die Empfindlichkeit jedes enzymatischen Biosensors gegenüber Glutamat vor der experimentellen Aufzeichnung, indem Sie die Sonde in den Kalibrierhalter auf einem ummantelten Becherglas platzieren und den Messhohlraum und einen Teil des Silberchlorid-Referenzdrahts in die Pufferlösung eintauchen.
Starten Sie eine neue Aufnahme auf der Computeroberfläche mit kostenlos herunterladbarer Aufnahmesoftware. Schließen Sie dann jeden zu testenden Sensor an einen Anschluss an einem vierkanaligen Kalibriervorverstärker an. Lassen Sie die Sensoren eine stabile Basislinie erreichen.
Beginnen Sie mit der Zugabe der Analyt-Injektionen, wenn die Sensoren einen stabilen Ausgangswert erreicht haben. Verwenden Sie das Loch im Kalibrierhalter, um eine Pipettenspitze in die Pufferlösung einzuführen. Verwenden Sie dann das Schnelltasten-Anmerkungstool in der Aufnahmesoftware, um zu kommentieren, wann eine Injektion vorgenommen wird.
Nehmen Sie als Nächstes 10 mikromolare Injektionen von Glutamat vor, indem Sie 40 Mikroliter der Analytlösung in die Pufferlösung pipettieren. Warten Sie, bis sich der Sensor zwischen den Zugaben stabilisiert hat. Fügen Sie dann drei Injektionen der Analytlösung hinzu, bevor Sie eine einzelne Injektion aus der interferenten AA-Lösung hinzufügen.
Die Testkammer mit Einstreu auskleiden, die aus dem Heimkäfig des Tieres entnommen wurde. Entfernen Sie den okklusiven Obdurator aus der Führungskanüle und führen Sie entweder die Kohlefaserelektrode oder die enzymatische Sonde durch den Führungsschaft ein. Verbinden Sie den Sensor mit dem Aufzeichnungssystem.
Stabilisieren Sie dann die Sensorverbindung, indem Sie einen Stiftaufsatz auf die Kopfhalterung schrauben. Setzen Sie das Tier dann in die Versuchskammer. Beginnen Sie mit der Aufnahme des Video- und zeitgesperrten amperometrischen Signals im Softwareprogramm.
Lassen Sie den Sensor im Gehirn äquilibrieren, bevor Sie ihn experimentell testen. Führen Sie dann einen männlichen Stimulus in die Testkammer ein. Nach der ersten Halterung mit Peniseinführung durch den Stimulus-Mann wird die Aufzeichnung je nach experimentellem Ziel für weitere 10 bis 30 Minuten fortgesetzt.
Trennen Sie schließlich nach dem Verhaltenstest den weiblichen Sensor. Nehmen Sie beide Hamster aus der Testkammer sowie aus der Einstreu, um die Kammer mit 70 % Ethanol zu reinigen. Beginnen Sie damit, die Videos mit kostenloser, kommerziell herunterladbarer Software in Zeitlupe anzusehen und zu kommentieren, um die Zeit, die an das amperometrische Signal gebunden ist, präzise zu codieren.
Kommentieren Sie die Lordose im Bild, wenn das Weibchen eine Dorsalflexion seines Rückens einleitet und seinen Schwanz nach oben ablenkt. Annotieren Sie die Endlordose, wenn das Weibchen diese Haltung beendet, was häufig der Fall ist, wenn sich das Weibchen an eine andere Stelle in der Testkammer zurückversetzt. Kommentieren Sie dann AI starten, wenn sich das Weibchen in der Lordose-Haltung befindet und das Männchen seine Schnauze in Richtung der anogenitalen Region des Weibchens bewegt, wo es zu Schnüffeln, Lecken oder Knuddeln in der Dammregion kommen kann.
Annotation "KI beenden", wenn das Männchen seine Schnauze aus der Nähe der anogenitalen Region des Weibchens entfernt. Als nächstes kommentieren Sie Start Mount, wenn sich das Männchen nähert und seine Vorderpfoten in einer Aufstiegshaltung auf das Weibchen legt, unabhängig von der Ausrichtung des Aufstiegsversuchs. Kommentieren Sie ebenfalls Start Intromission, wenn ein erfolgreicher Stoß dem berittenen männlichen Penis Zugang zur Vagina der Frau verschafft.
Gegebenenfalls wird das Ejakulat annotiert, was durch eine Trittbewegung mit dem Hinterfuß des Männchens bemerkt werden kann. Zu guter Letzt kommentieren Sie End Intromission und End Mount gleichzeitig im Bild, wenn das Männchen seine vorderen beiden Pfoten entfernt hat und somit keinen Kontakt mehr mit dem Weibchen hat. Da er häufig nicht in der Lage ist, seinen Rückzug zu visualisieren, kodieren Sie diese beiden Verhaltensweisen gleichzeitig, um Konsistenz und Zuverlässigkeit über die Paarungskämpfe hinweg zu gewährleisten.
Wählen Sie auf der Registerkarte Datei die Funktion Exportieren und wählen Sie die Registerkarte TSV, um die Spannungsmessungen als TSV-Erweiterungsdatei zu speichern. Öffnen Sie jede Datei mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und speichern Sie sie als XLS/XLSX. Fügen Sie schließlich manuell Anmerkungen für den Beginn der Lordose vor der Paarung hinzu, während gleichzeitig mit dem Beginn des Lordoseverhaltens, das auch ein Reitverhalten umfasst, und auch zu Beginn eines neuen Paarungskampfes, wenn das Weibchen in der Lordosehaltung bleibt.
Während der Paarungskämpfe kommt es während des vaginalen Einführens oder Unterbrechens durch das Männchen zu einer dopaminergen Vergänglichkeit im Nucleus. Ein ähnliches Muster wurde bei anderen Tieren in Bezug auf die Freisetzung von Glutamat beobachtet. Mit schneller Vergänglichkeit, die einzelnen Intervallen im Kern des Nucleus accumbens dorsalis während eines Kopulationsanfalls entspricht.
Einmal gemeistert, kann diese Technik, ohne die vorbereitenden sterotaktischen Operationen, an einem Tag abgeschlossen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sicherzustellen, dass jeder Sensor funktionsfähig ist. Obwohl dieses Video eine Aufzeichnung mit einer einzelnen Sonde zeigt, kann dieser Ansatz auf eine gleichzeitige Dual-Aufzeichnung erweitert werden.
Aber das fügt eine Komplexitätsebene hinzu, die nicht trivial ist. Dieses Video wird unter Lichtbedingungen gezeigt, um eine gute Sichtbarkeit zu gewährleisten. Wir führen unsere Verhaltensexperimente jedoch unter dunklen Bedingungen durch, und dieser Parameter kann je nach experimentellem Bedarf verändert werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die anschließende histologische Analyse von Hirnschnitten, durchgeführt werden, um die genaue Platzierung des Sensors zu identifizieren und zu bestätigen. Zusätzlich kann eine weitere Datenanalyse unter Verwendung der kodierten Verhaltensdaten unter Berücksichtigung aller relevanten Parameter durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um die Freisetzung von Neurotransmittern zu erforschen, einschließlich nicht-elektroaktiver Neurotransmitter wie Glutamat nahezu in Echtzeit bei wach verhaltenden Tieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man glutamaterge Sonden kalibriert, Sonden implantiert, ein Verhaltensexperiment durchführt, um Veränderungen der Neurotransmitterfreisetzung an verschiedene Komponenten des Verhaltens zu messen, und diese Daten für die nachfolgende Analyse zu kodieren. Vergessen Sie nicht, dass Sie bei der Arbeit mit lebenden Tieren sensibel auf deren Komfort und allgemeines Wohlbefinden achten sollten, um Ihre besten Ergebnisse und die der Tiere zu erzielen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat während natürlichen belohnenden Verhaltens bei weiblichen Hamstern mittels amperometrischer Aufzeichnungen mit festem Potential und enzymatischer Biosensortechnologie. Die Methode ermöglicht eine hohe zeitliche Auflösung der Neurotransmitterdynamik bei wachen, verhaltensaktiven Tieren und liefert Einblicke in die Verhaltensneurowissenschaften.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Verhaltensneurowissenschaften
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Dopamin und Glutamat spielen entscheidende Rollen bei Belohnungsmechanismen.
- Die Messung der Neurotransmitterfreisetzung kann zum Verständnis des Verhaltens beitragen.
- Technologien mit hoher zeitlicher Auflösung verbessern die experimentelle Genauigkeit.
Zweck der Studie
- Die Freisetzung von Neurotransmittern in Bezug auf bestimmte Verhaltensereignisse zu charakterisieren.
- Die Verhaltensantworten während der Paarung bei weiblichen Hamstern zu untersuchen.
- Die Nützlichkeit der enzymatischen Biosensortechnologie bei wachen Tieren zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Zu den Techniken gehörten amperometrische Messungen bei festgelegtem Potential unter Verwendung von Kohlenstofffaserelektroden.
- Der experimentelle Aufbau umfasste die Überwachung des responsiven Verhaltens bei weiblichen Hamstern nach hormonell induzierter sexueller Empfänglichkeit.
- Zu den wichtigsten Arbeitsschritten gehörte die Vorsicht bei der Lichtexposition sowie die rechtzeitige Kalibrierung der Sensorsysteme.
- Die Verhaltensbeobachtungen wurden mit den amperometrischen Signalen synchronisiert, um eine präzise Analyse zu ermöglichen.
Hauptergebnisse
- Die Studie beschreibt wirksam die Freisetzung von Neurotransmittern während Fortpflanzungsverhaltens und hebt dabei die zeitlichen Dynamiken hervor.
- Insbesondere wurden Erkenntnisse über die Transienz von Dopamin im Zusammenhang mit der Fortpflanzung berichtet.
- Die Verhaltensannotationen lieferten klare Korrelationen zwischen physiologischen Messgrößen und beobachteten Handlungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Arbeit beschreibt eine zuverlässige Methode zur Aufzeichnung von Neurotransmitterdynamiken während des Verhaltens.
- Das Verständnis des Zeitpunkts der Neurotransmitterfreisetzung vertieft die Erkenntnisse über Fortpflanzungsverhalten.
- Diese Ergebnisse könnten zu weiterführenden Anwendungen in der Verhaltensneurowissenschaft beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Messung der Dynamik von Neurotransmittern in Echtzeit während natürlicher Verhaltensweisen ermöglicht eine mechanistische Absicherung von Target-Hypothesen in der Forschung zu Belohnungswegen. Dieser Ansatz unterstützt eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, indem neurochemische Veränderungen mit spezifischen Verhaltensereignissen verknüpft werden. Die Technologie fördert eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung von zentralnervösen System modulierenden Substanzen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem Dopamin- und Glutamat-Transienzen mit spezifischen Verhaltensereignissen wie vaginaler Penetration korreliert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch gleichzeitige Messung elektroaktiver und nichtelektroaktiver Neurotransmitter in wachen, verhaltensaktiven Modellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem quantitative, zeitlich synchronisierte neurochemische Messgrößen bereitgestellt werden, die den Wirkmechanismus während belohnungsbezogener Verhaltensweisen verdeutlichen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte Biosensorsysteme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem Kalibrierungsprotokolle für die Glutamat- und Dopamindetektion etabliert werden.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch Amperometrie mit festgelegtem Potential und enzymatische Biosensorik mit temperaturgeregelten Puffersystemen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen Verhaltensparadigmen aufgrund eines einfachen Sensorvorbereitungs- und Datenakquisitionablaufs.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Wert: Demonstriert die Anwendbarkeit des Systems in der Krankheitsforschung, indem die Freisetzung von Neurotransmittern während natürlich belohnenden sexuellen Verhaltens bei weiblichen Hamstern gemessen wird.
- Präklinische Kontinuität: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem neurochemische Transienzen mit spezifischen Phasen des Paarungsverhaltens korreliert werden (z. B. Eindringen, Ejakulation).
- Mechanistische Risikominimierung: Verringert Unklarheiten bezüglich der Zielstrukturen durch direkte, echtzeitnahe Messung der Neurotransmitterdynamik in vivo.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie zeitlich präzise, mit dem Verhalten verknüpfte neurochemische Daten liefert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Messung der Freisetzung von Dopamin und Glutamat während spezifischer Verhaltensphasen im Nucleus accumbens.
- Screening: Stellt die Bereitschaft des Assays sicher, indem ein stabiler Grundwert etabliert und die Injektion von Analyten vor der Verhaltensaufzeichnung validiert wird.
- Analytik: Erzeugt quantitative, zeitlich synchronisierte Messungen, die den Vergleich neurochemischer Reaktionen unter verschiedenen Verhaltensbedingungen und experimentellen Gruppen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit präklinischer Arbeit, indem die Anwendbarkeit in einem natürlichen, belohnungsbezogenen Verhaltensparadigma nachgewiesen wird, das für motivationale und Belohnungsschaltkreise relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Methode zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die Neurotransmitterfreisetzung in mehreren Verhaltensmodellen und Studien zur Wirkstoffverabreichung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Zuversicht bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unschärfen durch direkte Messung der Transienz von Neurotransmittern verringert werden.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch kalibrierte enzymatische Biosensoren und Amperometrie mit festgelegtem Potential unter Temperaturkontrolle.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem neurochemische Daten bereitgestellt werden, die zeitlich mit dem Verhalten verknüpft sind und Zielbindung sowie Pfadmodulation klären.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung, indem neurochemische Dynamiken mit spezifischen Verhaltensausgängen verknüpft werden, wodurch das biologische Risiko in der späten Phase der CNS-Wirkstoffentwicklung verringert wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in stereotaktischer Chirurgie, Sensor-Kalibrierung und Methoden der Verhaltensneurowissenschaften.
- Benötigt Instrumentierung, einschließlich Geräte zur Datenaufnahme und -aufbereitung, zirkulierende Wasserbäder zur Aufrechterhaltung von 37 °C für Pufferlösungen und Vierkanal-Vorverstärker.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Sensorpräparation, den Protokollen zur Verhaltensannotation und den Verfahren zum Datenexport (von TSV zu XLS/XLSX).
- Schließt Anpassungsaspekte bei verschiedenen Modellsystemen ein, wie beispielsweise Testbedingungen unter Licht/Dunkel-Zyklen und Hormon-Priming-Protokolle.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Stabilitätsdauer der Sensoren, die Notwendigkeit einer funktionellen Validierung vor der Aufnahme sowie eine erhöhte Komplexität bei gleichzeitiger Aufnahme mit zwei Sonden.
