Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Reinigung und Isolierung von primären Endothelzellen des Schweinehirns, um ein enges In-vitro-Blut-Hirn-Schrankenmodell zu erstellen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Blut-Hirn-Schranke zu beantworten, wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten, die Permeabilität, den Rezeptortransport sowie die Enge und Polarität des BB. Der Hauptvorteil dieses Modells ist die hohe Ausbeute an primären Hirnendothelzellen, die zur Erstellung eines in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodells verwendet werden können, das eine hohe TEER und eine geringe Permeabilität aufweist. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Gehirne in eine sterile Strömungsbank und waschen Sie sie vorsichtig mit einem Liter PBS in einem auf Eis gestellten Becherglas.

Entfernen Sie als Nächstes vorsichtig die Hirnhäute mit einer Pinzette mit feiner Spitze aus jedem Gehirn. Kratzen Sie mit einem Skalpell die graue Substanz nacheinander vom Gehirn ab und geben Sie das isolierte Material in Petrischalen mit 20 Millilitern DMEM/F-12, die auf Eis gelegt werden. Für eine erste Fragmentierung führen Sie das Material der grauen Substanz ohne Nadel durch eine 50-Milliliter-Spritze.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Gehirne und bündeln Sie das gesammelte Material der grauen Substanz. Übertragen Sie das isolierte Material der grauen Substanz mit DMEM/F-12-Medium in das Mahlröhrchen eines tragbaren Gewebehomogenisators. Homogenisieren Sie das Material, indem Sie mit einem losen Stößel acht Auf- und Abbewegungen ausführen, gefolgt von acht Auf- und Abbewegungen mit einem festen Stößel.

Isolieren Sie anschließend die Kapillaren, indem Sie das Homogenat mit einer 500-Milliliter-Flasche mit blauem Verschluss mit Filterhalter und 140-Mikron-Filternetz filtrieren. Legen Sie die kapillarhaltigen Filter in Petrischalen mit einer Aufschlusslösung. Inkubieren Sie anschließend die Petrischalen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde auf einem Orbitalschüttler bei 180 U/min oder rühren Sie sie alle 10 Minuten vorsichtig um.

Waschen Sie nach einer Stunde die Kapillaren von den Filtern mit Suspension aus der Petrischale ab. Teilen Sie dann die Suspension aus den drei Schalen in zwei 50-Milliliter-Röhrchen auf und stoppen Sie den Aufschluss, indem Sie 10 Milliliter DMEM/F-12 in jedes 50-Milliliter-Röhrchen geben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspensionen bei 250 mal g, vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Anschließend werden die Überstände abgesaugt und jedes Pellet in 10 Millilitern DMEM/F-12 resuspendiert. Geben Sie dann weitere 20 Milliliter DMEM/F-12 in jedes Röhrchen. Um die Bedingungen für die Bindung von PBECs zu optimieren, wird dem T-75-Kolben eine Beschichtungslösung zugesetzt, die zu den Endkonzentrationen von Kollagen vier bei 150 Mikrogramm pro Milliliter und Fibronektin bei 50 Mikrogramm pro Milliliter und durch destilliertes Wasser führt, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösung die gesamte Oberfläche bedeckt.

Tauen Sie anschließend die Kapillaren in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Um das Gefriermedium zu entfernen, drehen Sie die Kapillaren sieben Minuten lang bei 250 mal g, vier Grad Celsius, nach unten. Danach wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und das Pellet in ein bis zwei Millilitern des 10-Milliliter-Aliquots resuspendiert.

Übertragen Sie anschließend die Kapillarsuspension in den beschichteten T-75-Kolben und kippen Sie den Kolben vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung über die Oberfläche zu gewährleisten. Stellen Sie den T-75-Kolben auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ein. Nach der Inkubation über Nacht werden 10 Milliliter PBEC-Wachstumsmedium, ergänzt mit Puromycin in einer Menge von vier Mikrogramm pro Milliliter für einen T-75-Kolben, hergestellt und ein Medienwechsel durchgeführt.

Bereiten Sie dann die durchlässigen Membraneinsätze für die PBEC-Aussaat vor, indem Sie sie mit Kollagen IV bei 500 Mikrogramm pro Milliliter und Fibronektin bei 100 Mikrogramm pro Milliliter sowie mit destilliertem Wasser beschichten. Trypsinisieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung in den T-75-Kolben geben und ihn fünf bis sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, platzieren. Um die Endothelzellen des Gehirns zu lösen, klopfen Sie vorsichtig mit den Fingerspitzen auf die Seite des T-75-Kolbens.

Übertragen Sie anschließend die Zelllösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Endothelzellen des Gehirns durch Zentrifugation bei 250 mal g, vier Grad Celsius, sieben Minuten lang herunter. Entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Medium. Fügen Sie dann weitere zwei Milliliter Medium hinzu, um das Gesamtvolumen auf drei Milliliter zu bringen.

Zählen Sie die Anzahl der Zellen manuell mit einer Zellzählkammer oder einem automatischen Zellzählsystem. Für die berührungslose Kokultur übertragen Sie die Einsätze in die Vertiefungen mit Astrozyten, die am Vortag mit Astrozytenwachstumsmedium aufgefrischt wurden. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium auf den permeablen Membraneinsätzen, die PBECs enthalten.

Saugen Sie dann das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen an und geben Sie 750 Mikroliter Differenzierungsmedium in jede Vertiefung. Anschließend wird vorsichtig Medium aus den Einsätzen abgesaugt und 500 Mikroliter Differenziermedium pro Einsatz zugegeben. Geben Sie dann die restlichen 750 Mikroliter Differenzierungsmedium in jede Astrozytenvertiefung.

Danach inkubieren Sie die Zellen mit Differenzierungsmedium bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, bis zum nächsten Tag. Bereiten Sie am Tag nach der Stimulation der Zellen mit Differenzierungsmedium das Gewebewiderstandsmesskammersystem für TEER-Messungen vor, indem Sie die Kammer zweimal mit bi-destilliertem Wasser, einmal mit 70 % Ethanol für fünf Minuten und zwei weitere Male mit bi-destilliertem Wasser spülen. Schließen Sie dann die Kammer an das System an, geben Sie vier Milliliter DMEM/F-12 in die Gewebewiderstandsmesskammer und lassen Sie es etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur halten.

Führen Sie danach TEER-Messungen durch, indem Sie die Einsätze vorsichtig in die Gewebewiderstandsmesskammer einsetzen. Hier sind die Phasenphasenkontrastmikroskopie-Bilder von PBECs, Kulturen und Astrozyten, die über fünf Tage hinweg betrachtet wurden. Gereinigte Kapillarfragmente am ersten Tag der Erstkultur zeigten das Vorhandensein von Kapillaren und kontaminierenden Zellen, die nach dem Wechsel des Mediums am zweiten Tag und einem weiteren Wachstumstag eine Selektion für PBECs zeigten und ihr Wachstum aus den Kapillarfragmenten begannen.

Konfluente Monoschichten von PBECs wurden in der Regel an den Tagen vier bis sechs erreicht, wobei die PBECs zu diesem Zeitpunkt eine spindelförmige Morphologie aufwiesen und in Längsrichtung ausgerichtet waren. Ratten-Astrozyten, die in den unteren Vertiefungen ausgesät wurden, vermehrten sich normalerweise innerhalb von fünf Tagen zu konfluenten Schichten und wurden nach zwei Wochen Wachstum für kontaktlose Kokulturmodelle verwendet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Stunden durchgeführt werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die Wirkstoffabgabe und den Rezeptorhandel in engen und polarisierten Endothelzellen des Gehirns zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein In-vitro-Blut-Hirn-Schrankenmodell erstellen, das für neue Studien verwendet werden kann, die in vivo nicht durchgeführt werden können.