Name: Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Lernen Sie die optimierte Methode zur Einrichtung eines In-vitro-Blut-Hirn-Schranken-Modells mit primären porcinen Hirnendothelzellen. Dieses Protokoll liefert hohe TEER-Werte und niedrige Permeabilität für Arzneimittelforschung.

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Die Autoren möchten Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen und Niels M. Kristiansen für technische Hilfe anerkennen, und die Lundbeck-Stiftung gewähren Anzahl R155-2013-14113.

Die Autoren berichten keinen Interessenskonflikt.

Reinigung und Verbreitung von pBEC
Während die Reinigungsprozedur gehören wichtige Schritte schnelle und wirksame Beseitigung der Hirnhaut und Trennung der weißen und grauen Materie, die wichtig für die Reinigung Ausbeute und Reinheit und für den richtigen Aufbau des Modells ist. Für die vorgestellten in-vitro- BBB-Modell mit pBECs haben wir verbessert und vereinfacht eine Reinigungsprozedur basierend auf mechanische Homogenisierung der isolierten graue Substanz, Größe-selektive Filterun...

Zelluläre Struktur und Funktion der Blut - Hirn-Schranke
An der Schnittstelle von Herz-Kreislauf und zentrales Nervensystem (ZNS) wirkt die BBB als eine wichtige regulatorische Seite für Volumenstörungen Kontrolle über die CNS Mikroumgebung, was für einwandfreie Funktion und Schutz des Nervensystems unerlässlich ist. Die Website der BBB ist die Auskleidung der Blutgefäße Lumen Endothelzellen. Im Gehirn Kapillaren Endothelzellen bilden komplexe interzelluläre enge Kreuzungen und stark polarisierten Expressionsmuster von bestimmten Zustrom und Efflux-Transporter sorgen für hochspezifische molekularen Transport zwischen dem Blut und der Gehirn- 1. Die tragenden Teile der engen Kreuzung komplexe enthalten Proteine aus der Familie occludin und Claudin, Zonula Occludens (ZO) Proteine, Cingulin und verbundenen Knoten Adhäsionsmoleküle (JAMs). Claudin-5 ist besonders wichtig in der parazellulär Knoten Einschränkung. Induktion und Wartung von diesem charakteristischen BBB endotheliale Phänotyp beinhalten dynamische Wechselwirkungen mit umgebenden Zellen, einschließlich Perizyten, Astrozyten, Neuronen und die Keller-Membranen, die zusammen mit Gehirn endothelial Zellen Form der neurovaskuläre Einheit (NVU)2,3. Die Mechanismen dieser Interaktionen beteiligt sind noch nicht vollständig geklärt, aber gehören der chemischen Signale zwischen Zellen, die Modulation der BBB Permeabilität kurzfristig und langfristig BBB Funktionen4induziert. Vor allem Astrozyten sind dafür bekannt, zu dem Gehirn endothelial Zelle Phänotyp beitragen und sind eine Quelle von regulatorischen Faktoren wie Glia-derived Neurotrophic Factor (tritt bei intrazellulären cAMP)5, grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor-6, Hydrocortison7und transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β)8. Die Wirkung von TGF-β, wurde jedoch diskutierten9.
Von In Vivo , In Vitro BBB
In Vivo Studien weiterhin wertvolle Informationen über BBB Biologie. Zellmodelle Kultur können jedoch zusätzliche Einblicke und stellen nützliche Werkzeuge für detaillierte molekulare und funktionelle Aspekte der BBB in Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Obwohl die komplexen Wechselwirkungen zwischen der Zelltypen und Bestandteile der BBB in in-vitro- Modelle vollends schwierig sind, gibt es seit, die erste Reinigung des Gehirn endothelial Zellen und Anwendung dieser in Mono-Kulturen 10 , 11 , 12, umfangreiche Entwicklung der Reinigung Verfahren und Wachstumsbedingungen der BBB Zell-Kultur-Modelle, wodurch größere Ähnlichkeit mit der in-Vivo -Barriere. Die häufig verwendete in-vitro- BBB-Modelle basieren auf Primärzellen Nagetier, Schweinen und Rindern Ursprungs und auf immortalisierte Zelllinien. Jedes Modell hat verschiedene vor- und Nachteile. Für Vergleich und Modell Wahl sind Validierung Markierungen wie Ausdruck der BBB-Enzyme, Transporter, Rezeptoren und Strukturproteinen verwendet, um Übersichten über die aktuellen Modelle1zu erstellen.
Ziel des Protokolls
Ein wichtiges Merkmal der BBB Barrier Dichtigkeit und hohe TEER, aber eine große Anzahl der verfügbaren Modelle spiegeln nicht gut in Vivo -Level. Integration von Entwicklung und Optimierung Beiträge von mehreren Labors, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode für den Aufbau eines hohen TEER in-vitro- BBB Modells basierend auf primäre pBECs in MC mit oder ohne ACM oder NCC mit primären präsentieren Astrozyten Ratte oder porcinen Ursprungs. Die dabei angewandten Verfahren und Etablierung des Modells gehören Bemühungen kontaminierende Zellen zu eliminieren und Differenzierung der pBECs in einem BBB-Phänotyp zu verbessern. Diese Arbeit führte zu die Einrichtung von zuverlässigen, TEER-Modelle mit niedrigen parazellulär Durchlässigkeit und gute funktionelle Expression des wichtigsten festen Knoten Proteine, Transporter und Rezeptoren. Wie die Astrozyten ein beitragender Faktor zum Gehirn endothelial Zelle Phänotypus, stellen die drei unterschiedlichen Bedingungen der Kultur jedoch drei unterschiedliche Phänotypen der Gehirn endothelial Zellen dar. Das NCC-Modell eignet sich speziell für Studien bestimmte spezielle Mechanismen in der Drogeentdeckung, Transportstudien und intrazellulären Menschenhandel, sowie für die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen wo ist maximale Ausdruck der BBB-Funktionen vorteilhaft.
Ursprung und Geschichte des Protokolls
Das hier beschriebene pBEC-Modell basiert weitgehend auf dem porcinen Modell Eisai Laboratories (London) entwickelt von Dr. Louise Morgan und Kollegen, ist anhand einer erfolgreichen früheren bovine Gehirn Endothelzellen Modell13. Die ursprüngliche Methode der Zelle Vorbereitung war eine zwei-Stufen-Filtration mit Nylon Maschen um den Mikrogefäßen, gefolgt von einem subculturing Schritt zur Verbesserung der Reinheit zu fangen. In der früheren Entwicklung der Methode wurden durch Zunahme der ergänzten Form, u. a. ACM optimale BBB Phänotyp und Barrier Dichtigkeit erreicht. Weitere Änderungen an der Methode wurden von R. Skinner Prof N. Rothwell Lab in Manchester UK14,15. Die Methode wurde von Abbott Labor, KCL London angenommen wo Patabendige es deutlich einfacher machte, durch den Verzicht von Astrozyten oder ACM und durch den Wegfall von kontaminierenden Zellen wie Perizyten mit Puromycin vorzubereiten. Die ersten Papiere bestätigt, dass das MC-Modell einige wichtige Merkmale des in Vivo BBB erhalten, einschließlich der effektiven engen Kreuzungen, Membran Verkehrssysteme und Rezeptor-vermittelten Transcytosis16,17 , 18 , 19 , 20. später S. Yusof wieder Astrozyten Kokultur getestet und fand es TEER, deutlich verbessert, so ist dies die bevorzugte Variante, die derzeit in der Abbott Labor21verwendet. Das Modell wurde erfolgreich übertragen, M. Nielsen Lab in Aarhus, wo weitere Änderungen wurden eingeführt (das Protokoll), einschließlich der Vereinfachung grau Rolle, Extraktion, mit nur einem Netz von Filtrationsschritt und einen einzelnen Filter Beschichtung Schritt Kombination von Kollagen und Fibronektin. Das angewandte Verfahren zur Isolierung von porcinen Astrozyten (dieses Protokoll) beruhte auf Protokolle von T. Moos Labor in Aalborg, beschrieben von Thomsen Et al.22entwickelt. Der TEER und andere Eigenschaften des Modells erzeugt in London und Aarhus sind ähnlich, die verleiht Vertrauen auf den Begriff, den das Modell ohne weiteres zwischen Labors übertragen und reagiert gut auf die sorgfältige Beobachtung und Rationalisierung der Verfahrensschritte. In der Tat hat S. Yusof jetzt das MC-Modell in einem tropischen Land (Malaysia)23, die weitere Anpassung für die örtlichen Gegebenheiten und Gewebe Quellen beteiligt.
Vorteile gegenüber alternativen Methoden und derzeit etablierte Modelle
Im Vergleich zum Gehirn endothelial Zellen Nagetier und bovinen Ursprungs, bieten pBECs den Vorteil, dass eine niedrigere Rate des Verlustes der in Vivo BBB-Phänotyp nach Isolierung24. Darüber hinaus sind pBECs in der Lage, relativ enge endotheliale Barrieren zu bilden, auch wenn Sie in MC (800 Ω cm2)16 im Vergleich zu den häufigsten berichteten Kosten von Monolagen Zell-Linien wie bEND.5 und bEND.3 (50 Ω cm2) angebaut 25 , 26 , 27, dende (300-800 Ω cm2)28,29,30, und CerebEND (500 Ω cm2)29,31,32und primäre Gehirn endothelial Zellen der Maus (100-300 Ω cm2)SS = "Xref" > 33,34,35,36 und Ratte (100-300 Ω cm2)37,38. Allerdings hat der TEER Abhängigkeit auf die Reinigung und Kultur Verfahren dargestellt. In den meisten Fällen zeigt die Zugabe von ACM oder Kokultur mit Astrozyten differenzierende Wirkung auf die Endothelzellen und eine Erhöhung in Dichtigkeit der endothelialen Schichten1. Trotzdem, mit Bemühungen um die Kultivierung Bedingungen zu optimieren, nur die Rinder-basierte Modelle haben gezeigt TEER Werten vergleichbar mit der Schweine-basierte Modelle (Durchschnitt von 800 Ω cm2 MC, bis zu 2500 Ω cm2 in Astrozyten Kokultur)13 ,39,40,41,42,43,44,45. Wie die Modelle basierend auf primäre bovine Gehirn haben endotheliale Zellen gezeigt große Unterschiede, sowohl zwischen als auch innerhalb von Laboratorien14,45,46,47,48, Reproduzierbarkeit könnte ein Problem sein. Im pBEC Modell hier berichtet haben der beteiligten Laboratorien mit geringer Variabilität, sowohl in als auch zwischen den Labors sehr ähnlich wie TEER und parazellulär Permeabilität Werte erreicht. Daher sollte es für andere Labors, ein robustes Modell mit geringer Variabilität, mit der hier vorgestellten Methode möglich. Neben enge endotheliale Schichten bilden, wurden Modelle mit pBECs vorher durch Expression von tight Junction-Proteine, funktionale BBB-Transporter, Rezeptoren und Enzymen und nachgewiesene Eignung für verschiedenste Studien15 validiert , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Außerdem unveröffentlichte Transkriptom-Daten auf die Ko-Kulturen von pBECs zeigt eine erwartete Profil der BBB-Transportern und Rezeptoren (unveröffentlichte Ergebnisse, Nielsen Et Al.).
Schweine-basiertes BBB-Modell hat einen weiteren Vorteil als Genom, Anatomie, Physiologie und Fortschreiten der Krankheit des Schweins reflektieren die Humanbiologie in höherem Maße als andere etablierte Modelle verfügt über60, die günstig sind für die pharmazeutischen Industrie. Da Schweine Gehirne gemeinsame Nebenprodukt der Fleischindustrie sind, bilden sie eine leicht zugängliche Quelle des Gehirns Endothelzellen, minimieren die Anzahl der Tiere für die Experimente benötigt, und bietet einen hohen Reinigung Ertrag aus einem porcinen Gehirn. Obwohl Reinigung und Pflege von Primärzellen ist etwas zeitaufwändig und erfordert Know-how für Standardisierung bei der Einrichtung des Modells, generieren Primärzellen die zuverlässigste BBB-Modelle. Immortalisierte Zelllinien können nicht Ersatz, als wichtige Eigenschaften sein, wie z. B. Barriere Engegefühl, Transporter Expressionsprofile und Mikroumgebung Verordnung nicht entsprechen die experimentelle Befunde in Vivo61, 62. in-vitro- Modelle bieten den Vorteil von live-Cell imaging mit höherer Auflösung, die Visualisierung von intrazellulären Prozessen ermöglichen dadurch, dass einen unmittelbarer Nähe Ansatz für die Stichproben oder beobachteten Zellen, mit Zielen mit höheren Vergrößerung und bessere optische Qualität63. Dies gilt nicht für die Verwendung von zwei-Photonen-Mikroskopie in lebenden Tieren. Des weiteren bieten in-vitro- Modelle die Möglichkeit, Zellen, erlaubt Visualisierung von tagged Proteine und Untersuchung ihrer Menschenhandel transfizieren.
Anwendungen des Modells
Die Funktion der BBB ist nicht festgelegt und kann dynamisch in Physiologie und Pathologie moduliert werden. Bei vielen neurologischen Krankheiten, einschließlich Neurodegenerative entzündliche und infektiöse Erkrankungen, Störungen und erhöhte Durchlässigkeit der BBB beobachtet64,65,66,67 . Um zu verringern und Fortschreiten der Krankheit und Folgeschäden zu verhindern, sind die Identifizierung und Charakterisierung der molekularen Mechanismen der Modulation der BBB von großer Bedeutung. In diesem Zusammenhang zuverlässige in-vitro- Modelle sind in der hohen Nachfrage durch die pharmazeutische Industrie, und außerdem eine wichtige Rolle bei der Vorhersage des BBB Permeabilität von Drogen an die CNS. Jedes in-vitro- Modell als eine Durchlässigkeit Bildschirm sollte eine restriktive parazellulär Weg, eine physiologisch realistische Zellarchitektur und funktionelle Expression von Transporter Mechanismen68anzeigen. Zeigte, in früheren Studien16,17,57, und durch parazellulär Durchlässigkeit und Ausdruck der TJ und AJ Proteine hier das vorgestellte Modell erfüllt alle diese Kriterien und eignet sich für eine Reihe von BBB Studien in beiden normalen Physiologie und Pathologie. Die Stärken der die vorgestellte Methode der Reinigung und Pflege sind eine Kombination aus Einfachheit und Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit, astrocytic zu beeinflussen, mit einem daraus resultierenden robust und zuverlässig hohe TEER in-vitro- BBB-Modell. Für diesen Zweck, Astrozyten von Schweinen und Ratte Ursprung haben gezeigt, dass die BBB-Phänotyp der pBECs in einer ähnlichen Art und Weise22ergänzen.

<table><tbody><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Low Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Aus Plasma gewonnenes Serum (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>Mischen Sie die 70 %ige Lösung aus dem 96 %igen EtOH</td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Hergestellt mit Elga System</td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Costar Transwell-Einsätze (Zellpermeable Membraneinsätze)</td><td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12-Well-Platte, 12 mm Durchmesser, 0,4 &mu; m Polycarbonat-Membran</td></tr><tr><td>15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Flasche</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>Typ 24</td></tr><tr><td>Gewebehomogenisator</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; m Filter</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filter</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm Kammersystem</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12</td><td>EndOhm Kammer für 12mm Culture Cups</td></tr><tr><td>EVOM2 Elektrodensystem</td><td>World Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td><td>TEER Messsystem mit starrem STX-100C Elektrodenpaar</td></tr><tr><td>Lange Nadel</td><td>Sigma</td><td></td><td>An einer Spritze befestigen</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette mit feiner Spitze</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette mit breiter Spitze</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Filterhalter</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Spritze</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Spritze</td><td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Occludin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-p120 Catenin-Antikörper</td><td>BD Transduktionslabor 610133 atorien</td><td></td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-ZO-1-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Esel-Anti-Maus-IgG, konjugiert mit Alexa-Mehl 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0,15 μ; l/ml Endbearbeitung conc</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Sigma</td><td>L0144 10</td><td>&micro; g/ml Endarbeitsergebnis</td></tr></tbody></table>

verbesserte methode für die einrichtung einer in-vitro- blut - hirn-schranke modell auf porcinen endothelzellen gehirnzellen basiert

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Das Ziel dieses Protokolls stellt eine optimierte Verfahren für die Reinigung und Pflege der pBECs und in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modelle basierend auf pBECs in Mono-Kultur (MC), MC mit Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), zu etablieren und berührungslose Kokulturen (NCC) mit Astrozyten von Schweinen oder Ratte Herkunft. pBECs waren isoliert und kultiviert aus Fragmenten der Kapillaren aus dem Gehirn Cortex von Hausschweinen ca. 5-6 Monate alt. Diese Fragmente wurden durch sorgfältige Entfernung der Hirnhaut, Isolation und Homogenisierung der grauen Substanz, Filtration, enzymatischen Verdauung und Zentrifugation gereinigt. Um weitere kontaminierende Zellen zu beseitigen, wurden die Kapillare Fragmente mit Puromycin-haltigen kultiviert Medium. Bei 60-95 % Zusammenfluss pBECs wächst aus der Kapillare Fragmente zu passagiert wurden durchlässige Membranfilter fügt und die Modelle gegründet. Um Barrier Dichtigkeit und BBB charakteristischen Phänotyp der pBECs zu erhöhen, wurden die Zellen mit folgenden Differenzierungsfaktoren behandelt: Membran permeationsfähigen 8-CPT-Zaatari (hier abgekürzt), Hydrocortison und ein Phosphodiesterase-Hemmer, RO-20-1724 (RO). Das Verfahren erfolgte über einen Zeitraum von 9-11 Tage, und bei der Festlegung der NCC-Modell waren die Astrozyten 2 bis 8 Wochen im Voraus kultiviert. Einhaltung der beschriebenen Verfahren des Protokolls ermöglichte die Errichtung der endothelialen Schichten mit stark eingeschränkter parazellulär Durchlässigkeit, mit NCC Modell zeigt einen durchschnittliche Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) 1249 ± 80 Ω cm 2, und parazellulär Durchlässigkeit (Papp) für Luzifer gelb 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm s-1 (meine ± SEM, n = 55). Weitere Auswertung dieser pBEC Phänotyp zeigte guten Ausdruck der engen Knoten Proteine Claudin 5, ZO-1, occludin und Adherens Junction Proteins p120-Catenin. Das vorgestellte Modell eignet sich für eine Vielzahl von Studien der BBB in Gesundheit und Krankheit, und mit der sehr restriktive parazellulär Durchlässigkeit, eignet sich dieses Modell für Studien von Verkehr und Handel mit intrazellulären.

Gründung der BBB In-vitro- Modelle
In der vorgestellten, optimierte Methode Anbau von pBECs und die Errichtung des durchlässige Membran einfügen mit MC oder ohne ACM oder NCC mit Astrozyten (Abbildung 1) für einen Zeitraum von 9 bis 11 Tagen (Abbildung 2) erfolgte. Für die Auswahl von Endothelzellen, wurde eine erste Kultur der gereinigten Kapillare Fragmente komb...

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Reinigung und Isolierung von primären Endothelzellen des Schweinehirns, um ein enges In-vitro-Blut-Hirn-Schrankenmodell zu erstellen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten, wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten, die Permeabilität, den Rezeptortransport sowie die Enge und Polarität des BB. Der Hauptvorteil dieses Modells ist die hohe Ausbeute an primären Hirnendothelzellen, die zur Erstellung eines in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodells verwendet werden können, das eine hohe TEER und eine geringe Permeabilität aufweist. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Gehirne in eine sterile Strömungsbank und waschen Sie sie vorsichtig mit einem Liter PBS in einem auf Eis gestellten Becherglas.Entfernen Sie als Nächstes vorsichtig die Hirnhäute mit einer Pinzette mit feiner Spitze aus jedem Gehirn. Kratzen Sie mit einem Skalpell die graue Substanz nacheinander vom Gehirn ab und geben Sie das isolierte Material in Petrischalen mit 20 Millilitern DMEM/F-12, die auf Eis gelegt werden. Für eine erste Fragmentierung führen Sie das Material der grauen Substanz ohne Nadel durch eine 50-

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Diese Methode beschreibt, wie zu isolieren und zu verewigen mikrovaskulären Endothelzellen von der Maus Gehirn. Wir beschreiben ein Schritt-für-Schritt-Protokoll ausgehend von der Homogenisierung von Hirngewebe, Verdauungsschritten, Aussaat und Immortalisierung der Zellen. Normalerweise dauert es etwa fünf Wochen, um eine homogene, verewigt mikrovaskuläre Endothelzellen Zelllinie zu erhalten.

Erzeugung eines Immortalisierte Murine Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen Zelllinie als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blut-Hirn-Barriere Modell

Dieses Video zeigt die Isolierung von Kapillaren aus frischen Schweinegehirnen. Der Prozess umfasst die Entfernung der Hirnhäute, die Isolierung der grauen Substanz aus dem Gehirngewebe, die Homogenisierung und Filterung der grauen Substanz, um die Kapillaren zu isolieren, und schließlich die enzymatische Verdauung, um die Kapillaren weiter zu reinigen.

Reinigung der Kapillaren aus dem Schweinegehirn

Einrichtung von Menschenmodelle der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​kann die Forschung in Gehirn Bedingungen mit BBB Versagen profitieren. Wir beschreiben hier ein verbessertes Verfahren zur Herstellung einer Kontakt BBB Modell, das Co-Kultur von Astrozyten und menschlichen Endothelzellen des Gehirns auf den gegenüberliegenden Seiten einer porösen Membran erlaubt.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Mikrovaskuläre Endothelzellen (BMEC) des Gehirns sind durch spezifische Verbindungsproteine miteinander verbunden, die eine hochregulierte Barriere zwischen Blut und dem Zentralnervensystem (ZNS) bilden, die sogenannte Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die Isolierung primärer mikrovaskulärer Endothelzellen des murinen Gehirns, wie in diesem Protokoll beschrieben, ermöglicht detaillierte in vitro-Studien der BHS.

Isolierung von primären murinen Gehirn mikrovaskulären Endothelzellen

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Die menschliche Blut-Hirn-Schranke verhindert selektiv das Eindringen hydrophiler Moleküle und Krankheitserreger in das Gehirn. Mehrere Pathologien, einschließlich Meningitis und postoperatives Delirium, sind mit einer erhöhten Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke verbunden. Hier beschreiben wir ein Endothelzellkulturmodell, um die Barrieredurchlässigkeit durch mikrobielle Traversal zu testen.

Analyse der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Barriere durch mikrobielle Traversale durch mikrovaskuläre Endothelzellen

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Lernen Sie die optimierte Methode zur Einrichtung eines In-vitro-Blut-Hirn-Schranken-Modells mit primären porcinen Hirnendothelzellen. Dieses Protokoll liefert hohe TEER-Werte und niedrige Permeabilität für Arzneimittelforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert (Video) | JoVE Journal

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

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