Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens ist es, einen grundlegenden Ansatz in detaillierter Methodik zu skizzieren, um die genetische Heterogenität am Zielort zuverlässig und robust zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Gen-Editierung zu beantworten, z. B. wie die Mutagenese vor Ort analysiert und gemessen werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine standardisierte Methode für die homologiegerichtete Reparatur oder Genkorrektur mit einzelsträngigen Oligonukleotiden handelt.

Zu Beginn des Protokolls werden HTT11619 Zellen in 25 Millilitern zuvor vorbereitetem Medium für die Kultur von HTT116-Zellen in einem T-175-Kolben gezüchtet. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS ohne Calcium und Magnesium, dann aspirieren Sie das PBS. Geben Sie anschließend Trypsin tropfenweise mit einer Fünf-Milliliter-Pipette in den T-175-Kolben.

Lassen Sie die Zellen in einem Inkubator ablösen. Klopfen Sie auf den Kolben, um die Zellen zu lösen, und löschen Sie dann die Zellen mit den acht Millilitern des vollständigen Mediums über die gesamte Oberfläche des Kolbens. Pipettieren Sie dann die Mischung mehrmals auf und ab, um die Zellklumpen aufzubrechen, und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Bevor Sie die Zellen herunterschleudern, nehmen Sie 10 Mikroliter aus dem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und kombinieren Sie es mit 10 Mikrolitern Trypanblau, um die Zellen zu zählen, und pelletieren Sie dann die Zellen. Übertragen Sie 10 Mikroliter der mit Trypanblau vermischten Zellen auf das Hämozytometer und zählen Sie die vier Gitter um die Außenseite. Für jede 10 Zentimeter große Zellplatte, die synchronisiert werden soll, fügen Sie fünf Milliliter vollständiges Medium und sechs Mikromolare Haphidcolin hinzu.

Übertragen Sie anschließend 100 Mikroliter des resuspendierten Zellpellets auf jede Zentimeterplatte und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Platten, um die Zellen an der G1S-Grenze zu synchronisieren. Vier Stunden vor dem Targeting das Medium absaugen, mit PBS waschen.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie fünf Milliliter vollständiges Medium hinzu. Stellen Sie die Platte für vier Stunden wieder in den Inkubator. Geben Sie die mutierte EGFP-Gensequenz in den Online-Generator von Zane Labs ein und wählen Sie die CRISPR-Guide-Sequenzen aus, die in unmittelbarer Nähe zur Zielstelle binden.

Mischen Sie die RNA in gleichen molaren Konzentrationen mit 45 Mikromolaren. Geben Sie 6,75 Mikroliter eines 200-Mikromol-Stammes CR-RNA und 6,75 Mikroliter eines 200-Mikromol-Stammes Tracer-RNA in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann 16,50 Mikroliter IDT-Puffer hinzu, um ein Endvolumen von 30 Mikrolitern zu erhalten.

Als nächstes erhitzen Sie die Mischung fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius in einer PCR-Maschine. Lassen Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen. Für jede Probe werden 2,22 Mikroliter CR-RNA auf den Tracer-RNA-Komplex und 2,78 Mikroliter IDT-Puffer auf ein Endvolumen von fünf Mikrolitern verdünnt.

Verdünnen Sie 1,67 Mikroliter Cas9-Protein aus einem 60-Mikromol-Stamm in 3,33 Mikrolitern niedrigem Serenmedium auf ein Endvolumen von fünf Mikrolitern. Mischen Sie fünf Mikroliter Cas9-Protein mit fünf Mikrolitern komplexer RNA. Aspirieren Sie das Medium, waschen Sie es mit fünf Millilitern PBS.

Aspirieren Sie das PBS und geben Sie einen Milliliter vorgewärmtes Trypsin auf jede 10 Zentimeter große Platte. Legen Sie die Platten in den Inkubator. Klopfen Sie dann auf die 10 Zentimeter große Platte, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt sind, und löschen Sie sie dann mit vier Millilitern vollständigem Medium, indem Sie es über die gesamte Oberfläche der Platte verteilen.

Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um Zellklumpen aufzubrechen, und übertragen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie 10 Mikroliter aus dem konischen 15-Milliliter-Röhrchen beiseite und kombinieren Sie es mit 10 Mikrolitern Trypanblau, um die Zellen zu zählen. Pelletieren Sie die Zellen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 125 x G bei Raumtemperatur drehen.

Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie es mit fünf Millilitern PBS. Bewerfen Sie die Zellen, indem Sie 125 x G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ausschleudern. Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension auf jede Küvette mit einem Elektroporationsspalt von vier Millimetern.

Fügen Sie 10 Mikroliter des RNP-Komplexes zu 100 Mikrolitern Zellen hinzu, bei einer Dichte von 5 x 10 zur fünften Zelle. Geben Sie zwei mikromolare ODN zu jeder Probe. Bringen Sie dann das Gestell zu einer Elektroporationsmaschine.

Schnippen Sie leicht mit jeder der Proben und legen Sie sie in die Kammer. Setzen Sie das Gestell wieder in die Haube ein und geben Sie jede Probe in eine Vertiefung mit zwei Millilitern vollständigem Medium in einer Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte, bevor Sie sie auf Korrekturstufen prüfen.

Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 500 Mikroliter vorgewärmtes Trypsin in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Legen Sie die Platten in den Inkubator.

Klopfen Sie dann auf die Platte, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt sind, und löschen Sie es dann mit einem Milliliter vollständigem Medium ab, indem Sie es über die gesamte Oberfläche der Vertiefung verteilen. Geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie. Nach dem Pelletieren der Zellen wird das Medium angesaugt und das Zellpellet in 500 Mikrolitern FACS-Puffer wieder suspendiert.

Die synchronisierten und freigesetzten HTT11619 Zellen werden in einer Konzentration von 5 x 10 auf die fünften Zellen pro 100 Mikroliter elektroporiert, wobei der RNP-Komplex bei 100 Pikosolen und 100 Pikosol von 72 NTODN bei 2,0 Mikromolaren liegt. Übertragen Sie die Zellen auf eine Sechs-Well-Platte und lassen Sie sie 72 Stunden lang regenerieren. Sortieren Sie anschließend die Zellen einzeln in 96-Well-Platten, indem Sie einen fac-Sortierer mit einem 488-Nanometer-Laser für EGFP plus Minus verwenden.

Isolieren Sie aus den Vertiefungen, die Wachstum aufweisen, zelluläre gDNA mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Isolationskit. Amplifizieren Sie die Regionen, die die Zielbase umgeben, per PCR. Führen Sie abschließend eine DNA-Sequenzierungsanalyse der Proben durch.

72 Stunden nach der Inkubation bestätigt die Durchflusszytometrie-Analyse die funktionelle Reparatur des grün fluoreszierenden Proteins. Es wurde eine allmähliche Dosisreaktion beobachtet, wenn die koordinierten Spiegel von RNP und 72NT anstiegen. Eine Gen-Editing-Reaktion in Abwesenheit des RNP-Partikels korrigierte etwa 1% der Zielzellen, wenn eine 10-fach höhere Konzentration des 72NT-Oligonukleotids in der Einzelagenten-Gen-Editing-Reaktion verwendet wurde.

16 Klone der EGFP-positiven Proben wurden ausgewählt und die genetische Integrität der Zielstelle mit einem DNA-Sequenzierer analysiert. Alle 16 EGFP-positiven Zellen enthielten den vorhergesagten Nukleotidaustausch an der Zielstelle. 15 nicht-grüne klonale Isolate wurden auf Heterogenität an der Zielstelle analysiert.

In etwa der Hälfte der Proben wurde kein DNA-Basenaustausch beobachtet. Der Rest der untersuchten klonalen Expansionen zeigte eine heterogene Population von Deletionsmutationen. Die Deletionsgröße reichte von einer Base bis zu 19 Basen.

Das Zusammenspiel von CRISPR-, Cas9- und einzelsträngigen Oligonukleotid-Donator-DNA-Molekülen kann zur präzisen Reparatur der Punktmutation im EGFP-Gen führen, wie dieses neue Modell für die Reparatur von Punktmutationen zeigt, ein molekularer Signalweg, bei dem die Spender-DNA auf die Replikationsvorlage für die Reparatur der mutierten Base zugreift. Ein Prozess, den wir ExACT genannt haben. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Geneditierung, um den Grad der Heterogenität am Zielort als Ergebnis der Gen-Editing-Aktivität in Zelllinien zu untersuchen.