Regeneration der angeordneten Gold Mikroelektroden ausgestattet für eine Echtzeit-Zelle-Analyzer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Regeneration kommerzieller elektronischer Platten, die mit einem Real-Time Cell Analyzer (RTCA) ausgestattet sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Regeneration von Einweg-Chips auf Goldbasis zu beantworten, einschließlich der Regeneration von elektronischen Plänen, die in RTCA verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Regenerationsverfahren mit milden und leicht verfügbaren Laborreagenzien mit geringer Toxizität durchgeführt werden kann.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir anfingen, den Real-Time Cell Analyzer zu verwenden, der goldbasierte Chips kostete. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Inkubation und Proliferation von A549-Zellen in einer Zellkulturschale, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 150 Mikroliter Zellmedium in jede Inkubationsvertiefung der elektronischen Platte L8. Lassen Sie die Platte 30 Minuten lang in der Biosicherheitshaube zum Ausgleich.

Nach 30 Minuten legen Sie die elektronische Platte L8 manuell in den Real-Time Cell Analyzer bei 37 Grad Celsius in den CO2-Inkubator ein. Starten Sie als Nächstes das Betriebsprogramm Real-Time Cell Analyzer auf dem Computer. Wählen Sie auf der Standardseite zur Einrichtung des Experimentmusters die Option Experimentmodell aus, und benennen Sie den ausgeführten Assay.

Wählen Sie auf der Layoutseite die entsprechenden Vertiefungen aus, die im Experiment enthalten sind, und geben Sie die Informationen wie Zelltyp, Anzahl und Wirkstoffnamen in die Bearbeitungsfelder ein. Fügen Sie auf der Zeitplanseite die experimentellen Schritte hinzu und wählen Sie dann die Laufzeit der einzelnen Schritte und das Intervall der Echtzeitdatenerfassung aus. Klicken Sie auf Start, um die Hintergrundimpedanz des Mediums zu messen.

Die Experimentdatei wird gespeichert. Die resultierenden Daten werden automatisch subtrahiert. Fügen Sie auf der Zeichnungsseite Vertiefungen hinzu, und das Diagramm des Zeitzellenindex wird angezeigt.

Für das Zellproliferationsexperiment klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche Pause, um das Programm zu pausieren. Nehmen Sie dann die elektronische Platte heraus und fügen Sie 100 Mikroliter A549 Zellsuspensionspuffer pro Vertiefung bei Raumtemperatur hinzu. Lassen Sie die Platte 30 Minuten lang in der Biosicherheitshaube, damit sich die Zellen auf dem Boden der Inkubationsvertiefungen absetzen können.

Setzen Sie die elektronische Platte manuell in die Echtzeit-Zellanalysatorstation ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Start, um das Experiment fortzusetzen. Auf der Diagrammseite zeichnet das Analysetool während des gesamten Experiments kontinuierlich Zellindexwerte oder Kurven auf.

Wenn das Experiment abgeschlossen ist, rufen Sie die Zeichnungsseite auf, und öffnen Sie die Experimentdatei. Wählen Sie dann alle getesteten Inkubationsvertiefungen und die resultierenden Zellindexkurven aus, die ein letztes Mal gemittelt oder normalisiert werden können, bevor Sie pharmazeutische Medikamente hinzufügen oder das Medium wechseln, um Schwankungen zwischen den Assays zu reduzieren. Auf der Datenanalyseseite kann EC50 oder IC50 berechnet werden.

Nach der Durchführung der Zytotoxizitätsbewertung des Krebsmedikaments, wie im Textprotokoll beschrieben, nehmen Sie die elektronische Platte mit den Zellen aus der Echtzeit-Zellanalysestation. Legen Sie die gebrauchte elektronische Platte bei Raumtemperatur in eine sterile Biosicherheitshaube und mischen Sie das Nährmedium gründlich mit einer Pipette. Verwenden Sie dann eine Pipette, um das gesamte Medium zu aspirieren.

Spülen Sie die elektronischen Platten dreimal bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser ab. Die restlichen Zellen auf den elektronischen Platten mit 0,25%frisch zubereitetem Trypsin für ein bis zwei Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius verdauen. Wenn der Aufschluss abgeschlossen ist, arbeiten Sie in der Biosicherheitshaube bei Raumtemperatur, um die Inkubationslösung mit einer Pipette fünf- bis zehnmal zu mischen, und entfernen Sie dann die Lösung.

Spülen Sie die elektronischen Platten zweimal mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser. Dann zweimal mit 200 Mikrolitern 100 % Ethanol waschen, gefolgt von zweimal mit dem gleichen Volumen von 75 % Ethanol. Zum Schluss zweimal mit weiteren 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser spülen.

Drehen Sie die elektronische Platte auf eine sterile Gaze oder Seidenpapier, um das restliche Wasser bei Raumtemperatur umzufüllen. Führen Sie dann eine UV-Sterilisation auf der regenerierten elektronischen Platte für ein bis zwei Stunden in der Biosicherheitshaube bei Raumtemperatur durch. Nach der Verwendung der Platten für die Arzneimittelabgabe mit mesoporösem Material, wie im Textprotokoll beschrieben, verdauen Sie die verbleibenden Zellen wie zuvor mit Trypsin.

Da die Pipette in den Experimenten häufig verwendet wird, sollte die Person darauf achten, dass die Spitze und die Oberfläche der Mikrochips nicht zerkratzt werden. Spülen Sie die Mikrochips einmal in der Biosicherheitshaube bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser ab. Dann gehen die Mikrochips mit 200 Mikrolitern absolutem Ethanol zweimal bei Raumtemperatur auf.

Spülen Sie anschließend die Mikrochips einmal bei Raumtemperatur mit 200 Mikrolitern 75%igem Ethanol ab. Geben Sie 250 Mikroliter 75%iges Ethanol in jede Vertiefung und versiegeln Sie die elektronische Platte mit der Siegelfolie bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die elektronische Platte zwei Minuten lang mit dem 114-fachen G gedreht haben, leeren Sie die Platte.

Drehen Sie die elektronische Platte auf einer sterilen Gaze oder Seidenpapier um, um die restliche Flüssigkeit bei Raumtemperatur zu dekantieren. Wiederholen Sie die 75%igen Ethanolspülungen, gefolgt von der Schleuderung. Führen Sie dann eine UV-Sterilisation auf der regenerierten elektronischen Platte für ein bis zwei Stunden in der Biosicherheitshaube bei Raumtemperatur durch.

Beurteilen Sie die optischen Eigenschaften der regenerierten elektronischen Plattenoberfläche, indem Sie zuerst den unteren Teil der Inkubationsbohrung zerlegen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Lebensfähigkeit von angehängten Zellen nach der Aufnahme von Krebsmedikamenten auf den frischen und regenerierten elektronischen Platten zu bewerten, verwenden Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, um die spontane Fluoreszenz von DOX-Molekülen zu überwachen, die von A549-Zellen absorbiert werden. Um die spontane Fluoreszenz von absorbiertem DOX durch die Zellen aufzuzeichnen, verwenden Sie ein 63-faches Ölobjektiv und 485 Nanometer als Anregungswellenlänge.

Beurteilen Sie als Nächstes das elektrochemische Verhalten von regenerierten Elektroden, indem Sie zuerst die Goldelektrode und die glasartige Kohlenstoffelektrode mit einer Illuminoslurry auf einem Poliertuch auf eine spiegelnde Oberfläche polieren. Beschallen Sie dann die Elektroden in Wasser, um Partikel zu entfernen. Aktivieren Sie als Nächstes die Goldelektrode in 0,5-molarer Schwefelsäure.

Erhalten Sie elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS-Daten) der blanken Goldelektrode und der glasartigen Kohlenstoffelektrode in einer 10-millimolaren Kaliumchlorid-Elektrolytlösung, die ein millimolares Kaliumpheracyanid enthält. Lassen Sie nun 10 Mikroliter einer Zellsuspension auf die Oberfläche der Goldelektrode in der GCE fallen. Nach dem Hinzufügen der Zellen wird die Goldelektrode im GCE in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator drei Stunden lang inkubiert, bevor EIS-Daten der mit Zellen modifizierten Elektroden erhalten werden, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die Elektroden zu regenerieren, tauchen Sie die Goldelektrode für 0,5 bis zwei Stunden in das mit Zellen in 0,25%Trypsin modifizierte GCE. Spülen Sie beide Elektroden viermal sanft mit Wasser ab. Spülen Sie dann die Elektroden viermal sanft mit absolutem Ethanol aus.

Tauchen Sie anschließend die Goldelektrode etwa fünf Minuten lang in 75 % Ethanol in den GCE. Spülen Sie den Chip nach fünf Minuten viermal sanft mit 75 % Ethanol, bevor Sie EIS-Daten der regenerierten Elektroden erhalten, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Regenerationseffizienz der angeordneten elektronischen Goldplatte zu bewerten, wurden mikroskopische Beobachtungen sowohl für frische als auch für behandelte elektronische Platten durchgeführt.

Es wurde kein virtueller Unterschied in den optischen Eigenschaften der Mikrochip-Oberfläche gefunden. Die Throeszenz von Doxorubicin-Molekülen wird verwendet, um den Zellstatus auf den Gold-Mikrochips vor und nach der Regeneration zu beurteilen. Die ähnliche Homogenität und die gut definierte zelluläre Morphologie zeigten die Wiederverwendbarkeit der Chips.

Das Regenerationsprotokoll wird für den realen Test der Zellproliferation angewendet. Die Wachstumskurven, die aus mehreren Inkubationsvertiefungen einer getesteten elektronischen Platte gewonnen wurden, zeigen eine gute Konsistenz, was auf eine erfolgreiche Regeneration des kommerziellen Chips hinweist. Die hier gezeigte regenerierte elektronische Platte L8 wurde für die Bewertung der Zytotoxizität mit mesoporösen Siliziumdioxidmaterialien getestet.

Der Zellindex der mit mesoporösen Materialien behandelten Probe nahm im Vergleich zur Kontrolle ab, was auf eine leichte Zytotoxizität der Materialien hinweist. Die weitere Verkapselung und Freisetzung des Krebsmedikaments Doxorubicin durch mesoporöse Materialien führte zu einer dramatischen Abnahme der Wachstumskurve von A549-Zellen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass die Art der Sinkaufschlusszeit von Chip zu Chip unterschiedlich sein kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie oder auch die Spektroskopie, die elektrochemische Impedanzspektroskopie, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Beurteilung des Regenerationseffekts zu beantworten.