Name: Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Lernen Sie die Synthese infektiöser Bakteriophagen aus deren Genom mittels eines E. coli-basierten zellfreien Transkriptions-Translations-Systems. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Selbstassemblierung in der synthetischen Biologie.

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Dieses Material basiert auf Arbeit unterstützt durch das Office of Naval Research Award Nummer N00014-13-1-0074 (v.n.), das Human Frontier Science Program gewähren, Anzahl RGP0037/2015 (v.n.), und der binationalen Wissenschaftsstiftung gewähren 2014400 (v.n.).

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Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen vorgibt: Noireaux Labor erhält Forschungsgelder von MYcroarray, ein Händler von MYtxtl zellfreien Protein Ausdruck Kit.

Nach der Technik in Chen, Et Al. 14 für SPMC ist ein wichtiger Schritt erreicht, wenn die richtigen Bedingungen für Superinfektion zu bestimmen. Der Parameter, der am ehesten ein Host Stamm Fähigkeit steuert, Superinfektion zu widerstehen ist häufig der Ausgangskonzentration des infizierenden Phagen. Die Wirtszellen muss logarithmischen Wachstumsphase vor Erstinfektion mit einer sehr kleinen Menge von Phagen. Schließlich die Phagen werden auch logarithmische Wachstum erreichen und das Zie...

Im letzten Jahrzehnt wurde die zellfreie Expression Technologie zur Adresse neuartige Anwendungen im aufstrebenden multidisziplinäre Forschung Bereiche im Zusammenhang mit synthetischen und quantitative Biologie entwickelt. Ursprünglich verwendet, um Proteine, die unabhängig von einem lebenden Organismus auszudrücken, wurden zellfreie TXTL Neuanlagen für beide Grundlagenforschung und der angewandten Wissenschaften1,2, Erweiterung des Geltungsbereichs dieser Technologie deutlich entwickelt. Die neue Generation der TXTL Plattformen wurde entwickelt, um benutzerfreundlich, werden effizienter (bis 2 mg/mL der Proteinsynthese im Batch-Modus3), mehr auf der Ebene der Transkription4vielseitig und modulare damit problemlos integrieren Roman natürliche oder synthetische Funktionen, die die Möglichkeiten von vorhandenen biologischen Systemen5,6. Insbesondere zellfreie TXTL Systeme für das rapid Prototyping von genetischen Programmen, wie regulatorische Elemente oder kleine genetische Schaltkreise7,8,9, handlich geworden durch die Reduzierung der Design-Build-test Radeln Sie nach ein paar Tagen. Bemerkenswert ist, sind die neuen TXTL-Systeme verarbeiten große DNA-Programme wie die komplette Synthese von Coliphages10,11, demonstrieren stark genug Leistung um die Rekonstitution der genomischen aktiv unterstützen Lebewesen DNA kodiert.
TXTL Systeme präsentieren viele technische Vorteile gegenüber traditionellen in-vitro- konstruktive biochemischen Assays. Zellfreie TXTL verbindet den Prozess der Genexpression bis zum fertigen Produkt in einem reduzierten und offenen Umfeld, im Gegensatz zu den komplexen Zytoplasma einer lebenden Zelle. TXTL verwendet DNA biochemischen Systemen in Vitrozu rekonstruieren, die ist mit modernen DNA Montagetechniken, bezahlbar und schnell neben nicht erfordern anspruchsvolle Protein Reinigungsschritte. Zellfreie Ausdruck bietet direkten Zugriff auf die meisten Komponenten in den biochemischen Reaktionen, wodurch eine tiefere Dissektion der molekularen Wechselwirkungen12. In einer TXTL Reaktion kann man die biochemischen und biophysikalischen Einstellungen nach Belieben, ändern, fast unmöglich in einer lebenden Zelle. Angesichts dieser Vorteile und Verbesserungen, wird die TXTL-Technologie mehr und mehr populär als eine alternative Plattform für synthetische und quantitative Biologie. Während die Forschungsgemeinschaft mit TXTL rasant wächst und TXTL eine Standardtechnologie in Bioingenieurwesen wird, es ist wichtig zu verstehen, wie solche Plattformen um angemessene Praktiken im Zusammenhang mit der Ausführung der TXTL Reaktionen und zu entwickeln die Interpretation der Ergebnisse.
In diesem Artikel beschreiben wir wie ein alle E. Coli TXTL System verwenden, um in ein-Topf-Reaktionen, Bakteriophagen von ihrem Genom11, z. B. MS2 zu synthetisieren (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (SsDNA, 5,4 kb), und T7 (DsDNA, 40 kb). Wir zeigen, wie die Höhe der Phagen Änderungen in Bezug auf einige der biochemischen Einstellungen der Reaktionen (Magnesium und Kalium-Konzentrationen) synthetisiert. Molekulare drängen, durch eine Reihe von PEG 8000 Konzentrationen emuliert hat einen enormen Einfluss auf die Phagen Synthese über mehrere Größenordnungen. Die Realisierung solcher großen biochemische Systeme im einzelnen Reagenzglas Reaktionen, die gleichzeitig die Prozesse der Transkription, Übersetzung, rekapitulieren und Selbstmontage, ist interessant für grundlegende Fragen im Zusammenhang mit Biologie und Biophysik 10 (Genregulation, Self-assembly), sowie für die Entwicklung von Anwendungen, wie z. B. Umnutzung Phagen-Funktionen, um neue Nanostrukturen13bauen. Neben einem praktischen auf TXTL bieten wir Methoden für Phagen Verstärkung, Genom-Extraktion und Reinigung und Phagen Quantifizierung von Plaque-Assay. In diesem Manuskript vorgestellten Methoden eignen sich für Forscher, die mit E. Coli Extrakt basiert zellfreien Systemen und interessieren sich für Bakteriophagen.
In dieser Arbeit vorgestellten Protokolle können wie folgt zusammengefasst werden: (1) Phagen Verstärkung (Tag1: Inokulation vorzubereiten Zellen, Tag 2: einzelne Plaque, mehrere Phagen Wachstum und Konzentration und Tag 3: Reinigung des Phagen), 2) Double-Stranded Genom DNA-Extraktion (Phenol/Chloroform Extraktion), und 3) zellfreie Phagen Reaktion und Titer Experiment (Tag1: Platte Wirtszellen und machen Agarplatten, Tag 2: zellfreie Reaktion und Host cell Vorkultur und Tag 3: Host Zelle Kultur und Phage Titer).

<table><tbody><tr><td>Ultrazentrifugationsröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>Konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Gradientenmacher</td><td>BioComp Gradient Master</td><td>siehe Anal Biochem. 1985 Jul; 148(1):254-9.</td><td></td></tr><tr><td>Spritze und stumpfe Kanüle</td><td>Monoject</td><td>8881513918 und 888202017</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung</td><td>Fischerbrand</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Plaque-Zähler</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Colony Zähler Modell C-110</td><td></td></tr><tr><td>Kulturröhrchen</td><td>Fischerbrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Zellfreies System</td><td>Mycroarray Inc</td><td>Mytxtl</td><td></td></tr><tr><td>BioComp Gradient Master</td><td>BioComp Instruments</td><td>Modell 105ME</td><td></td></tr><tr><td>LB Agarplatte Rezeptur</td><td></td><td></td><td>25 g/L Luria-Bertani Medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents Artikelnummer BP1426) und 15 g/L Bacto-Agar fest (Brenton, Dickenson and Company - Produktnummer 214010).</td></tr></tbody></table>

synthese von infektiösen bakteriophagen in einem e. coli -basierte zellfreie expressionssystems

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung (TXTL) Systeme, entwickelt, um eine größere Vielseitigkeit und Modularität, neuartige Funktionen zur Grundlagenforschung und der angewandte Wissenschaften in Reagenzglas Reaktionen führen zu bieten haben. Im letzten Jahrzehnt ist die zellfreie TXTL eine leistungsfähige Technik für eine Vielzahl von neuartigen multidisziplinäre Forschung Bereiche im Zusammenhang mit quantitativen und synthetische Biologie geworden. Die neue TXTL-Plattformen sind besonders nützlich, um zu konstruieren und biochemische Systemen durch die Ausführung von synthetischen oder natürlichen gen Schaltungen zu verhören. In-vitro- TXTL nachweislich schnell Prototyp regulatorische Elemente und biologischer Netzwerke sowie Zusammenfassend bequem molekulare Mechanismen Selbstmontage in lebenden Systemen gefunden. In diesem Artikel beschreiben wir wie infektiöse Bakteriophagen, z. B. MS2 (RNA), ΦΧ174 (SsDNA) und T7 (DsDNA), sind völlig von ihrem Genom im ein-Topf-Reaktionen mit allen Escherichia coli, zellfreie TXTL System synthetisiert. Synthese von den drei Coliphages wird mit dem Plaque-Assay quantifiziert. Wir zeigen, wie die Rendite der synthetisierten Phagen biochemische Reaktionen-Einstellungen abhängig ist. Molekulare Verdrängung durch eine kontrollierte Konzentration von PEG 8000 emuliert beeinflusst die Höhe des synthetisierten Phagen durch Aufträge von Größen. Wir beschreiben auch die Phagen zu verstärken und ihre Genome zu reinigen. Protokolle und Ergebnisse, die in dieser Arbeit sollten in zellfreien synthetische Biologie und Biotechnologie an multidisziplinären Forscher beteiligt werden.

Wir zeigen vier repräsentative Ergebnisse. In Abbildung 1, präsentieren wir eine Reihe von negativen Kontrollen sicherstellen, dass das zellfreie TXTL-System und die Phagen-DNA-Bestände nicht mit lebenden kontaminiert sind E. Coli Zellen. Wir überprüfen, dass das zellfreie TXTL System intakt E. Coli ist Zell-Kontamination durch Ausplattieren beide ein nicht inkubiert und inkubierten Reaktionslösung leer von genomischer DNA (<strong class="xf...

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung Plattformen wurde entwickelt, um die biochemischen Systemen in Vitro durch die Ausführung des Gens Schaltungen aufbauen. In diesem Artikel beschreiben wir, wie aus ihrem Genom mit einem alle E. Coli zellfreie TXTL System Bakteriophagen MS2, ΦΧ174 und T7, synthetisiert werden.

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, zu beschreiben, wie Bakteriophagen anhand ihres Genoms unter Verwendung eines vollständig auf E. coli basierenden zellfreien Transkriptions- und Translationsystems synthetisiert werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der synthetischen Biologie zu beantworten, beispielsweise die Aufklärung der molekularen Selbstassemblierungsmechanismen in lebenden Systemen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Vielseitigkeit der Plattform.Viele biologische Systeme können vollständig rekapituliert und feinabgestimmt für die experimentelle Analyse vorbereitet werden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung von Phagen-Plaques, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie das Ende einer sterilen Pasteur-Pipette, um einen einzelnen Plaque zu entnehmen und zu entfernen.Blasen Sie die Plaque in die verdünnten Zellen. Anschließend zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um eine vollständige Infektion zu überprüfen, entnehmen Sie eine 500-Mikroliter-Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und geben 10 Mikroliter Chloroform hinzu.Vortexen Sie das Gemisch sofort mit hoher Geschwindigkeit und beobachten Sie, ob sich die Lösung klärt, was auf eine Phageninfektion hinweist. Sobald die Zellen vollständig infiziert sind, inkubieren Sie weitere zwei Stunden. Fügen Sie danach DNase hinzu, bevor Sie die Zellen bei 8.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter 1X Tris-Magnesiumchlorid. Geben Sie 500 Mikroliter Chloroform hinzu und wirbeln Sie bei hoher Geschwindigkeit, um die Zellen zu lysieren. Klären Sie durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Anschließend das Überstand in ein 15-Milliliter-Konischrohr abgießen und bei vier Grad Celsius lagern. Vier Fünf- bis 45-%-Saccharose-Gradienten herstellen, indem 2,5 Milliliter 45-%-Saccharose in vier Ultrazentrifugenröhrchen pipettiert werden. Die Schicht mit etwa 2,6 Milliliter 5-%-Saccharose bedecken, wobei der Vorgang gestoppt wird, sobald die Flüssigkeit zwei Millimeter unterhalb des Randes des Röhrchens steht.Mischen Sie die Gradienten durch Neigungsrohr-Rotation mit einem Gradientenbildner für 43 Sekunden bei 86 Grad und 23 U/min. Geben Sie mithilfe einer Ein-Milliliter-Pipette 500 Mikroliter der gepoolten Phagensuspension zu, indem Sie die Pipettenspitze mit der Flüssigkeitsoberfläche in Kontakt bringen und das Volumen sehr langsam auf die Oberseite des Saccharosegradienten abgeben, wobei darauf zu achten ist, dass kein Durchmischen durch schnelles Pipettieren erfolgt. Zentrifugieren Sie bei 70.000 × g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.Senken Sie eine stumpfe Kanüle in die Lösung, bis sich die Spitze mittig am oberen Rand des Phagenbands befindet. Entfernen Sie das Band, indem Sie am Spritzenkolben ziehen, bis der größte Teil des Phagenbands abgezogen ist. Geben Sie dann das Volumen des mit den Phagen beladenen Saccharoselösungsansatzes auf drei oder vier Ultrazentrifugenröhrchen auf.Füllen Sie die Röhrchen bis auf drei bis vier Millimeter unter den Rand mit kaltem 1XTM. Decken Sie die Röhrchen mit Parafolium ab und stürzen Sie sie zum Mischen um. Stellen Sie die Röhrchen anschließend wieder in eine Ultrazentrifuge und zentrifugieren Sie sie eine Stunde lang bei 145.000 × g und vier Grad Celsius.Gießen Sie den Überstand schnell ab und lassen Sie ihn kopfüber auf Einwegtüchern abtropfen. Verteilen Sie 200 bis 400 Mikroliter kalte 1XTM auf alle Pellets und resuspendieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Ein Schütteln ist nicht erforderlich.Am Tag vor der Titerbestimmung bereiten Sie eine Kultur von E.coli-Wirtszellen in 10 Milliliter LB-N&auml;hrmedium vor und lassen die Kultur &uuml;ber Nacht in einem sch&uuml;ttelnden Inkubator bei 250 U/min und 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie anschlie&szlig;end eine Master-Mischung vor, indem Sie 5,25 Milliliter Oberagar, 220 Mikroliter verd&uuml;nnter Phagenproben und 50 Mikroliter Wirtsbakterienzellen in ein 14-Milliliter-Kulturgef&auml;&szlig; pipettieren. Verschlie&szlig;en Sie das Kulturgef&auml;&szlig; und wirbeln Sie es bei hoher Geschwindigkeit im Vortex. Entnehmen Sie zwei Kulturplatten aus dem 37 Grad Celsius Inkubator. Geben Sie dann langsam 2,5 Milliliter Master-Mix in die Mitte der ersten Platte. Drehen Sie die Platte vorsichtig von Hand, um den Master-Mix gleichmäßig zu verteilen, sodass er die gesamte Kulturplatte bedeckt.Warten Sie 20 Minuten, um die Verfestigung des oberen Agars sicherzustellen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für vier bis sieben Stunden. Zählen Sie die Plaques und bestimmen Sie die Phagokonzentration für jede Reaktionsprobe.Verdünnen Sie einen Teil des Phagenstamms in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 1XTM-Puffer auf 400&nbsp;Mikroliter. Geben Sie eine gleiche Menge Tris-Phenol-Chloroform zur Verdünnung hinzu. Schütteln Sie das Gemisch vorsichtig fünf Minuten lang auf einem Laborrührer oder von Hand.Anschließend die resultierende Emulsion in einer Tischzentrifuge bei 17.000 × g fünf bis zehn Minuten lang zentrifugieren. Die obere wässrige Phase vorsichtig in ein neues Gefäß abheben, wobei darauf geachtet werden muss, die Grenzfläche nicht zu stören. Diese Schritte insgesamt dreimal durchführen, sodass drei Phenolextraktionen erfolgen.Überführen Sie die wässrige Phase in ein frisches Gefäß und geben Sie ein gleiches Volumen Chloroform hinzu. Schütteln und zentrifugieren Sie, bevor Sie die wässrige DNA-Probe in ein sauberes Gefäß überführen. Geben Sie anschließend 0,4 Volumina dreimolare Natriumacetat-Lösung und drei Volumina 95 %igen Ethanol hinzu.Stellen Sie das Gefäß zur Übernachtpräzipitation in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie 10 bis 15 Minuten bei 17.000 × g in einer Tischzentrifuge. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand, entweder durch Abgießen oder mit der Pipette.Gegeben Sie anschließend 500 Mikroliter 70 % Ethanol hinzu und schütteln Sie das Röhrchen vorsichtig, bis sich der Pellet vom Boden des Röhrchens löst. Nach der Zentrifugation entfernen und verwerfen Sie den Ethanol, wobei darauf zu achten ist, den Pellet nicht zu stören. Nach erneutem Hinzufügen von Ethanol und Zentrifugation wie zuvor erfolgt die erneute Entfernung und Entsorgung des Ethanols, wobei erneut darauf geachtet werden muss, den Pellet nicht zu stören.Trocknen Sie das Pellet auf der Laborbank 30 bis 60 Minuten lufttrocken. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser zum Pellet und inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius, um es erneut aufzususpensieren. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mithilfe von Absorptionsmessungen bei 280 Nanometern.Um die zellfreie Reaktion durchzuführen, pipettieren Sie das angegebene Volumen des Rohextrakts, das 33 % des endgültigen Reaktionsvolumens beträgt, in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie die Master-Mix-Lösung gemäß der schriftlichen Protokollanleitung vor. Geben Sie das entsprechende Volumen jeder Komponente zum Rohextrakt hinzu.Nach Zugabe der letzten Komponente die Reaktion durch Vortexen homogenisieren. Anschließend die Master-Mix-Lösung auf n Mikrozentrifugenröhrchen aufteilen. Danach die angegebenen Volumina der variablen Komponenten zur Master-Mix-Reihe hinzufügen.Wasser zu jeder Reaktion hinzufügen, um das gewünschte endgültige Reaktionsvolumen zu erreichen, bevor vortexiert wird. Anschließend die Mikrozentrifugenröhrchen bei 29 Grad Celsius mindestens acht Stunden oder über Nacht inkubieren. Nach der Vorbereitung der Zellen zur Phagentitration gemäß der schriftlichen Anleitung den endgültigen zellfreien Reaktionsansatz in LB-Lösung wie zuvor in diesem Video gezeigt titrieren.Hier sind repräsentative Ergebnisse einer zellfreien Reaktion zur Synthese des phi X 174-Phagen gezeigt. Diese Phagen-Plakette zeigt eine erfolgreiche Phagenreaktion, die bei einer geeigneten Verdünnung titriert wurde, erkennbar an der zählbaren Anzahl von Plaques. Eine erfolgreiche Reaktion kann jedoch schlecht erscheinen, wenn der Verdünnungsfaktor für die Phagenausbeute der Reaktion zu niedrig ist.Diese Platte zeigt eine unbegrenzte Anzahl von Plaques. Abgebildet ist eine Platte mit inhomogener Verteilung von Phagen-Plaques aufgrund einer unzureichenden Vorwärmphase der Kulturplatte. Während der Phagentitration verfestigte sich das Medium im unteren rechten Bereich der Platte.Die Bedingungen der molekularen Überfüllung haben einen starken Einfluss auf die Phagensynthese von phi X 174 und T7. Insbesondere sinkt die Phagenausbeute für T7 um drei Größenordnungen, wenn die PEG-Konzentration von vier auf 2 % Gewicht pro Volumen abnimmt. Sobald die Technik beherrscht ist, können die Phagenreinigung und die DNA-Extraktion bei sachgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden. Die zellfreie Reaktion dauert nur wenige Stunden, sofern keine Probleme auftreten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Phagen kultiviert, deren DNA extrahiert und reinigt und das Ergebnis verwendet, um vollständig infektiöse Phagen mithilfe eines zellfreien Reaktionssystems neu zusammenzusetzen. Das Arbeiten mit Phenol kann äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Laborkittels, von Augenschutz und Handschuhen sollten beachtet werden, während dieser Vorgang durchgeführt wird. Alle Arbeiten mit offenen Behältern, die Phenol enthalten, sollten in einem Abzug durchgeführt werden.

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Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Bau eines Fosmid Bibliothek mit Umwelt-genomischer DNA aus der vertikalen Tiefe Kontinuum einer saisonal hypoxischen Fjord isoliert beschrieben. Der resultierende Klon-Bibliothek ist in 384-Well-Platten aufgenommen und archiviert für Downstream-Sequenzierung und funktionelle Screening durch die Anwendung eines automatisierten Kolonie Kommissioniersystem.

Large Insert Environmental Genomic Bibliothek Produktion

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren zur Herstellung eines fluoreszenzmarkierten Version des Bakteriophagen Lambda,...

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Preparation of Bacteriophage Lysate for Generalized Transduction

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.

Pflanzliche Proteine in Insektenzellen abgesondert ändern Baculovirus Expressionsvektoren herstellen

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Bakteriophagen (Phagen), Viren, die Bakterien infizieren, sind ein integraler Bestandteil des Darmmikrobioms. Obwohl diese symbiotischen Bewohner die bakterielle Fitness und Populationsdynamik vorantreiben, ist wenig darüber bekannt, wie sie sich auf die Darmhomöostase und -krankheit auswirken. Dieses Protokoll untersucht isolierte T4-Phagen in einem Mausmodell, die an andere Phagen-Bakterien-Paare angepasst werden können.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Herstellung und Bewertung der antimikrobiellen Aktivität und Zytotoxizität des kationischen Peptides Mel4 und des Peptidmimiks RK758. Durch die Integration chemischer Synthese, rekombinanter Expression und standardisierter funktioneller Assays bietet es einen reibungslosen Arbeitsablauf für die Herstellung und Prüfung von Peptiden und Kleinmolekül-Mimiken.

Herstellung und Prüfung antimikrobieller Peptide und ihrer Nachahmungen

Lernen Sie die Synthese infektiöser Bakteriophagen aus deren Genom mittels eines E. coli-basierten zellfreien Transkriptions-Translations-Systems. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Selbstassemblierung in der synthetischen Biologie.

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

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