Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kommerzielle elektronische Platten, die für einen Echtzeit-Zellanalysator (Real-Time Cell Analyzer, RTCA) geeignet sind, wiederherzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Regenerierung von Einweg-Chips auf Goldbasis zu beantworten, einschließlich der Wiederherstellung elektronischer Platten, die im RTCA verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Regenerierung mit milden und leicht verfügbaren Laborreagenzien mit geringer Toxizität durchgeführt werden kann.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir begannen, den Echtzeit-Zellanalysator zu verwenden, der kostenintensive goldbasierte Chips benötigt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Inkubation und Proliferation von A549-Zellen in einer Zellkulturschale, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 150 Mikroliter Zellkulturmedium in jedes Inkubationswell der elektronischen Platte L8. Lassen Sie die Platte 30 Minuten lang in der Biosicherheitswerkbank zur Equilibrierung stehen.

Nach 30 Minuten manuell die elektronische Platte L8 im Echtzeit-Zellanalysator im CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius einsetzen. Anschließend das Bedienprogramm des Echtzeit-Zellanalysators am Computer starten. Auf der Standardseite zur Versuchsanlage das Versuchsmodell auswählen und den laufenden Assay benennen.

Wählen Sie auf der Layout-Seite die entsprechenden Vertiefungen aus, die in das Experiment einbezogen werden, und geben Sie die Informationen wie Zelltyp, Anzahl und Wirkstoffnamen in die Eingabefelder ein. Fügen Sie auf der Zeitplan-Seite die experimentellen Schritte hinzu, wählen Sie dann die Laufzeit jedes Schritts sowie das Intervall für die Echtzeit-Datenerfassung aus. Klicken Sie auf „Start“, um die Hintergrundimpedanz des Mediums zu messen.

Die Versuchsdatei wird gespeichert. Die resultierenden Daten werden automatisch subtrahiert. Fügen Sie auf der Diagrammseite Vertiefungen hinzu, und der Graph des Zeit-Zellindex wird angezeigt.

Bei dem Zellproliferationsversuch zuerst die Pausetaste anklicken, um das Programm anzuhalten. Danach die elektronische Platte herausnehmen und pro Vertiefung 100 Mikroliter A549-Zellsuspensionspuffer bei Raumtemperatur hinzufügen. Die Platte 30 Minuten im Biosicherheitswerk abstellen, damit sich die Zellen auf den Boden der Inkubationsvertiefungen absetzen können.

Setzen Sie die elektronische Platte manuell in die Station des Echtzeit-Zellanalysegeräts ein. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Start“, um das Experiment fortzusetzen. Auf der Diagrammseite zeichnet der Analyzer während des gesamten Experiments kontinuierlich die Zellindexwerte oder Kurven auf.

Wenn das Experiment abgeschlossen ist, rufen Sie die Diagrammseite auf und öffnen Sie die Versuchsdatei. Wählen Sie anschließend alle getesteten Inkubationsgefäße und die resultierenden Kurven des Zellindex aus, die ein letztes Mal vor der Zugabe pharmazeutischer Wirkstoffe oder vor einem Mediumwechsel gemittelt oder normalisiert werden können, um Variationen zwischen den Assays zu verringern. Auf der Seite zur Datenanalyse können EC50- oder IC50-Werte berechnet werden.

Nach der Durchführung der Zytotoxizitätsbewertung des Antikrebsmittels gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll entnehmen Sie die elektronische Platte mit den Zellen von der Echtzeit-Zellanalysator-Station. Stellen Sie die verwendete elektronische Platte in eine sterile Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur und mischen Sie das Kulturmedium gründlich mit einer Pipette. Anschließend pipettieren Sie mithilfe einer Pipette das gesamte Medium ab.

Spülen Sie die elektronischen Platten dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Verdauen Sie die verbleibenden Zellen auf den elektronischen Platten mit frisch zubereiteter 0,25 %iger Trypsinlösung eine bis zwei Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Sobald der Verdauungsprozess abgeschlossen ist, mischen Sie im Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur die Inkubationslösung fünf bis zehnmal mit einer Pipette und entfernen Sie anschließend die Lösung.

Spülen Sie die elektronischen Platten zweimal mit je 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser. Anschließend waschen Sie zweimal mit je 200 Mikrolitern 100 %igem Ethanol, gefolgt von der gleichen Menge 75 %igem Ethanol, ebenfalls zweimal. Zum Schluss spülen Sie erneut zweimal mit je 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser.

Drehen Sie die elektronische Platte auf eine sterile Mullkompresse oder ein Papiertuch, um das restliche Wasser bei Raumtemperatur abzudekantieren. Führen Sie anschließend eine UV-Sterilisation der regenerierten elektronischen Platte für ein bis zwei Stunden im Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur durch. Nach der Verwendung der Platten für die Arzneimittelfreisetzung unter Verwendung mesoporösen Materials, wie im Textprotokoll beschrieben, verdauen Sie die verbleibenden Zellen wie zuvor mit Trypsin.

Da die Pipette häufig in den Experimenten verwendet wird, sollte darauf geachtet werden, dass die Spitze und die Oberfläche der Mikrochips nicht verkratzt werden. Spülen Sie die Mikrochips einmal mit 200 µL entionisiertem Wasser im Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur. Anschließend spülen Sie die Mikrochips zweimal mit jeweils 200 µL absolutem Ethanol bei Raumtemperatur.

Anschließend die Mikrochips einmal mit 200 µL 75 % Ethanol bei Raumtemperatur spülen. In jedes Loch 250 µL 75 % Ethanol geben und die Elektronikplatte bei Raumtemperatur mit der Versiegelungsfolie verschließen. Nach dem Zentrifugieren der Elektronikplatte bei 114 ×g für zwei Minuten die Platte entleeren.

Drehen Sie die elektronische Platte auf eine sterile Mullkompresse oder ein Papiertuch, um die restliche Flüssigkeit bei Raumtemperatur abzugießen. Wiederholen Sie die Spülungen mit 75 % Ethanol, gefolgt von der Zentrifugation. Führen Sie anschließend eine UV-Sterilisation der regenerierten elektronischen Platte für ein bis zwei Stunden im Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur durch.

Beurteilen Sie die optischen Eigenschaften der regenerierten elektronischen Plattenoberfläche, indem Sie zuerst den unteren Teil des Inkubationsbrunnens gemäß dem schriftlichen Protokoll demontieren. Um die Lebensfähigkeit der angehefteten Zellen nach der Aufnahme von Antikrebsmedikamenten auf frischen und regenerierten elektronischen Platten zu bewerten, verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, um die spontane Fluoreszenz von von A549-Zellen absorbierten DOX-Molekülen zu überwachen. Um die spontane Fluoreszenz des von den Zellen absorbierten DOX zu erfassen, verwenden Sie ein 63-fach-Öl-Objektiv und eine Anregungswellenlänge von 485 Nanometern.

Als Nächstes bewerten Sie das elektrochemische Verhalten regenerierter Elektroden, indem Sie zunächst die Gold-Elektrode und die Glaskohlenstoff-Elektrode mit einem Polierschliffmittel auf einem Poliertuch zu einer spiegelartigen Oberfläche polieren. Anschließend werden die Elektroden in Wasser beschallt, um Partikel zu entfernen. Danach aktivieren Sie die Gold-Elektrode in 0,5-molarer Schwefelsäure.

Erhalten Sie Elektrochemische Impedanzspektroskopie- (EIS-)Daten der blanken Goldelektrode und der glaskohlenstoffbeschichteten Elektrode in einer 10-Millimolar-Pottassiumchlorid-Elektrolytlösung, die ein Millimolar Kaliumferrocyanid enthält. Geben Sie nun 10 Mikroliter einer Zellsuspension auf die Oberfläche der Goldelektrode in der GCE. Inkubieren Sie nach Zugabe der Zellen die Goldelektrode in der GCE drei Stunden lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator, bevor Sie EIS-Daten der mit Zellen modifizierten Elektroden gemäß dem schriftlichen Protokoll erhalten.

Um die Elektroden zu regenerieren, tauchen Sie die Gold-Elektrode in die mit Zellen modifizierte GCE in 0,25 %iger Trypsinlösung für 0,5 bis zwei Stunden ein. Spülen Sie beide Elektroden anschließend viermal vorsichtig mit Wasser. Danach spülen Sie die Elektroden viermal vorsichtig mit absolutem Ethanol.

Als Nächstes tauchen Sie die Goldelektrode in der GCE für etwa fünf Minuten in 75 % Ethanol ein. Nach fünf Minuten spülen Sie den Chip vorsichtig viermal mit 75 % Ethanol, bevor Sie die EIS-Daten der regenerierten Elektroden gemäß dem schriftlichen Protokoll aufnehmen. Zur Beurteilung der Regenerationseffizienz der arraybasierten elektronischen Goldelektroden wurden mikroskopische Beobachtungen sowohl an frischen als auch an behandelten elektronischen Platten durchgeführt.

Es wurde kein wesentlicher Unterschied in den optischen Eigenschaften der Mikrochip-Oberfläche festgestellt. Die Fluoreszenz von Doxorubicin-Molekülen wird verwendet, um den Zellzustand auf den Goldmikrochips vor und nach der Regeneration zu bewerten. Die ähnliche Homogenität und gut definierte zelluläre Morphologie zeigten die Wiederverwendbarkeit der Chips auf.

Das Regenerationsprotokoll wird für den eigentlichen Test der Zellproliferation angewendet. Die aus mehreren Inkubationsgefäßen einer getesteten elektronischen Platte gewonnenen Wachstumskurven zeigen eine gute Übereinstimmung, was auf eine erfolgreiche Regenerierung des kommerziellen Chips hindeutet. Hier wird die regenerierte elektronische Platte L8 zur Bewertung der Zytotoxizität unter Verwendung von mesoporösen Kieselsäurematerialien getestet.

Der Zellindex der mit mesoporösen Materialien behandelten Probe nahm im Vergleich zur Kontrolle ab, was auf eine leichte Zytotoxizität der Materialien hinweist. Eine weitere Einschließung und Freisetzung des Antikrebsmittels Doxorubicin durch mesoporöse Materialien führte zu einem deutlichen Rückgang der Wachstumskurve von A549-Zellen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Ätzdauer für den Typsenker von Chip zu Chip variieren kann. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie oder sogar Spektroskopie, Elektrochemische Impedanzspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen, beispielsweise zur Beurteilung des Regenerationseffekts, zu beantworten.