RGB und spektrale Wurzel Bildgebung für die Pflanze Phänotypisierung und physiologischen Forschung: Versuchsaufbau und Imaging-Protokolle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, umfassende Informationen über in bodengefüllten Rhizoboxen wachsende Pflanzenwurzeln durch die Kombination verschiedener Bildgebungsverfahren zu erhalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenphänotypisierung und -züchtung zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag unterschiedliche Wurzelarchitekturen zur Verbesserung der Abiotischen-Stress-Resistenz leisten. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass er RGB-Bildgebung für die Wurzelarchitektur mit hyperspektraler Bildgebung für die Wurzelfunktionalität kombiniert.

Das Potenzial der Verwendung der hyperspektralen Bildgebung für Wurzeln erstreckt sich auf eine breite Palette von Rhizosphäre-Parametern, da die spektralen Informationen kleinräumige physikochemische Veränderungen sichtbar machen können, die durch Pflanzenwurzeln verursacht werden. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zum Befüllen der Rhizobox sorgfältig durchgeführt werden müssen. Andernfalls werden das Wurzelwachstum und die Sichtbarkeit der Wurzeln negativ beeinflusst.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der Rhizoboxen zur Substratbefüllung, wie im Textprotokoll beschrieben. Befeuchten Sie den trockenen Boden auf einen gravimetrischen Wassergehalt von 0,108 Gramm pro Gramm, indem Sie 400 Gramm Wasser zu 3.705 Gramm trockenem Boden hinzufügen. Mischen Sie Boden und Wasser vorsichtig, um eine homogene Wasserverteilung zu erzielen.

Zerlegen Sie größere Aggregate manuell, um eine Partikelgröße von kleiner als oder gleich zwei Millimetern zu gewährleisten. Es ist entscheidend, eine homogene Bodenschicht direkt an dem Gasbeobachtungsfenster zu erzeugen, wobei Luftzwischenräume vermieden werden müssen. Wurzelspitzen von Pflanzen trocknen schnell aus, wenn sie in Luftzwischenräume hineinwachsen.

Auch die spektrale Bildqualität für die Wasserabbildung ist negativ beeinträchtigt. Füllen Sie den vorgewässerten Boden in die offenen Rhizoboxen ein und verdichten Sie ihn vorsichtig mithilfe eines Polystyrolblatts, das das Innenvolumen der Box abdeckt, um so eine homogene Schüttdichte von 1,3 Gramm pro Kubikzentimeter zu erreichen. Geben Sie die restliche Wassermenge hinzu, um den Zielwassergehalt von 0,31 Kubikzentimeter pro Kubikzentimeter zu erreichen, indem Sie sie mit einer Sprühflasche auf die Oberfläche aufsprühen.

Stellen Sie eine kleine Tropfengröße sicher, um eine Zerstörung der Oberflächenstruktur sowie eine homogene Benetzung zu vermeiden. Stellen Sie die Box während des Besprühen auf eine Waage, um die tatsächlich dem Substrat zugegebene Wassermenge zu überwachen. Lassen Sie das Wasser 10 Minuten lang umverteilen und drücken Sie dann das Glas auf die Oberfläche, bevor Sie es mit den seitlichen Metallschienen fixieren.

Das durchschnittliche Endgewicht der Rhizoboxen mit angefeuchtetem Substrat betrug 17.818 ± 68 Gramm. Rüsten Sie den Klimaraum mit acht LED-Lampen aus, die eine homogene Beleuchtung von 450 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde mit spektralen Maxima bei 440 und 660 Nanometern für ein optimales Pflanzenwachstum bereitstellen. Nachdem die Umgebungsparameter entsprechend den Anforderungen der Pflanze und des Experiments eingestellt wurden, verschließen Sie die Glasscheibe mit einer Holzplatte, um den Wurzelbereich im Dunkeln zu halten und das Algenwachstum durch Lichteinfall durch die Glassoberfläche zu verhindern.

Stellen Sie die Rhizoboxen anschließend mit einem geeigneten Metallgestell in einem Winkel von 45 Grad ein. Dadurch wird aufgrund der Gravitropismus das Wurzelwachstum in Richtung der Glasoberfläche maximiert. Für die RGB-Wurzelabbildung beleuchten Sie die Rhizobox mit vier 24-Watt-Fluoreszenzröhren, die in einem Abstand von 80 Zentimetern zur Rhizobox angebracht sind.

Befestigen Sie außerdem vier 15-Watt-UV-Lampen in einem Abstand von 20 Zentimetern zur alternativen Beleuchtung des Rhizobox, um die Wurzelautofluoreszenz zu nutzen, falls ein geringer Kontrast zwischen der Wurzel und dem hellfarbigen Substratuntergrund besteht. Schalten Sie die UV-Lampen ein und befestigen Sie anschließend die Rhizobox, die abgebildet werden soll, in der Halterung der Abbildungskammer. Nehmen Sie danach zwei Bilder auf, um die obere und untere Hälfte einer Rhizobox mit einer Überlappung von etwa drei Zentimetern abzudecken.

Erfassen und verarbeiten Sie die RGB-Bilder gemäß dem schriftlichen Protokoll. Führen Sie abschließend die Analyse der erfassten RGB-Wurzelbilder durch und prüfen Sie anschließend, ob Bereiche mit Abweichungen vorhanden sind. Definieren Sie in diesem Fall einen Ausschlussbereich und starten Sie die Analyse erneut.

Fügen Sie für Wurzeln, die nicht klassifiziert wurden, zusätzliche Farbklassen hinzu und starten Sie die Analyse erneut. Aktivieren oder erhöhen Sie für Elemente, die fälschlicherweise als Wurzeln klassifiziert wurden, die Filteroptionen für Ablagerungen und raue Kanten. Führen Sie die Bildaufnahme durch, indem Sie zunächst die Integrationszeiten der Kamera für den Rhizobox-Scan und den Weißstandard in der Kamerasoftware bestimmen.

Öffnen Sie dazu die Bildgebungs-GUI und bewegen Sie die Kamera an eine Stelle der Rhizobox, an der Wurzeln vorhanden sind. Passen Sie die Integrationszeit der Kamera so an, dass bei einem hellen Objekt etwa 85 % des vollen dynamischen Bereichs der Kamera im von der Software angezeigten Histogramm genutzt werden. Eine korrekte Einstellung der Integrationszeit für verschiedene Substrate und Wurzelgewebe ist entscheidend, um den dynamischen Bereich der Infrarotkamera vollständig auszunutzen und Informationsverluste durch Überschreiten ihres Bereichs zu vermeiden.

Wiederholen Sie den Vorgang für den weißen Standard, indem Sie das Kamerapositionierungssystem bewegen, um den weißen Standard anzusteuern, bevor Sie die Kamerasoftware schließen. Öffnen Sie anschließend die Matlab-Bildgebung-GUI und geben Sie alle Einstellungen aus dem aktuellen Rhizobox-Scan ein. Nehmen Sie den Dunkel- und den Weißstandard vor jedem Bildgebungsdurchlauf einmal täglich auf.

Der dunkle Standard repräsentiert das Kamerarauschen, während der weiße Standard die maximale Reflektivität angibt. Diese Daten sind für die Bildnormalisierung während der Vorverarbeitung erforderlich. Legen Sie fest, ob die gesamte Rhizobox oder nur ein Teil davon gescannt wird.

Für den vorliegenden Fall werden gesamte Rhizoboxen abgebildet. Dann starten Sie den Scan. Für die spektralbasierte Messung des Wassergehalts ist eine Kalibrations-Rhizobox erforderlich.

Unterteilen Sie ein Rhizobox in Fünf-Centimeter-Kammern mithilfe von Polystyrolplatten, um sie mit Boden unterschiedlicher Feuchtegehalte zu befüllen. Scannen Sie die Kalibrations-Rhizobox mit denselben Einstellungen wie die bepflanzten Rhizoboxen. Als Beispiel zur Kombination von Wurzel- und oberirdischen Merkmalen verwenden Sie das Blatt-Porometer zur Messung der Stomataleitfähigkeit.

Das Gerät mindestens eine Stunde lang in der Klimakammer an die Umgebungsbedingungen anpassen. Von mindestens drei Blättern pro Pflanze Messungen durchführen. Ein repräsentatives Bild des Wurzelwachstums der Zuckerrübensorte Ferrara, basierend auf RGB-Bildgebung, ist hier dargestellt.

35 Tage nach der Aussaat haben sich die Pflanzenwurzeln verlängert und erreichen den Boden des Wurzelkastens. Einige Wurzelachsen an der Oberseite des Wurzelkastens konnten nicht aus den RGB-Bildern segmentiert werden. Die Alterung der älteren basalen Wurzeln verändert ihre Farbe hin zu Braun.

Daher versagt die Trennung zwischen diesen Wurzeln und dem Bodenhintergrund basierend auf einer Farbschwelle. Mithilfe der hyperspektralen Bildgebung erfolgt die Segmentierung auf der Grundlage unterschiedlicher spektraler Merkmale von Wurzelvordergrund und Bodenhintergrund. Dies verbessert das Segmentierungsergebnis.

Die Abweichungen der gemessenen Wurzellänge im Vergleich zu einem manuell erfassten Referenzbild betragen lediglich 1,5 %. Außerdem ermöglicht die spektrale Bildgebung eine detaillierte Kartierung des Wassergehalts um die Wurzel herum, um die Wasseraufnahme abzuleiten. Hier ist das Wurzelskelett in Schwarz dargestellt. Die helleren Bereiche zeigen Regionen stärkerer Wasserausschöpfung in der Nähe der Wurzelachsen.

Während dunklerblaue Bereiche Regionen mit höherem Bodenwassergehalt darstellen, die außerhalb der Reichweite der Wurzeln liegen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Rhizoboxen korrekt befüllt werden, um ein zufriedenstellendes Wurzelwachstum und eine gute Sichtbarkeit zu gewährleisten. Dies bildet die Grundlage für spätere Bildaufnahmen und repräsentative Ergebnisse der Wurzel-Phänotypisierung.

Nach dieser Vorgehensweise können weitere Methoden zur spektralen Klassifizierung wie K-Means-Clustering oder Support-Vektor-Maschinen durchgeführt werden, um detaillierte Informationen über Wurzel- und Rhizosphäreigenschaften wie Wurzelseneszenz und -zersetzung zu erhalten. Sobald etabliert, ermöglicht diese Technik eine umfassende Phänotypisierung von Wurzelsystemen und der Reaktion auf abiotischen Stress. Ein Satz von 10 Kultivaren kann mit einer gesamten Versuchsdauer von weniger als drei Monaten charakterisiert werden.