RGB und spektrale Wurzel Bildgebung für die Pflanze Phänotypisierung und physiologischen Forschung: Versuchsaufbau und Imaging-Protokolle

Ein experimentelles Protokoll ist für die Beurteilung der Boden gewachsen Pflanze Wurzelsysteme mit RGB und hyperspektralen Bildgebung vorgestellt. Kombination von RGB Bild Zeit Serie mit chemometrischen Informationen aus hyperspektrale scannt optimiert Einblicke in Werk Wurzel Dynamik.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, durch die Kombination verschiedener bildgebender Verfahren umfassende Informationen über das Wachstum von Pflanzenwurzeln in erdgefüllten Rhizoboxen zu erhalten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzenphänotypisierung und -züchtung zu beantworten, wie z.B. den Beitrag verschiedener Wurzelarchitekturen zu einer besseren abiotischen Stressresistenz. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er RGB-Imaging für die Root-Architektur und hyperspektrale Imaging für die Root-Funktionalität kombiniert.

Das Potenzial der hyperspektralen Bildgebung für Wurzeln erstreckt sich auf ein breites Spektrum von Rhizosphärenparametern, da die spektralen Informationen kleinräumige physiochemische Veränderungen aufdecken können, die durch Pflanzenwurzeln eingeführt werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zum Befüllen der Rhizobox sorgfältig durchgeführt werden müssen. Andernfalls werden das Wurzelwachstum und die Sichtbarkeit der Wurzel negativ beeinflusst.

Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung der Rhizoboxen für die Substratfüllung, wie im Textprotokoll beschrieben. Befeuchten Sie den trockenen Boden auf einen gravimetrischen Wassergehalt von 0,108 Gramm pro Gramm, indem Sie 400 Gramm Wasser für 3.705 Gramm trockenen Boden hinzufügen. Mischen Sie den Boden und gießen vorsichtig, um eine gleichmäßige Wasserverteilung zu erhalten.

Zerkleinern Sie größere Aggregate manuell, um die Partikelgröße kleiner oder gleich zwei Millimeter zu halten. Es ist wichtig, eine homogene Bodenschicht neben dem Gasbeobachtungsfenster zu erhalten, um Luftspalte zu vermeiden. Die Wurzelspitzen der Pflanzen trocknen schnell aus und wachsen in Luftspalte.

Auch die spektrale Bildqualität für das Wassermapping wird negativ beeinflusst. Füllen Sie die vorbenetzte Erde in die offenen Rhizoboxen und verdichten Sie sie vorsichtig mit einer Styroporplatte, um das Innenvolumen der Box abzudecken, wodurch eine homogene Schüttdichte von 1,3 Gramm pro Kubikzentimeter entsteht. Geben Sie die restliche Menge Wasser hinzu, um den angestrebten Wassergehalt von 0,31 Kubikzentimetern pro Kubikzentimeter zu erreichen, indem Sie mit einer Sprühflasche auf die Oberfläche sprühen.

Achten Sie auf eine kleine Tropfengröße, um eine Verschlechterung der Oberflächenstruktur sowie eine homogene Benetzung zu vermeiden. Halten Sie die Box während des Sprühens auf einem Gleichgewicht, um die Menge an Wasser zu überwachen, die dem Substrat tatsächlich zugeführt wird. Lassen Sie das Wasser 10 Minuten lang umverteilen und drücken Sie dann das Glas auf die Oberfläche und fixieren Sie es mit den seitlichen Metallschienen.

Das durchschnittliche Endgewicht der Rhizoboxen mit benetztem Substrat betrug 17.818 plus oder minus 68 Gramm. Statten Sie den Klimaraum mit acht LED-Lampen aus, die eine homogene Ausleuchtung von 450 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde mit spektralen Spitzen bei 440 und 660 Nanometern für ein optimales Pflanzenwachstum bieten. Nachdem Sie die Umgebungsparameter entsprechend den Pflanzen- und Versuchsbedürfnissen eingestellt haben, decken Sie das Glasfenster mit einer Holzplatte ab, um die Wurzelzone im Dunkeln zu halten und Algenwachstum durch Licht, das durch die Glasoberfläche eindringt, zu vermeiden.

Stellen Sie dann die Rhizoboxen mit einem geeigneten Metallrahmen in einer Neigung von 45 Grad auf. Dadurch wird das Wurzelwachstum zur Glasoberfläche hin durch Gravitropismus maximiert. Für die RGB-Wurzelbildgebung beleuchten Sie die Rhizobox mit vier 24-Watt-Leuchtstoffröhren, die in einem Abstand von 80 Zentimetern von der Rhizobox angebracht sind.

Montieren Sie außerdem vier 15-Watt-UV-Röhren in einem Abstand von 20 Zentimetern zur alternativen Beleuchtung der Rhizobox, wobei Sie die Wurzelautofluoreszenz bei geringem Kontrast zwischen Wurzel- und hellem Substrathintergrund nutzen. Schalten Sie die UV-Lampen ein und montieren Sie dann die zu bebildernde Rhizobox in die Halterung der Imagingbox. Nehmen Sie als Nächstes zwei Bilder auf, um die obere und untere Hälfte einer Rhizobox mit einer Überlappung von etwa drei Zentimetern zu bedecken.

Erfassen und verarbeiten Sie die RBG-Bilder, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie abschließend die Analyse der erfassten RBG-Root-Images durch und kontrollieren Sie anschließend, ob es Bereiche gibt, die nicht übereinstimmen. Definieren Sie in diesem Fall einen Ausschlussbereich, und starten Sie die Analyse neu.

Fügen Sie für nicht klassifizierte Wurzeln zusätzliche Farbklassen hinzu, und starten Sie die Analyse neu. Aktivieren oder erhöhen Sie für Elemente, die fälschlicherweise als Wurzeln klassifiziert wurden, die Filteroptionen für Schmutz und raue Kanten. Führen Sie die Bildaufnahme durch, indem Sie zunächst die Kameraintegrationszeiten für den Rhizobox-Scan und den Weißstandard in der Kamerasoftware bestimmen.

Öffnen Sie dazu die Imaging-GUI und bewegen Sie die Kamera an eine Position der Rhizobox, an der Wurzeln vorhanden sind. Passen Sie die Integrationszeit der Kamera, die auf ein Lichtobjekt abzielt, so an, dass etwa 85 % des vollen Dynamikbereichs der Kamera in dem von der Software angezeigten Histogramm verwendet werden. Die richtige Einstellung der Integrationszeit für verschiedene Substrate und Wurzelgewebe ist entscheidend, um den Dynamikbereich der Infrarotkamera voll auszuschöpfen und Informationsverluste durch Überschreitung des Bereichs zu vermeiden.

Wiederholen Sie den Vorgang für den weißen Standard, indem Sie das Kamerapositionierungssystem so bewegen, dass es auf den weißen Standard ausgerichtet ist, bevor Sie die Kamerasoftware schließen. Öffnen Sie als Nächstes die Matlab-Imaging-GUI und geben Sie alle Einstellungen aus dem aktuellen rhizobox-Scan ein. Erfassen Sie die Dunkel- und Weißstandards vor jedem Imaging-Lauf einmal täglich.

Der dunkle Standard repräsentiert das Kamerarauschen, während der weiße Standard das maximale Reflexionsvermögen bietet. Diese Daten werden für die Bildnormalisierung während der Vorverarbeitung benötigt. Legen Sie fest, ob die gesamte Rhizobox oder nur ein Teil davon gescannt wird.

Für den vorliegenden Fall werden ganze Rhizoboxen abgebildet. Starten Sie dann den Scan. Für die spektrale Messung des Wassergehalts wird eine Kalibrierrhizobox benötigt.

Unterteilen Sie eine Rhizobox in fünf Zentimeter große Fächer mit Styroporplatten, um sie mit Erde mit unterschiedlichem Wassergehalt zu füllen. Scannen Sie die Kalibrier-Rhizobox mit den gleichen Einstellungen wie für die bepflanzten Rhizoboxen. Als Beispiel für die Kombination von Wurzel- und oberirdischen Merkmalen besorgen Sie sich das Blattporometer zur Messung der Leitfähigkeit der Spaltöffnungen.

Äquilibrieren Sie das Gerät mindestens eine Stunde lang in der Klimakammer an die Umgebungsbedingungen. Nimm Messungen von mindestens drei Blättern pro Pflanze. Hier ist ein repräsentatives Bild des Wurzelwachstums der Zuckerrübensorte Ferrara auf der Grundlage von RGB-Bildern zu sehen.

35 Tage nach der Aussaat haben sich die Pflanzenwurzeln verlängert und erreichen den Boden der Rhizobox. Einige Wurzelachsen am oberen Rand der Rhizobox konnten nicht aus RGB-Bildern segmentiert werden. Die Seneszenz der älteren Grundwurzeln ändert ihre Farbe in Braun.

Daher scheitert die Trennung zwischen diesen Wurzeln und dem Bodenhintergrund anhand eines Farbschwellenwerts. Mit Hilfe der hyperspektralen Bildgebung basiert die Segmentierung auf unterschiedlichen spektralen Merkmalen des Wurzelvordergrunds und des Bodenhintergrunds. Dies verbessert das Segmentierungsergebnis.

Die Differenz in der gemessenen Wurzellänge zu einem manuell verfolgten Referenzbild beträgt nur 1,5 %Darüber hinaus ermöglicht die spektrale Bildgebung eine feine Kartierung des Wassergehalts um die Wurzel herum, um Rückschlüsse auf die Wasseraufnahme zu ziehen. Hier ist das Wurzelskelett schwarz dargestellt. Die helleren Bereiche zeigen Bereiche mit höherem Wassermangel in der Nähe der Wurzelachsen.

Während dunklere blaue Bereiche Regionen mit höherem Bodenwassergehalt außerhalb der Reichweite der Wurzeln darstellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rhizoboxen richtig füllt, um ein zufriedenstellendes Wurzelwachstum und eine zufriedenstellende Sichtbarkeit zu gewährleisten. Dies ist die Grundlage für die spätere Bildgebung und repräsentative Ergebnisse der Wurzelphänotypisierung.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden zur spektralen Klassifizierung wie K-Means-Clustering oder Support Vector Machines durchgeführt werden, um detaillierte Informationen über Wurzel- und Rhizosphäreneigenschaften wie Wurzelseneszenz und Zerlegung zu erhalten. Einmal etabliert, ermöglicht Ihnen diese Technik, das Wurzelsystem und die abiotische Stressreaktion umfassend zu phänotypisieren. Ein Set von 10 Sorten kann mit einer Gesamtexperimentierdauer von weniger als drei Monaten charakterisiert werden.