Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die zellulären Wechselwirkungen zwischen menschlichen Hornhautstromazellen und neuronalen Zellen in ihrer natürlichen extrazellulären Matrix zu untersuchen. Das Protokoll kann erweitert werden, um Hornhauterkrankungen und Dystrophien wie Keratokonus, diabetische Keratopathie und Fuchs-Dystrophie zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der menschlichen Hornhautbiologie zu beantworten, indem sie die zugrunde liegenden Mechanismen und Defekte in den Wechselwirkungen des Stromanervs während einer bestimmten Hornhauterkrankung oder -dystrophie identifiziert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Zellen in vitro ihre eigene extrazelluläre Matrix sezernieren können, die ein besseres und genaueres Modell des tatsächlichen menschlichen Hornhautgewebes in vivo liefert. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Hornhauterkrankungen, da die Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Zelle und Zelle und extrazellulärer Matrix eine genaue Darstellung des Hornhautgewebes gewährleistet und eine gezieltere Arzneimittelentwicklung ermöglicht. Jetzt kann diese Methode Einblicke in die Schädigung und Regeneration von Hornhautnerven geben.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf das Screening und die Entwicklung von Medikamenten. Nach Erhalt der menschlichen Hornhautgewebeproben werden die Gewebe in eine 21,5 Quadratzentimeter große Schale mit zwei Millilitern steriler Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung überführt. Positionieren Sie die Hornhautkuppel mit der Vorderseite nach oben und kratzen Sie die Epithelschicht mit einer Rasierklinge in einem 45-Grad-Winkel ab.

Drehen Sie dann die Hornhautkuppel mit der Vorderseite nach unten um und kratzen Sie das Endothel gründlich vom Stroma ab. Waschen Sie das Stromagewebe mit DPBS. Halten Sie die Stromastücke mit DPBS feucht und verwenden Sie eine chirurgische Klinge mit der Nummer 10, um das Stromagewebe in kleine Stücke zu schneiden.

Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Stromastücke ohne Medien in einen T25-Kulturkolben zu überführen. Lassen Sie die Explantate etwa 30 bis 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius am Boden des Kolbens haften. Nachdem Sie das Stromagewebe präzise geschnitten haben, geben Sie den Kolben vorsichtig in den Inkubator.

Es ist wichtig, 30 bis 40 Minuten einzuplanen und dann langsam Medien hinzuzufügen. Dieser Schritt ist entscheidend, um ein vollständiges Anhaften der Explantate zu ermöglichen und deren Ablösung zu verhindern. Nach dem Kleben wird langsam Eagle's Minimum Essential Medium, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum enthält, in den Kolben gegeben, ohne die Explantate zu stören.

Stellen Sie den Kolben vorsichtig bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator. Die Explantate werden ungestört gelassen, bis sich die Zellen im Kolben zu isolieren und zu wandern beginnen. Nach etwa zwei bis vier Wochen sollten die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen.

Bei 100%iger Konfluenz passieren Sie die Zellen, indem Sie das Gewebekulturmedium entfernen und die Zellen mit DPBS waschen. Geben Sie Trypsin in die Zellen und inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius. Betrachten Sie die Zellen nach etwa fünf Minuten unter einer Lichtmikroskopie, um zu bestätigen, dass sie sich abgelöst haben.

Stoppen Sie die Proteolyse durch Zugabe von frischem Medium und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1000 x g, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören, und suspendieren Sie die Zellen in frischem Medium.

Nach Durchführung einer Zellzählung wird etwa eins mal 10 auf die sechs Zellen im T75-Kulturkolben mit frischem Medium zur weiteren Expansion ausgesät. Um ein 3D-Konstrukt zusammenzusetzen, durchlaufen und zählen Sie zuerst die menschlichen Hornhautfibroblasten, dann säen Sie ungefähr eins mal 10 zu den sechs HCF auf einen Polycarbonat-Membraneinsatz mit 0,4 Mikron Poren. Gib 1,5 Milliliter frisches Medium auf die Oberseite des Konstrukts.

Pipettieren Sie dann weitere 1,5 Milliliter des gleichen Mediums auf den Boden jedes Konstrukts. Fügen Sie nach 24 Stunden 1,5 Milliliter Medium hinzu, ergänzt mit 0,5 Millimolar Vitamin C auf die Ober- und Unterseite jedes Konstrukts. Inkubieren Sie drei Wochen lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und fügen Sie jeden zweiten Tag frische Medien mit Vitamin C hinzu.

Dadurch werden die Zellen dazu angeregt, ihre eigene extrazelluläre Matrix zu sezernieren und zusammenzusetzen. Fügen Sie nach drei Wochen acht mal 10 zu den dritten humanen SH-SY5Y-Neuroblastomzellen auf die zuvor zusammengesetzten 3D-Konstrukte hinzu. Es ist wichtig, in diesem Schritt die genaue Zellzahl zu berechnen und 24 Stunden einzuplanen, bevor die Zelldifferenzierung eingeleitet wird.

Nach 24 Stunden Inkubation initiieren Sie die SH-SY5Y-Zelldifferenzierung, indem Sie die Zellen mit 1,5 Millilitern EMEM mit 10 % FBS und 10 mikromolaren Retinsäure stimulieren. Geben Sie dann 1,5 Milliliter des Vitamin C-haltigen Mediums auf den Boden des Konstrukts. Retinsäure ist lichtempfindlich, daher sollte dieser Schritt im Dunkeln durchgeführt werden.

Nach fünf Tagen, wenn die Zellen die Differenzierungsphase erreichen, fügen Sie 1,5 Milliliter serumfreies Medium hinzu, das zwei nanomolare BDNF und 1% Antibiotikum-Antimykotikum enthält. Geben Sie frisches, mit Vitamin C angereichertes Medium auf den Boden des Konstrukts. Kultivieren Sie die Zellen zwei weitere Tage lang, bevor sie für die weitere Analyse verarbeitet werden.

Dies ist ein Transmissionselektronenmikroskopie-Bild mit hoher Vergrößerung des selbstorganisierten 3D-Konstrukts, das die Polycarbonatmembran und die darauf sitzenden Hornhautstromazellen zeigt. Dieses Bild zeigt die differenzierten neuronalen Zellen auf der Spitze, die eine stromal-neuronale Zellanordnung aufweisen. Die Pfeile im Bild zeigen die neuronalen Zellen.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Hornhautgewebe beim Schneiden von Explantaten immer feucht zu halten und chirurgische Instrumente und Klingen steril zu halten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dieses In-vitro-Modell einrichten und verwenden, um die Zellinteraktionen zwischen menschlichen Hornhautstromazellen und neuronalen Zellen in ihrer natürlichen extrazellulären Matrix zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BDNF, Retinsäure und chirurgischen Klingen äußerst gefährlich sein kann und bei diesem Eingriff immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen geeigneter Schutzkleidung.