Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist der Nachweis von Ablagerungen von Proteinaggregaten sowohl in klinischen als auch in wissenschaftlichen Aufbauten. Die Färbung und Analyse von Gewebe aus Tiermodellen der Prionenkrankheit und Alzheimer-Krankheit wird beschrieben. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Amyloidbereich zu beantworten, wie z. B. das Vorhandensein kleiner Mengen von Proteinaggregaten und deren intrinsische Konformationsvariationen.

Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie selektiver und empfindlicher ist als andere herkömmliche Techniken. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose verschiedener Proteinfehlfaltungskrankheiten, da die Sonden für die gewünschte Visualisierungstechnik angepasst werden können. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, da hFTAA eine so niedrige Färbekonzentration erfordert.

HFTAA weist zudem eine längere Anregungs- und Emissionswellenlänge im Vergleich zu herkömmlichen Farbstoffen auf. Bereiten Sie die lumineszierende konjugierte Oligothiophenlösung her, indem Sie lyophilisiertes hFTAA in zwei Millimolaren Natriumhydroxid resuspendieren, um eine Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter herzustellen. Die Stammlösung in ein Glasfläschchen umfüllen und bei vier Grad Celsius lagern.

Wenn formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Abschnitte verwendet werden, über Nacht in Xylol entparaffinieren. Tauchen Sie die Schnitte am Tag der Färbung jeweils zehn Minuten lang in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH2O und PBS. Lassen Sie die Gewebeabschnitte dann unter Umgebungsbedingungen trocknen.

Während das Gewebe trocknet, bereiten Sie eine Arbeitslösung von hFTAA vor, indem Sie den Stamm um eins auf 10.000 in PBS verdünnen. Wenn das Gewebe trocken ist, geben Sie Tröpfchen der hFTAA-Arbeitslösung zu jedem Gewebeabschnitt, um ihn zu bedecken. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Spülen Sie die Färbelösung mit 500 Mikrolitern PBS ab und tauchen Sie den Objektträger dann 10 Minuten lang in das PBS-Bad. Nachdem Sie den Schnitt unter Umgebungsbedingungen trocknen ließen, montieren Sie ihn mit Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht absetzen.

Die Amyloid-Detektion kann direkt nach der Montage oder auch ohne Montage durchgeführt werden. Wenn das Ziel des Experiments jedoch darin besteht, qualitativ hochwertige spektrale Informationen zu sammeln, wird eine Inkubation über Nacht bevorzugt. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware, benennen Sie das Projekt, wählen Sie das Spektralbild aus und starten Sie die Aufnahme.

Wählen Sie das interessierende Objekt durch das Okular mit dem 436-Nanometer-Anregungsfilter aus und verschieben Sie den Lichtweg zur Kamera. Wählen Sie im Falldaten-Manager den Probentyp Spektral aus, beschriften Sie das Muster und drücken Sie auf Erfassen. Das Erfassungsfenster wird geöffnet.

Öffnen Sie unter Spektrale Bildgebung das Einstellungsmenü, wählen Sie Erfassungseigenschaften und stellen Sie den Spektralbereich auf 460 bis 700, die Geschwindigkeitsqualität bei maximaler Geschwindigkeit und den Messtyp auf Gaslaser-Schmalfilter ein. Schließen Sie das Dialogfeld. Wählen Sie im Bildmenü Live Full aus.

Deaktivieren Sie in der Symbolleiste des Symbols die Farbsäume. Wählen Sie einen Bereich für die Abbildung aus, und stellen Sie sicher, dass der Spitzenwert des Arbeitsspeichers unter 800 MB liegt. Stellen Sie die Belichtungszeit auf einen Wert ein, der eine Gesamtbildhelligkeit zwischen 1.000 und 3.000 ergibt.

Drücken Sie in der Symbolleiste des Symbols auf die farbige Kamera. Die Akquisition wird beginnen. Wenn die Bildaufnahme abgeschlossen ist, drücken Sie im Dialogfeld "Spektralbild erfassen" auf "Speichern" und dann im Dialogfeld "Falldatenmanager" auf "Neue Zelle".

Öffnen Sie im Falldatenmanager das gesammelte Bild mit der Schaltfläche Analyse starten. Das Fenster zur Datenanalyse wird geöffnet. Spektrale Informationen können von jedem Pixel des Bildes erfasst werden, indem ROIs im Dialogfeld für die Spektralanzeige ausgewählt werden.

Wählen Sie "Definieren" und wählen Sie "ROIs" aus den relevanten Bereichen des Bildes aus. Speichern Sie die Spektraldaten mit der Schaltfläche Lib als Textdatei. Die gespeicherte txt-Datei kann in eine beliebige Analysesoftware Ihrer Wahl importiert werden.

Öffnen Sie die Mikroskopsoftware und beginnen Sie mit der Einrichtung des konfokalen Mikroskops. Stellen Sie die Laserintensität auf 0,2 %, die Lochblende auf eine Airy-Einheit, die Bildgröße auf 1.024 x 1.024 Pixel, die Scangeschwindigkeit auf sieben im Durchschnitt über 16 Scans und die Bittiefe auf acht Bit ein. Um das Emissionsspektrum zu erfassen, wählen Sie den Lambda-Modus und den Argon-Laser auf 488 Nanometer.

Sammeln Sie Emissionen zwischen 499 und 691 Nanometern mit 22 Kanälen im 32-Kanal-Gasp-Detektor. Stellen Sie die Verstärkung auf 755 ein. Klicken Sie auf die Live-Schaltfläche und ändern Sie die Palette in die Bereichsanzeige und passen Sie die Verstärkung an, um nicht überladene Pixel in Rot zu ermöglichen.

Klicken Sie auf die Stopp-Schaltfläche und nehmen Sie dann das Bild mit der Snap-Taste auf. Um Einzelkanalbilder zu erhalten, wählen Sie die Option Smart Setup. Wählen Sie FITC und Alexa 532 aus.

Wählen Sie Lineares Entmischen und Anwenden. Passen Sie die Verstärkung an, um nicht überladene Pixel zu ermöglichen. Stellen Sie für FITC die Verstärkung auf 693 und für Alexa 532 die Verstärkung im Live-Modus auf 433 ein.

Klicken Sie auf die Stopp-Schaltfläche und nehmen Sie dann das Bild mit der Snap-Taste auf. Schalten Sie das Mikroskop in den FLIM-Modus. Stellen Sie die Lochblende auf 20, die Anregungswellenlänge auf 490 Nanometer und die Laserintensität auf 0,5 % einVerwenden Sie gepulste Laser bei 40 Megahertz.

Richten Sie in der FLIM-Software die Photonenzählung über 550 Nanometer ein. Befolgen Sie im Fenster mit den Anzeigeparametern die Photonenzählung, bis die maximale Anzahl bei etwa 4.000 Photonenzahlen liegt. Speichern Sie die Datei und exportieren Sie sie als SPC-Bild.

Dieses Bild zeigt Mallory-Denk-Körperchen, die aus Keratinaggregaten in Leberhepatozyten bestehen, die mit DAPI gegengefärbt sind. Hier werden P62-positive Einschlüsse in sporadischem Einschlusskörper-Myositis-Skelettmuskelgewebe gezeigt. Dieses Bild zeigt einen Amyloid-Einschluss von Insel-Amyloid-Polypeptid in der menschlichen Bauchspeicheldrüse.

Hier ist eine Amyloid-Ablagerung der Immunglobulin-Leichtkette im menschlichen Darm dargestellt. Dieses Bild zeigt Ablagerungen von Prionenproteinaggregaten von Schaf-Scrapie im Gehirn von Mäusen. Hier sind Prionproteinaggregate in einem Mäusegehirn dargestellt, das mit der Chronic Wasting Disease infiziert ist.

Dieses Bild zeigt A-beta-Amyloid-Plaques im Gehirn von APP23-Mäusen. Und dieses Bild zeigt die A-beta-Pathologie im Gehirn einer APP-PS1-Maus. Diese Fettbiopsie-Abstriche von diagnostischen Proben von Transthyretin-Amyloid bei menschlichen Patienten, die nach dem Standard-Kongo-Rot-Scoring von eins bis vier eingestuft wurden.

Die gelben Bereiche zeigen hFTAA-gefärbte Transthyretin-Amyloid-Ablagerungen, und blau ist die Autofluoreszenz aus Fettgewebe. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, in ausreichend niedriger Konzentration zu färben. Denken Sie auch daran, Langpassfilter zu verwenden, um den maximalen Kontrast zu erzielen und Autofluoreszenz und Hintergrundfärbung zu vermeiden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um das aggregierte Protein und coaggregierte Proteine zu identifizieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Amyloidose, um Proteinaggregatstrukturen zu erforschen, und für die organische Chemie, um neuartige Sonden für diese Ziele zu entwickeln. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die LCO-Färbung durchführen, um sie mit unterschiedlichen Techniken zu bebildern.