Name: DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie DNA-Polymerase-Aktivität auf Einzelnukleotid-Ebene mit Acrylamid-Gelelektrophorese und Nahinfrarot-Fluoreszenz analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Beobachtung von DNA-Modifikationen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch die Research Corporation für wissenschaftlichen Fortschritt (Cottrell College Scholar Award #22548) und TriLink Biotechnologien (ResearchReward Grant #G139) unterstützt.

<ol><li>Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerase%2C+RNA+polymerase+and+reverse+transcriptase+activity+in+a+single+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide.</a> J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).</li>
<li>Chen, T., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+polymerase+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Directed polymerase evolution.</a> FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+DNA+polymerases+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+novel+polymerase+activities%3A+mutation+of+a+DNA+polymerase+into+an+efficient+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+thermophilic+DNA+polymerases+for+the+recognition+and+amplification+of+C2%27-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA.</a> Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).</li>
<li>Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-Fluoro-Modified+Aptamers+with+Optimized+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties.</a> J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).</li>
<li>Taylor, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysts+from+synthetic+genetic+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysts from synthetic genetic polymers.</a> Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).</li>
<li>Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+2%27-deoxy-2%27-fluoroarabinonucleotide+%28FANA%29+aptamers+that+bind+HIV-1+reverse+transcriptase+with+picomolar+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity.</a> Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).</li>
<li>Schultz, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+DNA+Polymerase+Mutants+and+2%27-Modified+Sugar+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition.</a> Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).</li>
<li>Rosenblum, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+discovery+of+new+combinations+of+mutant+DNA+polymerases+and+modified+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates.</a> Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).</li>
<li>Creighton, S., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+kinetic+analysis+of+DNA+polymerase+fidelity+in+the+presence+of+proofreading+using+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).</li>
<li>Joyce, C. M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity%3A+kinetics%2C+structure%2C+and+checkpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints.</a> Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).</li>
<li>Leconte, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+characterization%2C+and+optimization+of+an+unnatural+base+pair+for+expansion+of+the+genetic+alphabet%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet.</a> J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Karger, B. L., Guttman, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2782523/">DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis.</a> Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression%2C+purification%2C+and+enzymatic+characterization+of+full-length+Thermus+aquaticus+DNA+polymerase+and+a+truncated+form+deficient+in+5%27+to+3%27+exonuclease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity.</a> PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).</li>
<li>Lawyer, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterization%2C+and+expression+in+Escherichia+coli+of+the+DNA+polymerase+gene+from+Thermus+aquaticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus.</a> J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).</li>
<li>Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+DNA+polymerase+I+%28Klenow+fragment%29+with+reduced+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity.</a> Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li>
<li>Larsen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+expanding+polymerase+function+by+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics.</a> Nat Commun. 7, 11235(2016).</li>
<li>Cozens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Synthesis+of+Nucleic+Acids+with+Defined+Regioisomeric+2%27-5%27+Linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier haben wir einen Test zur Charakterisierung der DNA-Polymerase-vermittelten Synthese von M-DNA beschrieben. Von Nah-Infrarot-beschrifteten DNA Zündkapseln und denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese, um unterschiedlich große Oligonukleotide zu lösen, erhalten wir Einzel-Nukleotid-Auflösung auf Oligonukleotide, ermöglicht die präzise Messung der Synthese. Diese Ansätze können verwendet werden, um entweder die gesamte Aktivität des Enzyms (Abschnitt 2.1) messen oder die Michaelis-Menten-Parameter der einzelnen ...

DNA-Polymerasen führen Sie genaue und effiziente DNA-Synthese und sind unerlässlich, um die Integrität des Genoms. Die Möglichkeit, Hunderte von Nukleotiden pro Sekunde zu synthetisieren, ohne Fehler macht auch DNA-Polymerasen wesentliche Instrumente in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Jedoch schränken diese Eigenschaften auch die Anwendungen für M-DNA-Substrate; im Allgemeinen können nicht natürlichen DNA-Polymerasen viele potentiell wertvolle M-DNA-Substrate, wahrscheinlich wegen zu hohen Selektionsdruck gegen die Verwendung von nicht standardmäßigen Substrate in Vivozu synthetisieren. Viele Gruppen entwickelten gerichteten Evolution Ansätze um mutierte DNA-Polymerasen von M-DNA Synthese1a,2,3,4,5fähig zu generieren; Diese Bemühungen haben das biotechnologische Dienstprogramm DNA-6,7,8erweitert.
Die Fähigkeit des mutierten DNA-Polymerasen, M-DNA synthetisieren bewerten wir9,10, und andere11,12,13 RadioButtonList-Steuerelement in Vitro Messungen der DNA Polymeraseaktivität, die in dieser Handschrift beschrieben werden. In diesen Experimenten sind DNA-Polymerasen zusammen mit beschrifteten Grundierung/Vorlage duplex und Nukleosid Triphosphat Substrate inkubierten; die Produkte werden durch Gelelektrophorese bewertet. Je nach spezifischen experimentellen Frage, mutierte DNA-Polymerasen, modifizierte Primer können geänderten Vorlagen oder modifizierte Nukleosid Triphosphate verwendet werden, ermöglicht die systematische biochemische Auswertung der mutierten Enzym-Aktivität.
In der Vergangenheit haben diese Tests auf einem 5' radioaktive Aufkleber, DNA-Synthese zu verfolgen verlassen; am häufigsten sind 32P und 33P benutzt worden; in der Regel ist das beschriften mit T4 Polynukleotid Kinase11erreicht. Durch die endliche Lebensdauer und relativ hohen Kosten der radioaktiven Etiketten und deren sichere Entsorgung verwendet unsere Fraktion jedoch stattdessen ein Nahinfrarot-Fluorophor synthetische 5' DNA bezeichnet. Verwenden einen relativ kostengünstige Nahinfrarot-Gel-Imager, haben wir ähnliche Nachweisgrenzen zu früheren Studien, die mit radioaktiven Etiketten (unveröffentlichte Ergebnisse) beobachtet. Wir haben erfolgreich reproduziert, vorbei an Beobachtungen9, und wir haben keinen großen quantitativen Unterschied mit zuvor gemessenen Geschwindigkeitskonstanten (unveröffentlichte Ergebnisse) nicht eingehalten.
Um die Größe der DNA und damit das Ausmaß der DNA-Synthese zu analysieren, setzen wir auf Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese Methoden ursprünglich für Sanger-Sequenzierung14 vor dem Aufkommen der Kapillarelektrophorese15entwickelt. Der Abstand der Trennung oder Mobilität kann als ein Maß der Molekulargewicht verwendet werden; Großformat, vertikale Polyacrylamid-Gele können Einzel-Nukleotid-Auflösung, ermöglicht quantitative Beobachtung der DNA Oligonucleotides unterschiedlicher Länge erreichen.
Gemeinsam sind diese Experimente eine robuste Methode zur Charakterisierung der Polymerase. Aufgrund der Zeit ist sensiblen Reaktionen, Vorbereitung und Betreuung notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Weiter, während die Acrylamid-Gel eine äußerst effektive Methode zur Messung der DNA-Synthese, sowie zahlreiche andere DNA Änderungen Reaktionen, mit Einzel-Nukleotid-Auflösung ist, kann es technisch anspruchsvoll sein. Das Protokoll hier wird hoffentlich ermöglichen Benutzern, diese Experimente durchführen, während die häufigsten Fehler zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>Tris HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetyliertes BSA</td><td>Promega</td><td>PR-R3961</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (d.h. DTT)</td><td>Forschung Produkte International</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (d.h. EDTA) (0,5M Lösung)</td><td>Sigma</td><td>03690-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Acros</td><td>AC42374-5000</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-701-6973</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (riboNTPs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-341 (343, 345, 347)</td><td></td></tr><tr><td>M-dNTPs (alle anderen modifizierten NTPs)</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>sortierter</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>Wir verwenden den Farbstoff IR700, der als kundenspezifische Synthese erworben werden kann. Wir kaufen die Oligonukleotide in der Regel HPLC-gereinigt. Die Sequenz ist 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA</td></tr><tr><td>Template 1</td><td>IDT DNA / TriLink Biotechnologies</td><td>Custom Syntheses</td><td>Wir kaufen in der Regel die Oligonukleotide HPLC gereinigt. Die Sequenz ist 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Research Products International</td><td>A11405</td><td>38,67 % Acrylamid und 1,33 % Bis-Acrylamid</td></tr><tr><td>Tris/Borat/EDTA (TBE) fest</td><td>Research Products International</td><td>T22020</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff hochreine</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>Gelband</td><td>CBS Scientific</td><td>GT-72-10</td><td></td></tr><tr><td>Große weiße Federklemme Polypropylen</td><td>CBS Scientific</td><td>GPC-0001</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP15020</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm Abstandshalter</td><td>CBS Scientific</td><td>SGS-20-0740A</td><td></td></tr><tr><td>33x42 Gekerbtes Glasplattenset</td><td>CBS Scientific</td><td>SGP33-040A</td><td></td></tr><tr><td>Keilplattenseparator</td><td>CBS Scientific</td><td>WPS-100</td><td></td></tr><tr><td>Kamm für die Gelelektrophorese</td><td>CBS Scientific</td><td>SG33-0734</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophorese-Rig</td><td>CBS Scientific</td><td>SG-400-33</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td></td><td></td><td>Wir verwenden ein Milli-Q-System aus Millipore-DNA-Polymerasen</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Diese bereiten wir in unserem Labor anhand veröffentlichter Protokolle auf.</td></tr></tbody></table>

dna-polymerase-aktivität assay mit nahinfrarot-leuchtstoff beschrifteten dna durch acrylamid gelelektrophorese sichtbar gemacht

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Für jedes Enzym sind robustere, quantitative Methoden zur Charakterisierung von Einheimischen und veränderter Enzyme erforderlich. Für DNA-Polymerasen kann DNA-Synthese mit einem in-vitro- DNA-Synthese Assay gefolgt von Polyacrylamid Gelelektrophorese charakterisiert werden. Dieser Test soll Synthese der natürlichen DNA und veränderte DNA (M-DNA) zu quantifizieren. Diese Ansätze sind besonders nützlich für die Lösung Oligonukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung, Beobachtung der einzelnen Schritte bei der enzymatischen Oligonukleotid-Synthese ermöglicht. Diese Methoden wurden für die Bewertung von einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften wie die Messung von stationären Geschwindigkeitskonstanten der einzelnen Schritte der DNA-Synthese, die Fehlerquote der DNA-Synthese und DNA Bindungsaffinität angewendet. Durch die Verwendung modifiziert Komponenten einschließlich aber nicht beschränkt auf, veränderte Nukleosid Triphosphate (NTP), M-DNA und/oder mutierte DNA-Polymerasen, der relative Nutzen der Substrat-DNA-Polymerase, die Paare effektiv ausgewertet werden können. Hier zeigen wir die Probe selbst, einschließlich der Änderungen, die vorgenommen werden müssen, um nicht traditionele Primer-DNA Kennzeichnung Strategien wie Nahinfrarot-Fluoreszent DNA mit der Bezeichnung unterzubringen. Darüber hinaus haben wir entscheidende technische Schritte für Acrylamid Gel Gießen detaillierte und ausgeführt, die häufig lassen sich technisch anspruchsvoll.

Eine erfolgreiche Polyacrylamid-Gelanalyse der qualitativen Charakterisierung der Gesamtaktivität (beschrieben in Abschnitt 2.1, Abbildung 1) und der Steady-State Kinetik (siehe die Anmerkung am Schluss des Abschnitts 2.1, Abbildung 2) werden angezeigt. Eine erfolglose Polyacrylamid Gelanalyse zeigt auch (Abbildung 3).
Beachten Sie, dass ke...

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität der DNA-Polymerase auf Ebene einzelner Nukleotide zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Polymerase zu beantworten, beispielsweise welche spezifischen Schritte der DNA-Synthese durch DNA-Modifikationen begrenzt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass einzelne Nukleotidänderungen beobachtet werden können, was eine präzise Erfassung der Polymeraseaktivität ermöglicht.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, im Voraus zu planen. Viele der Schritte sind zeitkritisch. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst die Puffer, die DNA-Duplex-Mischung und die Proteindilution gemäß der schriftlichen Anleitung vor.Als Nächstes stellen Sie die Temperatur eines Trockenbades auf 50 Grad Celsius ein. Geben Sie 24 Mikroliter der annealierten Duplexmischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 25 Mikroliter 2X dNTPs enthält. Danach überführen Sie 9,8 Mikroliter dieser Mischung in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 20 Mikroliter Puffer zur Enzyminaktivierung (orange) enthält, um die Kontrolle ohne Enzym vorzubereiten.Fügen Sie dann 0,8 Mikroliter 50X-E

dna-polymerase-activity-assay-using-near-infrared-fluorescent-labeled

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Diese Methode erlaubt selektive Färbung und Quantifizierung der DNA in den Gelen durch Einweichen das Gel in einem SYBR Grün ich / Nitro blau Tetrazoliumsalz Lösung und setzen Sie sie dem Sonnenlicht oder eine blaue Lichtquelle. Dies erzeugt einen sichtbaren Niederschlag und erfordert fast keine Ausrüstung, wodurch es ideal für den mobilen Einsatz.

DNA-Färbung Methode basiert auf Formazan Niederschlag induziert durch blaues Licht aussetzen

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

In dieser Studie wird ein einfacher, benutzerfreundlicher ratiometrischer FRET-Assay für den Nachweis und die quantitative Beurteilung der DNase-Aktivität vorgestellt und seine Anwendung bei der Analyse einer schwachen Nuklease demonstriert.

Beurteilung der DNase-Aktivität durch ratiometrischen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Dieses Protokoll stellt einen auf Fluoreszenzmikroskopie basierenden Einzelmolekül-DNA-Replikationsassay dar, der die Echtzeit-Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerasen und Hindernissen wie G-Quadruplex-Strukturen ermöglicht.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

Erfahren Sie, wie Sie DNA-Polymerase-Aktivität auf Einzelnukleotid-Ebene mit Acrylamid-Gelelektrophorese und Nahinfrarot-Fluoreszenz analysieren. Diese Methode ermöglicht präzise Beobachtung von DNA-Modifikationen.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Weitere Videos entdecken