Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, zu beschreiben, wie Bakteriophagen aus ihrem Genom mit Hilfe eines rein E.coli-zellfreien Transkriptionstranslationssystems synthetisiert werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der synthetischen Biologie zu beantworten, wie z.B. die Aufklärung der molekularen Selbstorganisationsmechanismen in lebenden Systemen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Vielseitigkeit der Plattform.

Viele biologische Systeme können für die experimentelle Analyse vollständig rekapituliert und fein abgestimmt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Phagenplaques, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie das Ende einer sterilen Pasteurpipette, um eine einzelne Plaque zu entkernen und zu entfernen.

Blasen Sie die Plaque in die verdünnten Zellen. Dann zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um auf eine vollständige Infektion zu testen, nehmen Sie eine 500-Mikroliter-Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Mikroliter Chloroform hinzu.

Wirbeln Sie die Mischung sofort mit hoher Geschwindigkeit und beobachten Sie, ob sich die Lösung klärt, was auf eine Phageninfektion hinweist. Sobald die Zellen vollständig infiziert sind, inkubieren Sie weitere zwei Stunden. Fügen Sie anschließend DNase hinzu, bevor Sie die Zellen bei 8.000 g und vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 10 Millilitern 1X Tris-Magnesiumchlorid. Fügen Sie 500 Mikroliter Chloroform hinzu und wirbeln Sie sie mit hoher Geschwindigkeit auf, um die Zellen zu lysieren. Durch Zentrifugieren bei 12.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius klären.

Anschließend wird der Überstand in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umgefüllt und bei vier Grad Celsius gelagert. Bereiten Sie vier Saccharosegradienten von fünf bis 45 % vor, indem Sie 2,5 Milliliter 45 %ige Saccharose in vier Ultrazentrifugenröhrchen pipettieren. Bedecken Sie die Schicht mit etwa 2,6 Millilitern 5%iger Saccharose und stoppen Sie, wenn die Flüssigkeit zwei Millimeter vom Rand des Rohrs entfernt ist.

Mischen Sie die Farbverläufe durch Drehung des Kipprohrs mit einem Gradientenformungsinstrument für 43 Sekunden bei 86 Grad und 23 U/min. Geben Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette 500 Mikroliter der gepoolten Phagensuspension hinzu, indem Sie die Spitze mit der Flüssigkeitsoberfläche in Kontakt bringen und das Volumen sehr langsam auf die Oberseite des Saccharosegradienten abgeben, wobei Sie darauf achten sollten, dass sich das Volumen nicht durch schnelles Pipettieren vermischt. Zentrifugieren Sie bei 70.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Tauche eine stumpfe Kanüle in die Lösung, bis die Spitze mittig am oberen Rand des Phagenbandes ist. Entfernen Sie das Band, indem Sie am Spritzenkolben ziehen, bis der größte Teil des Phagenbandes entfernt wurde. Geben Sie dann das Saccharosevolumen mit dem suspendierten Phagen in drei oder vier Ultrazentrifugenröhrchen.

Füllen Sie die Röhrchen bis zu einem Abstand von drei bis vier Millimetern von der Oberseite des Röhrchens mit kaltem 1XTM. Die Tuben mit Paraffinfolie abdecken und zum Mischen umdrehen. Legen Sie die Röhrchen wieder in eine Ultrazentrifuge und geben Sie sie eine Stunde lang bei 145.000 g bei vier Grad Celsius aus.

Den Überstand schnell abgießen und kopfüber auf Einwegtüchern abtropfen lassen. 200 bis 400 Mikroliter kaltes 1XTM auf alle Pellets verteilen und über Nacht bei vier Grad Celsius wieder suspendieren. Es ist kein Schütteln erforderlich.

Bereiten Sie am Tag vor der Titer eine Kultur von E.coli-Wirtszellen in 10 Millilitern LB-Wachstumsmedien vor und lassen Sie die Kultur über Nacht in einem Schüttelbrutkasten, der auf 250 U/min und 37 Grad Celsius eingestellt ist. Bereiten Sie als Nächstes einen Mastermix vor, indem Sie 5,25 Milliliter Top-Agar, 220 Mikroliter verdünnte Phagenproben und 50 Mikroliter Wirtsbakterienzellen in ein 14-Milliliter-Kulturröhrchen pipettieren. Verschließen Sie das Kulturröhrchen und wirbeln Sie es bei hoher Geschwindigkeit auf.

Entnehmen Sie zwei Kulturplatten aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Gib dann 2,5 Milliliter Mastermix langsam in die Mitte des ersten Tellers. Drehen Sie die Platte vorsichtig von Hand, um den Mastermix gleichmäßig zu verteilen, sodass er sich über die gesamte Kulturplatte erstreckt.

Warten Sie 20 Minuten, um sicherzustellen, dass sich der obere Agar verfestigt. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für vier bis sieben Stunden. Zählen Sie die Plaques und bestimmen Sie die Phagenkonzentration für jede Reaktionsprobe.

Verdünnen Sie einen Teil der Phagenbrühe auf 400 Mikroliter mit 1XTM-Puffer in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie ein gleiches Volumen Trisphenolchloroform in die Verdünnung. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig auf einer Laborwippe oder mit der Hand für fünf Minuten.

Dann zentrifugieren Sie die resultierende Emulsion bei 17.000 g in einer Tischzentrifuge für fünf bis 10 Minuten. Entfernen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Rohr und achten Sie darauf, die Interphasengrenze nicht zu stören. Wiederholen Sie diese Schritte noch zwei weitere Male, um insgesamt drei Phenolextraktionen zu erhalten.

Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und fügen Sie das gleiche Volumen Chloroform hinzu. Schütteln und zentrifugieren, bevor die wässrige DNA-Probe in ein sauberes Röhrchen überführt wird. Fügen Sie als nächstes 0,4 Volumen drei molare Natriumacetate und drei Volumen 95% Ethanol hinzu.

Legen Sie das Rohr in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius für den Niederschlag über Nacht. Zentrifugieren Sie 10 bis 15 Minuten lang bei 17.000 g in einer Tischzentrifuge. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, entweder durch Dekantieren oder Pipettieren.

Fügen Sie dann 500 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu und schütteln Sie die Tube vorsichtig, bis das Pellet vom Boden der Tube frei schwimmt. Nach dem Zentrifugieren das Ethanol entfernen und entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das Pellet nicht gestört wird. Nachdem Sie Ethanol hinzugefügt und wie zuvor zentrifugiert haben, entfernen und entsorgen Sie das Ethanol ein zweites Mal, wobei Sie erneut darauf achten, das Pellet nicht zu stören.

Trocknen Sie das Pellet 30 bis 60 Minuten lang an der Luft. Nach dem Trocknen gibst du 50 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser in das Pellet und inkubierst es eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius, um es wieder zu suspendieren. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration durch Absorptionsmessungen bei 280 Nanometern.

Um die zellfreie Reaktion durchzuführen, aliquotiert das angegebene Volumen des Rohextrakts, 33 % des endgültigen Reaktionsvolumens, in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie den Mastermix vor, wie im Textprotokoll aufgeführt. Fügen Sie dem Rohextrakt das entsprechende Volumen jeder Komponente hinzu.

Nach Zugabe der letzten Komponente wird die Reaktion durch Vortexen homogenisiert. Dann den Mastermix in n Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen. Fügen Sie als Nächstes die angegebenen Volumina der variablen Komponenten zum Master-Mix-Array hinzu.

Fügen Sie jeder Reaktion Wasser hinzu, um das gewünschte endgültige Reaktionsvolumen zu erreichen, bevor Sie es vortexen. Dann inkubieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei 29 Grad Celsius für mindestens acht Stunden oder über Nacht. Nachdem Sie die Zellen für den Phagentiter vorbereitet haben, wie im Textprotokoll beschrieben, titern Sie die endgültige zellfreie Reaktionslösung LB, wie weiter oben in diesem Video gezeigt.

Hier sind repräsentative Ergebnisse einer zellfreien Reaktion gezeigt, bei der Phi X 174 Phagen synthetisiert werden. Dieser Phagen-Plaque zeigt eine erfolgreiche Phagenreaktion, die in einer geeigneten Verdünnung titeriert wurde, was sich an der zählbaren Anzahl von Plaques zeigt. Eine erfolgreiche Reaktion kann sich jedoch schlecht zeigen, wenn der Verdünnungsfaktor für die Phagenausbeute der Reaktion zu niedrig ist.

Diese Tafel zeigt eine unzählbare Anzahl von Tafeln. Hier ist eine Platte mit inhomogener Verteilung von Phagenplaques zu sehen, die auf eine unzureichende Voräquilibrierung der Temperatur der Kulturplatte zurückzuführen ist. Während des Phagen-Titers verfestigte die Kulturplatte die Reaktion im unteren rechten Teil der Platte.

Molekulare Crowding-Bedingungen haben einen starken Einfluss auf die Phagensynthese für phi X 174 und insbesondere T7.In sinkt die Phagenausbeute für T7 um drei Größenordnungen, wenn die PEG-Konzentrationen von vier auf 2 Gew.-% sinken. Einmal gemeistert, können die Phagenreinigung und DNA-Extraktion in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Die zellfreie Reaktion dauert nur wenige Stunden, wenn es keine Probleme gibt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phagen züchtet, ihre DNA extrahiert und reinigt und das Ergebnis verwendet, um vollständig infektiöse Phagen mit dem zellfreien Reaktionssystem zu rekonstituieren. Die Arbeit mit Phenol kann äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie Laborkittel, Augenschutz und Handschuhe sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden. Alle Arbeiten mit offenen Behältern mit Phenol sollten in einem Abzug durchgeführt werden.