Name: DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie DNA-Polymerase-Aktivität auf Einzelnukleotid-Ebene mit Acrylamid-Gelelektrophorese und Nahinfrarot-Fluoreszenz analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Beobachtung von DNA-Modifikationen.

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Diese Arbeit wurde durch die Research Corporation für wissenschaftlichen Fortschritt (Cottrell College Scholar Award #22548) und TriLink Biotechnologien (ResearchReward Grant #G139) unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir einen Test zur Charakterisierung der DNA-Polymerase-vermittelten Synthese von M-DNA beschrieben. Von Nah-Infrarot-beschrifteten DNA Zündkapseln und denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, um unterschiedlich große Oligonukleotide zu lösen, erhalten wir Einzel-Nukleotid-Auflösung auf Oligonukleotide, ermöglicht die präzise Messung der Synthese. Diese Ansätze können verwendet werden, um entweder die gesamte Aktivität des Enzyms (Abschnitt 2.1) messen oder die Michaelis-Menten-Parameter der einzelnen ...

DNA-Polymerasen führen Sie genaue und effiziente DNA-Synthese und sind unerlässlich, um die Integrität des Genoms. Die Möglichkeit, Hunderte von Nukleotiden pro Sekunde zu synthetisieren, ohne Fehler macht auch DNA-Polymerasen wesentliche Instrumente in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Jedoch schränken diese Eigenschaften auch die Anwendungen für M-DNA-Substrate; im Allgemeinen können nicht natürlichen DNA-Polymerasen viele potentiell wertvolle M-DNA-Substrate, wahrscheinlich wegen zu hohen Selektionsdruck gegen die Verwendung von nicht standardmäßigen Substrate in Vivozu synthetisieren. Viele Gruppen entwickelten gerichteten Evolution Ansätze um mutierte DNA-Polymerasen von M-DNA Synthese1a,2,3,4,5fähig zu generieren; Diese Bemühungen haben das biotechnologische Dienstprogramm DNA-6,7,8erweitert.
Die Fähigkeit des mutierten DNA-Polymerasen, M-DNA synthetisieren bewerten wir9,10, und andere11,12,13 RadioButtonList-Steuerelement in Vitro Messungen der DNA Polymeraseaktivität, die in dieser Handschrift beschrieben werden. In diesen Experimenten sind DNA-Polymerasen zusammen mit beschrifteten Grundierung/Vorlage duplex und Nukleosid Triphosphat Substrate inkubierten; die Produkte werden durch Gelelektrophorese bewertet. Je nach spezifischen experimentellen Frage, mutierte DNA-Polymerasen, modifizierte Primer können geänderten Vorlagen oder modifizierte Nukleosid Triphosphate verwendet werden, ermöglicht die systematische biochemische Auswertung der mutierten Enzym-Aktivität.
In der Vergangenheit haben diese Tests auf einem 5' radioaktive Aufkleber, DNA-Synthese zu verfolgen verlassen; am häufigsten sind 32P und 33P benutzt worden; in der Regel ist das beschriften mit T4 Polynukleotid Kinase11erreicht. Durch die endliche Lebensdauer und relativ hohen Kosten der radioaktiven Etiketten und deren sichere Entsorgung verwendet unsere Fraktion jedoch stattdessen ein Nahinfrarot-Fluorophor synthetische 5' DNA bezeichnet. Verwenden einen relativ kostengünstige Nahinfrarot-Gel-Imager, haben wir ähnliche Nachweisgrenzen zu früheren Studien, die mit radioaktiven Etiketten (unveröffentlichte Ergebnisse) beobachtet. Wir haben erfolgreich reproduziert, vorbei an Beobachtungen9, und wir haben keinen großen quantitativen Unterschied mit zuvor gemessenen Geschwindigkeitskonstanten (unveröffentlichte Ergebnisse) nicht eingehalten.
Um die Größe der DNA und damit das Ausmaß der DNA-Synthese zu analysieren, setzen wir auf Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Methoden ursprünglich für Sanger-Sequenzierung14 vor dem Aufkommen der Kapillarelektrophorese15entwickelt. Der Abstand der Trennung oder Mobilität kann als ein Maß der Molekulargewicht verwendet werden; Großformat, vertikale Polyacrylamid-Gele können Einzel-Nukleotid-Auflösung, ermöglicht quantitative Beobachtung der DNA Oligonucleotides unterschiedlicher Länge erreichen.
Gemeinsam sind diese Experimente eine robuste Methode zur Charakterisierung der Polymerase. Aufgrund der Zeit ist sensiblen Reaktionen, Vorbereitung und Betreuung notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Weiter, während die Acrylamid-Gel eine äußerst effektive Methode zur Messung der DNA-Synthese, sowie zahlreiche andere DNA Änderungen Reaktionen, mit Einzel-Nukleotid-Auflösung ist, kann es technisch anspruchsvoll sein. Das Protokoll hier wird hoffentlich ermöglichen Benutzern, diese Experimente durchführen, während die häufigsten Fehler zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetyliertes BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (d.h. DTT)</td><td>Forschung Produkte International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (d.h. EDTA) (0,5M Lösung)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (alle anderen modifizierten NTPs)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>sortierter</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>Wir verwenden den Farbstoff IR700, der als kundenspezifische Synthese erworben werden kann. Wir kaufen die Oligonukleotide in der Regel HPLC-gereinigt. Die Sequenz ist 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>Template 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>Wir kaufen in der Regel die Oligonukleotide HPLC gereinigt. Die Sequenz ist 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67 % Acrylamid und 1,33 % Bis-Acrylamid</td></tr><tr><td>Tris/Borat/EDTA (TBE) fest</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff hochreine</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Gelband</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Große weiße Federklemme Polypropylen</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm Abstandshalter</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Gekerbtes Glasplattenset</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Keilplattenseparator</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Kamm für die Gelelektrophorese</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophorese-Rig</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td></td><td></td><td>Wir verwenden ein Milli-Q-System aus Millipore-DNA-Polymerasen</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Diese bereiten wir in unserem Labor anhand veröffentlichter Protokolle auf.</td></tr></tbody></table>

dna-polymerase-aktivität assay mit nahinfrarot-leuchtstoff beschrifteten dna durch acrylamid gelelektrophorese sichtbar gemacht

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Für jedes Enzym sind robustere, quantitative Methoden zur Charakterisierung von Einheimischen und veränderter Enzyme erforderlich. Für DNA-Polymerasen kann DNA-Synthese mit einem in-vitro- DNA-Synthese Assay gefolgt von Polyacrylamid Gelelektrophorese charakterisiert werden. Dieser Test soll Synthese der natürlichen DNA und veränderte DNA (M-DNA) zu quantifizieren. Diese Ansätze sind besonders nützlich für die Lösung Oligonukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung, Beobachtung der einzelnen Schritte bei der enzymatischen Oligonukleotid-Synthese ermöglicht. Diese Methoden wurden für die Bewertung von einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften wie die Messung von stationären Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Schritte der DNA-Synthese, die Fehlerquote der DNA-Synthese und DNA Bindungsaffinität angewendet. Durch die Verwendung modifiziert Komponenten einschließlich aber nicht beschränkt auf, veränderte Nukleosid Triphosphate (NTP), M-DNA und/oder mutierte DNA-Polymerasen, der relative Nutzen der Substrat-DNA-Polymerase, die Paare effektiv ausgewertet werden können. Hier zeigen wir die Probe selbst, einschließlich der Änderungen, die vorgenommen werden müssen, um nicht traditionele Primer-DNA Kennzeichnung Strategien wie Nahinfrarot-Fluoreszent DNA mit der Bezeichnung unterzubringen. Darüber hinaus haben wir entscheidende technische Schritte für Acrylamid Gel Gießen detaillierte und ausgeführt, die häufig lassen sich technisch anspruchsvoll.

Eine erfolgreiche Polyacrylamid-Gelanalyse der qualitativen Charakterisierung der Gesamtaktivität (beschrieben in Abschnitt 2.1, Abbildung 1) und der Steady-State Kinetik (siehe die Anmerkung am Schluss des Abschnitts 2.1, Abbildung 2) werden angezeigt. Eine erfolglose Polyacrylamid Gelanalyse zeigt auch (Abbildung 3).
Beachten Sie, dass ke...

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität der DNA-Polymerase auf Ebene einzelner Nukleotide zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Polymerase zu beantworten, beispielsweise welche spezifischen Schritte der DNA-Synthese durch DNA-Modifikationen begrenzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass einzelne Nukleotidänderungen beobachtet werden können, was eine präzise Erfassung der Polymeraseaktivität ermöglicht.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, im Voraus zu planen. Viele der Schritte sind zeitkritisch. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst die Puffer, die DNA-Duplex-Mischung und die Proteindilution gemäß der schriftlichen Anleitung vor.Als Nächstes stellen Sie die Temperatur eines Trockenbades auf 50 Grad Celsius ein. Geben Sie 24 Mikroliter der annealierten Duplexmischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 25 Mikroliter 2X dNTPs enthält. Danach überführen Sie 9,8 Mikroliter dieser Mischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 20 Mikroliter Puffer zur Enzyminaktivierung (orange) enthält, um die Kontrolle ohne Enzym vorzubereiten.Fügen Sie dann 0,8 Mikroliter 50X-Enzym zur duplexierten dNTP-Mischung hinzu. Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette für große Volumina gründlich durch. Inkubieren Sie im Trockenbad.Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter jeder Reaktionsmischung entnehmen und zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 20 Mikrolitern Stopfpuffer Orange hinzufügen. Bereiten Sie die Acrylamid-Mischung für die Gelelektrophorese gemäß dem schriftlichen Protokoll vor. Waschen Sie anschließend zwei 33 cm × 42 cm große Gelascheiben gründlich mit Seife und Wasser. Trocknen Sie jede Plattenoberseite mit Papiertüchern ab und verwenden Sie anschließend feuchte Tücher für empfindliche Arbeiten, um die verbleibenden Bereiche zu trocknen. Spülen Sie die getrockneten Platten mit 70 %igem Ethanol ab und wischen Sie jede erneut mit den Tüchern für empfindliche Arbeiten ab. Danach führen Sie eine behandschuhte Hand unter entionisiertes Wasser und befeuchten damit vorsichtig einige 0,75 Millimeter dicke Abstandshalter mit den angefeuchteten Fingern.Platzieren Sie die Abstandshalter entlang der Kante der gezahnten Platte. Reinigen Sie mit Reinigungstüchern Wasser, das möglicherweise auf die Platten gespritzt ist. Fügen Sie die Platten zusammen und bedecken Sie die Unterseite und Seiten mit Gel-Tape, wobei die Oberseite unbedeckt bleibt.Stellen Sie sicher, dass das Klebeband gleichmäßig ausgerichtet und fest verschlossen ist. Schneiden Sie die Enden des Klebebands mit einem Rasiermesser ab. Anschließend wird eine zusätzliche Schicht Klebeband an der Unterseite des Gels angebracht.Nach der Zubereitung der Reagenzien nehmen Sie eine Sprühflasche zur Hand und entfernen Sie den spitzen Trichter. Geben Sie mithilfe eines Messzylinders 125 Milliliter Wasser hinzu. Markieren Sie anschließend mit einem Permanentstift den Füllstand des Wassers außen auf der Flasche.Entfernen Sie das Wasser. Richten Sie anschließend die Korkringe und die Platten-Sandwich-Anordnung wie im textlichen Protokoll beschrieben neben einem Waschbecken ein. Stellen Sie die leere Sprühflasche sowie die vorbereiteten Lösungen von APS und TEMED auf die andere Seite des Waschbeckens.Stellen Sie einen Kamm mit der gewünschten Anzahl an Vertiefungen und vier Klammern in die Nähe. Geben Sie dann 20 %iges Acrylamid-Gel-Lösung in die Spritzflasche, bis sie den markierten Füllstand erreicht hat. Geben Sie gleichzeitig 120 Mikroliter TEMED und 600 Mikroliter APS zur Polyacrylamid-Gel-Lösung hinzu.Fügen Sie schnell weitere 600 Mikroliter APS hinzu. Verschließen Sie die Sprühflasche umgehend und mischen Sie durch Schwenken. Stellen Sie danach das Platten-Sandwich in die Spüle.Beginnen Sie mit dem Gießen, indem Sie langsam und gleichmäßig Druck auf die Flasche ausüben, um einen stetigen Fluss der Gel-Lösung sicherzustellen. Gießen Sie, bis das Gel den markierten Bereich erreicht hat und leicht über die markierte Kante hinausläuft. Kippen Sie die Platten, um Luftblasen zu entfernen.Fügen Sie dann den Gelkamm in das Platten-Sandwich ein. Platzieren Sie die Klammern so am Kamm, dass sie nach unten drücken und eine gleichmäßige Verteilung der Vertiefungen ermöglichen. Entsorgen Sie die restliche Gellösung in der Spritzflasche umgehend in einen geeigneten Abfallbehälter.Mit entionisiertem Wasser dreimal durch die Sprühspitze spülen, um die Flasche zu reinigen. Entfernen Sie zunächst alle Büroklammern aus dem Platten-Sandwich. Schneiden Sie mit einem Rasiermesser das Geltape an den Rändern ab und entfernen Sie es.Wischen Sie die Glasoberflächen mit Papiertüchern und Wasser ab, um so viel wie möglich von der polymerisierten Gel-Rückständen zu entfernen. Verwenden Sie ein Rasiermesser entlang der Ränder, um verbliebene Gelreste abzukratzen. Danach drücken Sie den Kamm gleichmäßig von beiden Seiten, um ihn zu entfernen.Entfernen Sie mit einem Rasiermesser überschüssiges Gel entlang der Oberseite des Platten-Sandwichs. Schneiden Sie dann entlang der markierten Kante der Platte. Spülen Sie die Vertiefungen mit einer Spritze und entionisiertem Wasser aus, um Rückstände zu entfernen.Stellen Sie sicher, dass jedes Loch mit Wasser gefüllt werden kann und nicht durch überschüssiges polymerisiertes Gel verstopft ist. Bringen Sie anschließend das Platten-Sandwich in das Gerät ein, sodass die längere Platte nach außen weist und der ausgesparte Bereich nach innen zeigt. Befestigen Sie das Platten-Sandwich gemeinsam mit der Aluminiumplatte am Gerät. Fügen Sie zusätzliche Klammern an die Außenseite der Platte hinzu, um ein gleichmäßiges Laufen zu fördern. Geben Sie TBE-Puffer hinzu, wobei nur so viel verwendet werden sollte, dass die Basisnuten und die Vertiefungen oben bedeckt sind. Führen Sie die Gelelektrophorese 20 Minuten lang bei 50 Watt durch, um die Platten aufzuwärmen.Verwenden Sie anschließend eine Spritze und TBE-Puffer, um die Vertiefungen zu reinigen. Wiederholen Sie den Spritzenwaschvorgang mehrmals, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Puffer-Salze aus den Vertiefungen entfernt wurden. Richten Sie danach die äußersten Spuren auf jeder Seite wie im textbasierten Protokoll beschrieben ein.Geben Sie drei Mikroliter 95 % Formamid mit Bromphenolblau in die entsprechenden Vertiefungen des Gels. Beladen Sie alle Proben und lassen Sie sie eine Minute lang absinken. Schließen Sie das Gerät an die Stromquelle an und stellen Sie die Leistung auf 50 bis 55 Watt ein.Laufen Sie das Gel etwa drei Stunden lang oder bis die Bromphenolblau-Farbstofffront mindestens zwei Drittel der Strecke am Gel zurückgelegt hat. Danach bilden Sie das Gel ab, wie im textlichen Protokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein Assay entwickelt, um die DNA-Polymerase-vermittelte Synthese modifizierter DNA zu charakterisieren.Eine erfolgreiche qualitative Charakterisierung der Gesamtaktivität zeigt einzelne gut definierte und regelmäßige Banden. Die Aktivität wird anhand der Länge der Produkte sowie des Anteils des markierten Primers beurteilt, der in größere Produkte umgewandelt wurde. Wie ersichtlich ist, sind E6 und E5 die aktivsten Enzyme, während E4 und E1 die am wenigsten aktiven sind. Mithilfe dieser Methoden kann auch eine quantitative Analyse unter Verwendung der stationären Kinetik durchgeführt werden. Da nur die N- und die N+1-Produkte synthetisiert werden, kann das einzelne Ereignis erfolgreich quantifiziert werden. Die hier beschriebene grundlegende Methodik kann ebenfalls verwendet werden, um eine Reihe anderer DNA- oder RNA-modifizierender Enzyme außer Polymerasen zu untersuchen.

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DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Dieses Protokoll stellt einen auf Fluoreszenzmikroskopie basierenden Einzelmolekül-DNA-Replikationsassay dar, der die Echtzeit-Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerasen und Hindernissen wie G-Quadruplex-Strukturen ermöglicht.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

Erfahren Sie, wie Sie DNA-Polymerase-Aktivität auf Einzelnukleotid-Ebene mit Acrylamid-Gelelektrophorese und Nahinfrarot-Fluoreszenz analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Beobachtung von DNA-Modifikationen.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

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