Einfache Beseitigung von Hintergrundfluoreszenz in Formalin fixiert menschliche Gehirngewebe für die Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Ein häufiges Problem in der Immunfluoreszenzmikroskopie ist das Vorhandensein von endogener Hintergrundfluoreszenz, die Ihr Signal beeinträchtigen kann. In vielen Fällen kann diese Autofluoreszenz dazu führen, dass Ihre Ergebnisse nicht mehr interpretierbar sind. In diesem Protokoll zeigen wir, wie man Autofluoreszenz aus menschlichen Hirngewebeproben mittels Photobleaching mit einer handelsüblichen LED-Schreibtischlampe entfernt.

Die Hauptvorteile dieser Methode sind die erheblichen Kosteneinsparungen gegenüber den derzeitigen Techniken ohne Einbußen bei der Wirksamkeit und dass keine exogenen Verbindungen in die Probe eingebracht werden. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie Stammlösungen aus einer mal trisgepufferten Kochsalzlösung, TBS und 10% Natriumazid vor. Für jeweils drei Objektträger in Standardgröße, die Sie bearbeiten möchten, benötigen Sie eine einzelne 100 Millimeter x 100 Millimeter große quadratische Petrischale als Objektträgerkammer.

Bereiten Sie für jede Objektträgerkammer 50 Milliliter 05%Azid in TBS vor, indem Sie 25 Milliliter 10%Natriumazid zu 50 Millilitern einmaligem TBS hinzufügen. Erstellen Sie ein Gerüst, um Ihre Objektträgerkammer so anzuheben, dass ein Lampenkopf darunter passt. Für eine 100 Millimeter große Petrischale kann ein ähnlich großer Lebensmittelbehälter aus Kunststoff in Form geschnitten werden.

Alles, was die Objektträgerkammer sicher anheben kann, ohne das Licht daran zu hindern, die Proben zu erreichen, kann verwendet werden. Besorgen Sie sich eine Schreibtischlampe aus weißer Phosphor-LED und entfernen Sie alle Diffusoren oder undurchsichtigen Kunststoffe, die die Lichtquelle abdecken. Richten Sie das LED-Array nach oben aus.

Zu diesem Zweck empfiehlt sich eine Leuchte mit flexiblem Hals. Konstruieren Sie eine reflektierende Kuppelabdeckung für das Gerät, indem Sie das Innere eines Kastens beleuchten, der groß genug ist, um die Schiebekammern und das Gerüst mit Aluminiumfolie abzudecken. Für eine einzelne Kammer kann eine Ein-Millimeter-Pipettenspitzenbox verwendet werden.

Für dieses Video wurde formalinfixiertes humanes FTLD-T-orbitales Stirngyri-Hirngewebe einer Photobleaching-Vorbehandlung unterzogen. Die Verfahren zur Gewebevorbereitung und Aminofärbung können je nach Quelle, Fixierung und Einbettung Ihrer Gewebeschnitte variieren. Stellen Sie die Lampe in einem Kühlraum mit vier Grad Celsius, einem Kühlschrank oder einem Kühlschrank unter das Gerüst und die Probenkammer auf das Gerüst.

Füllen Sie die Probenkammer mit 50 Millilitern Azid TBS. Tauchen Sie 10 Mikrometer dicke Gewebeschnitte, die auf Standard-Glasobjektträgern montiert sind, mit einer sauberen Pinzette in die Probenkammer. Decken Sie das Gerät mit der reflektierenden Kuppel ab und schalten Sie die LED-Lampe ein.

Lassen Sie die Proben 48 Stunden lang photobleichen. Diese Inkubationszeit kann je nach Lampenintensität und Menge an autofluoreszierendem Material im Gewebe variieren. Nach der Photobleaching-Vorbehandlung können die Objektträger mit einem Standardprotokoll für Ihr spezifisches Gewebe und Ihre Proteine von Interesse immungefärbt werden.

Zu Demonstrationszwecken wurde FTLD-T-Hirngewebe mit Sekundärantikörpern, die an Alexa 488 und Texas Red konjugiert waren, auf phosphoryliertes Tau gefärbt. DAPI wurde als nuklearer Gegenfleck verwendet. Bereiten Sie 500 Milliliter Antigen-Retrieval-Puffer, 500 Milliliter 0,025 % Triton X-100 bei TBS, 10 Milliliter 1 % Rinderserumalbumin, BSA, bei TBS und zwei Milliliter Blockierungslösung, bestehend aus Ziegenserum, das BSA TBS zugesetzt wird, vor.

Führen Sie die Antigen-Retrieval durch, indem Sie die photogebleichten Objektträger in einen Antigen-Retrieval-Puffer in einem Objektträgersammler eintauchen. Heizen Sie den Kollektor 30 Minuten lang auf 90 Grad Celsius. Nachdem der Kollektor aus der Wärmebehandlung genommen wurde, ist es wichtig, die Kammer 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen zu lassen.

Wenn Sie die Objektträger sofort entfernen, trocknen die Abschnitte aus. Bereiten Sie Ihre Primärantikörpermischung gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. In diesem Fall wurde der Anti-Phospho-PHF-Tau-p-Serin-202 plus Threonin-205-AT8-Antikörper eins zu 100 mit BSA TBS verdünnt und auf Eis belassen.

Pro Abschnitt werden 150 Mikroliter Antikörpermischung benötigt. Nachdem die Schnitte 30 Minuten lang abgekühlt sind, übertragen Sie die Objektträger aus dem Antigen-Retrieval-Collector in ein mit TBS Triton gefülltes Färbegefäß. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in dieser Lösung unter leichtem Schütteln.

Leeren Sie den TBS Triton und tauschen Sie ihn aus, um diesen Waschschritt ein zweites Mal zu wiederholen. Nehmen Sie nach dem Waschen die Objektträger aus dem Färbeglas und saugen Sie überschüssigen Puffer ab. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Umriss um das Gewebe.

Dadurch wird verhindert, dass Ihre Lösungen von der Folie ablaufen. Achten Sie darauf, dass die Dias nicht austrocknen. Blockieren Sie das Gewebe, indem Sie 200 Mikroliter Blockierlösung auf die Objektträger pipettieren und sie in eine befeuchtete Kammer legen.

Diese Kammer kann etwas so Einfaches sein wie ein Objektträgergestell in einer Pipettenspitzenbox, in der sich ein nasses Papiertuch befindet. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Gewebeprobe mit Blockierungslösung bedeckt ist. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie die verstopfte Lösung mit einem Aspirator oder einer Pipette. Pipettieren Sie 100 bis 150 Mikroliter der primären Antikörpermischung auf die Objektträger. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Probe mit Antikörperlösung bedeckt ist und dass die Schnitte auf einer ebenen Oberfläche aufbewahrt werden, um eine ungleichmäßige Ansammlung von Antikörpern zu vermeiden.

Mit dem Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Bereiten Sie am nächsten Tag die Sekundärantikörpermischung vor. In diesem Fall wurden das Ziegen-Anti-Maus-Mittel Alexa 488 und das Ziegen-Anti-Maus-Mittel Texas Red mit BSA TBS eins zu 100 verdünnt.

Entnehmen Sie die Gewebeschnitte und entfernen Sie die primäre Antikörperlösung mit einem Aspirator oder einer Pipette. Waschen Sie die Objektträger zweimal auf die gleiche Weise wie zuvor mit einem mit TBS Triton gefüllten Färbeglas für jeweils fünf Minuten. Nach dem Waschen überschüssigen Puffer ableiten.

Pipettieren Sie 100 bis 150 Mikroliter Sekundärantikörperlösung, um sicherzustellen, dass die Gewebeprobe wieder vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in der befeuchteten Kammer im Dunkeln. Bereiten Sie 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Gegenfärbung in TBS gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder in serieller Verdünnung vor.

Achten Sie darauf, die DAPI-Stammlösung aufgrund der möglichen Unlöslichkeit gründlich zu mischen. Entnehmen Sie die Objektträger und entfernen Sie das sekundäre Antikörpergemisch. Waschen Sie die Proben zweimal, aber verwenden Sie anstelle von TBS Triton einfaches TBS.

Aspirieren oder pipettieren Sie die restliche Waschlösung und pipettieren Sie 100 bis 150 Mikroliter DAPI-Farbstoff auf Ihre Gewebeschnitte. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren. Entnehmen Sie die Proben und waschen Sie sie dreimal statt zweimal mit normalem TBS.

Entfernen Sie nach dem Waschen vorsichtig die restliche Waschlösung. Eindeckmedium auftragen. Schließen Sie die Objektträgermontage ab, indem Sie die Proben mit Glasabdeckgläsern abdecken.

Vermeiden Sie Blasen, indem Sie eine Kante des Deckels nach unten schieben und die gegenüberliegende Kante sehr langsam mit einer Pinzette absenken. Lassen Sie Eindeckmedien trocknen, bevor Sie sie bei vier Grad Celsius im Dunkeln lagern. Die Folien können nun visualisiert werden.

Die Einstellungen für die Fluoreszenzmikroskopie variieren je nach den für die Färbung verwendeten Fluorophoren und dem Mikroskop. Schalten Sie die Fluoreszenzlampe, das Mikroskop und den Computer ein und lassen Sie die Lampe 15 Minuten lang aufwärmen. Legen Sie die gefärbten Gewebeobjektträger in das Fluoreszenzmikroskop.

Verwenden Sie das Hellfeld, um das Gewebe bei 10-facher Vergrößerung zu lokalisieren. Sobald sich eine geeignete Geweberegion befindet, geben Sie einen Tropfen Wasser auf das Deckglas der Probe. Wechseln Sie zu einer 20-fachen Wasserimmersionslinse.

Wählen Sie die Laseranregungs- und Emissionswellenlängen aus, die für jedes Fluorophor in separaten Spuren geeignet sind, um ein optimales Signal zu erzielen. Weitere Einzelheiten zu den verwendeten Einstellungen und Wellenlängen finden Sie im begleitenden Manuskript. Passen Sie die Laserleistung und die Verstärkungseinstellungen an, um die Signalintensität für jede Spur zu optimieren.

Sobald Sie die entsprechenden Einstellungen und das entsprechende Sichtfeld gefunden haben, speichern Sie ein Kompositbild mit den Fluoreszenzdaten jeder Spur. Um die Fluoreszenzintensität in jedem Kanal zu visualisieren, installieren Sie das Makro "RGB-Profilwerkzeuge" für ImageJ. Öffnen Sie die konfokale LSM-Bilddatei in ImageJ und konvertieren Sie die zusammengesetzten Bilder aus den drei Stapeln in RGB, indem Sie zu Bild, Farbe, Kanalwerkzeug gehen.

Wählen Sie Composite aus, und aktivieren Sie alle drei Kanäle. Gehen Sie als Nächstes zu Bild, Typ und RGB-Farbe. Wählen Sie das Symbol RGB-Profilwerkzeuge aus und ziehen Sie eine Linie über den Abschnitt im Bild, der profiliert werden soll.

In diesem Video wurden die Schritte zur Durchführung einer Photobleaching-Vorbehandlung von Gewebeproben zur Erzeugung von Hintergrundfluoreszenz beschrieben. Dieses Verfahren kann vor der Antigengewinnung und der Aminofärbung zu jedem Standard-Aminofluoreszenzprotokoll hinzugefügt werden. Die für das Photobleaching verwendete Apparatur ist kostengünstig und leicht zu beschaffen und besteht aus handelsüblichen Komponenten.

Weiße Phosphor-LEDs emittieren Licht über ein breites Spektrum von Wellenlängen, wodurch sie sich sehr gut für das Photobleaching mit großer Reichweite eignen. Mit einer leicht erhältlichen LED-Schreibtischlampe wurden ungefärbte menschliche FTLD-T-Hirngewebeproben photogebleicht und mit den Wellenlängen abgebildet, die geeignet wären, wenn diese Proben mit Texas Red und Alexa 488 gefärbt würden. Unbehandelte Proben wiesen große Mengen an Autofluoreszenz auf.

Im Gegensatz dazu führte das Photobleaching zu einer signifikant reduzierten Intensität der Autofluoreszenz-Speckles, die dem Lipofuszin ähnelten, sowie zu einer allgemeinen Hintergrundfluoreszenz. Zur weiteren Validierung dieser Technik wurden FTLD-T-Hirngewebeproben auf hyperphosphoryliertes Tau gefärbt, ein Protein, das sich bei dieser Krankheit falsch faltet und sich als eigenständige Einschlusskörper ansammelt. Es wurden zwei verschiedene Sekundärantikörper eingesetzt, um besser zwischen Tau-Markierung und unspezifischer Fluoreszenz unterscheiden zu können.

In diesen zusammengesetzten Bildern ist die Kolokalisation von Alexa 488 und Texas Red in Gelb dargestellt, was das korrekt gefärbte Tau-Protein darstellt. Das Auftreten von roten oder grünen Bereichen deutet entweder auf eine unspezifische Fluoreszenz oder auf ein Quenching eines der Chromophore hin. In der unbehandelten Kontrollprobe sind signifikante Hintergrundinformationen und unspezifische Signale zu sehen, insbesondere im Texas Red-Kanal.

Sowohl die Photobleaching-Vorbehandlung als auch die Anwendung eines chemischen Quenchers führen zu einem stark reduzierten Hintergrundsignal. Wenn wir die Fluoreszenzkanäle aufteilen und die Bilder unter höherer Vergrößerung betrachten, können detailliertere Beobachtungen gemacht werden. Die unbehandelte Kontrolle besitzt eine Hintergrundfluoreszenz über alle Kanäle sowie unspezifische Merkmale, hauptsächlich im Texas Red-Kanal, die eine ähnliche Intensität wie die Tau-spezifische Markierung aufweisen.

Wenn die Tau-Einschlusskörper keine ausgeprägte, vorhersagbare Morphologie aufwiesen, könnten diese Texas-Red-Ergebnisse aufgrund des Vorhandenseins dieser autofluoreszierenden Merkmale falsch interpretiert worden sein. Die Photobleaching-Vorbehandlung beseitigt diese unspezifischen Merkmale von Texas Red vollständig, während der Großteil der Tau-spezifischen Texas Red- und Alexa 488-Signale erhalten bleibt. Photobleaching scheint jedoch nur einen geringen Einfluss auf die DAPI-Hintergrundfluoreszenz zu haben.

Der chemische Quencher reduzierte die Hintergrundfluoreszenz im Alexa 488-Kanal ebenso effektiv wie das Photobleaching. Es reduzierte jedoch auch die Fluoreszenzintensitäten sowohl von DAPI als auch von Texas Red, was auf das Vorhandensein eines kontraproduktiven Quenchings hindeutet. Die Quantifizierung dieser Effekte ist in den Signalprofilen zu sehen.

Wie Sie sehen können, erzeugt diese Methode saubere Bilder ohne verwirrende Merkmale. Diese Photobleaching-Vorbehandlung kann in jedes Standard-Aminofluoreszenzprotokoll integriert werden, um die Autofluoreszenz zu entfernen und qualitativ hochwertige, eindeutige Ergebnisse zu erzielen.