Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert
13. September 2017
Dieses Protokoll beschreibt eine in-Vitro menschliche präklinischen Modell des Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten kultiviert mit Brustkrebszelllinien, die Krebs Zelle Osteoklasten Interaktion zu imitieren. Das Modell könnte verwendet werden, um unser Verständnis der Metastasierung Knochenbildung und Therapiemöglichkeiten zu verbessern.
Das übergeordnete Ziel dieses präklinischen In-vitro-Modells der Osteoklastogenese am Menschen, das aus peripheren Blutmonozyten (PBMCs) gewonnen wird, die mit Brustkrebszelllinien kultiviert wurden, besteht darin, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Osteoklasten nachzuahmen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Knochenmetastasierung über die Auswirkungen der Interaktion von Krebszellen und Knochenzellen innerhalb der Knochenmikroumgebung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein vollständig menschliches präklinisches Modell handelt.
Diese Methode kann auch Aufschluss über die Knochenmetastasierung geben. Es kann auch zur Untersuchung anderer knochenbezogener pathologischer Mechanismen, wie z. B. Osteoporose, angewendet werden. Personen, die neu in dieser Methode sind, können aufgrund der Variabilität unter den gesunden Spendern und bei der Auswahl der geeigneten PBMC-Zelldichte Schwierigkeiten haben.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie unsere PBMC-Auswahl und die Seeding-Schritte sehen müssen, die einige manuelle Erfahrung erfordern, bevor die Kompetenz erreicht werden kann. Beginnen Sie damit, mindestens 20 Milliliter Vollblut von gesunden Spendern in EDTA im Verhältnis eins zu eins in PBS zu verdünnen. Nach gründlichem Mischen die Blutlösung in 30 Milliliter Aliquots in konische 50-Milliliter-Röhrchen aufteilen.
Unterlegen Sie vorsichtig 15 Milliliter Lymphozytentrennmedium in den Boden jedes Röhrchens. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Und ziehen Sie die weißen, mononukleären Zellen mit den Buffy Coats in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.
Waschen Sie die geernteten Zellen zweimal in 20 Millilitern PBS pro Waschgang, gefolgt von einer Lyse der roten Blutkörperchen mit fünf Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen für drei bis fünf Minuten auf Eis. Stoppen Sie die Reaktion mit 20 Millilitern PBS und sammeln Sie die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet wieder und vervollständigen Sie alpha M-E-M zum Zählen.
Dann plattieren Sie die Zellen bei einer Siebenkommatemperatur fünfmal 10 bis zu einer Konzentration von fünf PBMC pro Quadratzentimeter in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Entfernen Sie nach etwa drei Stunden den Überstand, die Ablagerungen, die nicht gebundenen Zellen und die unlysierten Erythrozyten aus den Kulturen. Und fügen Sie frisches Medium hinzu, ergänzt mit MCSF.
Waschen Sie die Zellen vierzehn Tage nach der Aussaat zweimal mit PBS und fixieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in vier Prozent Paraformaldehyd. Führen Sie die Fallenfärbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Die osteoklastenähnlichen Zellen sind TRAP-positiv und haben mindestens vier Zellkerne.
Zählen Sie die osteoklastenähnlichen Zellen manuell unter dem Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung. Für die durch Krebszellen induzierte Osteoklastendifferenzierung, wenn die Krebszellen eine neunzigprozentige Konfluenz erreichen, werden sie durch Trypsinisierung abgelöst und auf Nullkomma-Poreneinsätze von vier Mikrometern in einer Konzentration von vier mal 10 bis drei Zellen pro Quadratzentimeter in frischem Alpha-MEM ausgesät. Am nächsten Tag legen Sie die ausgesäten Inserts auf undifferenzierte, eintägige plattierte mononukleäre Zellkulturen in vollständigem alpha M-E-M und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.
Dann, 11 Tage nach Beginn der Co-Kultur, werden die Einsätze in eine neue Platte überführt, die das entsprechende Reagenz für die gewünschte nachgelagerte Analyse enthält. Brustkrebszellen können die Osteoklastogenese aufrechterhalten, da die Anzahl der Osteoklasten in den von Krebszellen induzierten Vertiefungen ähnlich ist wie in den Kontrollwells mit positivem Wachstumsfaktor. Die Anzahl der in allen Kulturen beobachteten Osteoklasten verringert sich jedoch, wenn die Zellen mit einem Antitumormedikament behandelt werden.
Interessanterweise sind die Oberflächen von gereiften Osteoklasten, die von Wachstumsfaktoren abgeleitet werden, größer als die, die von Krebszellen induziert werden. Dieser Effekt wird in Kulturen, die mit Antitumormedikamenten behandelt wurden, nicht beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben, acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche nachgelagerte Analysen wie Genexpressionsanalyse, Western Blot, Immunfluoreszenzanalyse oder ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Krebszell-/Knochenzell-Interaktionen oder zu Anti-Tumor-Wirkstoffmechanismen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Knochenmetastasierung, um die Mikroumgebung des Knochens in einem vollständig menschlichen präklinischen Modell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Monozyten co-kultiviert und sich mit Krebszellen differenziert.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben und Medikamenten äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln getroffen werden sollten.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines in-vitro-menschlichen präklinischen Modells der Osteoklastogenese aus peripheren Blutmonozyten, die mit Brustkrebszelllinien kultiviert werden, um die Interaktion zwischen Krebszelle und Osteoklast nachzuahmen. Dieses Modell kann helfen, zentrale Fragen zur Knochenmetastasierung zu beantworten und therapeutische Optionen zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Osteoklastogenese
- Knochenmetastasierung
- Wechselwirkungen von Krebszellen
Hintergrund
- Das Modell verwendet periphere Blutmonocyten (PBMCs).
- Es zielt darauf ab, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Osteoklasten nachzubilden.
- Diese Forschung ist bedeutend für das Verständnis knochenbezogener Pathologien.
- Die Variabilität zwischen gesunden Spendern kann die Ergebnisse beeinflussen.
Zweck der Studie
- Um die Interaktionen zwischen Krebszellen und Osteoklasten nachzuahmen.
- Um die Auswirkungen dieser Interaktionen im Knochen-Mikromilieu zu untersuchen.
- Um Einblicke in die Knochenmetastasierung und verwandte Erkrankungen zu gewinnen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von PBMCs mit Brustkrebszelllinien.
- Beurteilung der Osteoklastogenese.
- Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Knochenzellen.
- Analyse der Variabilität der PBMC-Zelldichte.
Hauptergebnisse
- Das Modell bildet erfolgreich die Interaktionen zwischen Krebszellen und Osteoklasten ab.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können therapeutische Strategien für Knochenmetastasen leiten.
- Mögliche Anwendungen erstrecken sich auf andere knochenbezogene Erkrankungen.
- Herausforderungen bestehen in der Spender-Variabilität und der Auswahl der Zelldichte.
Schlussfolgerungen
- Dieses präklinische humanisierte Modell ist wertvoll für die Untersuchung von Knochenmetastasen.
- Es vertieft das Verständnis der Wechselwirkungen von Krebszellen im Knochen-Mikromilieu.
- Zukünftige Studien können dieses Modell für weiterreichende Anwendungen in der Knochenpathologie nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses vollständig humane präklinische Modell ermöglicht die mechanistische Risikominimierung osteoklastogener Signalwege bei Knochenmetastasen, indem es die Interaktion zwischen Krebszellen und Osteoklasten in einem physiologisch relevanten System nachbildet. Es unterstützt die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays für antitumorale Wirkstoffe, indem es quantitative Messgrößen für Differenzierung und Funktion von Osteoklasten bereitstellt. Das Modell erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen, da es die direkte Beobachtung wechselseitiger Interaktionen sowie die nachgeschaltete Analyse beider Zelltypen unter Bedingungen der Wirkstoffbehandlung erlaubt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen bezüglich der tumorinduzierten Osteoklastogenese und die Aufklärung von Signalwegen im Knochen-Mikromilieu.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominderung und funktionale Zielstrukturvalidierung, indem die Differenzierung von Osteoklasten aus primären humanen Monozyten unter definierten Kokulturbedingungen modelliert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und ermöglicht die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem die Osteoklastenbildung als Reaktion auf Stimuli von Krebszellen im Vergleich zu Wachstumsfaktor-Kontrollen quantifiziert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem standardisierte Osteoklastendifferenzierung aus PBMCs unter Verwendung von RANKL und MCSF durchgeführt wird.
- Operationaler Wert: Trägt zur Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays bei, indem eine feste Zelldichte (7,5×10⁵ PBMC/cm²) und eine zeitlich definierte Differenzierung (14 Tage) mit TRAP-basierter Quantifizierung von Osteoklasten angewendet wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die zuverlässige Evaluierung von Substanzen durch Untersuchung der Wirkung von Wirkstoffen auf die Osteoklastogenese in indirekten (konditioniertes Medium) und direkten Ko-Kultur-Systemen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung der Krankheitsrelevanz für Osteoporose und andere Knochenerkrankungen durch Anpassung des Osteoklastogenese-Assays.
- Operativer Wert: Gewährleistet eine translationale Kontinuität durch die Verwendung vollständig humaner Zellen und verringert damit das Spezies-Übertragungsrisiko bei der präklinischen bis klinischen Extrapolation.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Veränderungen der Osteoklastenzahl und der Oberfläche als pharmakodynamische Biomarker für die Wirksamkeit von Wirkstoffen gemessen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für knochenzielgerichtete Therapien und Modulatoren des Knochenmikromilieus.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von krebszell-abgeleiteten Faktoren bei der Osteoklastenaktivierung und die Aufklärung von RANKL-unabhängigen Mechanismen der Osteoklasteninduktion.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays durch standardisierte Isolierung von Monozyten, Differenzierung und Kokultur mit Brustkrebszelllinien auf durchlässigen Inserten zur Untersuchung parakriner und juxtakriner Signalwege.
- Analytik: Ermöglicht quantitative Auswertungen der Osteoklastenaktivität mittels TRAP-Färbung, Zählung mehrkerniger Zellen und morphometrischer Analyse (Oberfläche), um experimentelle Bedingungen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem sie die Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf das metastatische Knochenmikromilieu unter Verwendung klinisch relevanter Brustkrebszelllinien ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Modulation von Osteoklasten über verschiedene Krebsarten und Knochenerkrankungen hinaus, die über Brustkrebs hinausgehen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bei der Interaktion zwischen Osteoklasten und Krebszellen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch definierte Protokolle zur Isolierung von PBMCs, zur Ansiedlungsdichte und zur Supplementierung mit Zytokinen.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem eine frühe Beurteilung der Wirkstoffeffekte auf die Bildung und Funktion von Osteoklasten ermöglicht wird, wodurch biologische Risiken in fortgeschrittenen Stadien von Programmen zur Knochenmetastasierung reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem das osteoklastogene Potenzial von Substanzen quantifiziert und die Weiterentwicklung anhand der Modulation der Knochenmikroumgebung gesteuert wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung, Kultivierung und Differenzierung primärer humaner Zellen, einschließlich der Trennung von PBMCs und der Monocytenadhärenz.
- Basiert auf Instrumentierung zur Zellzählung, Zentrifugation, Mikroskopie (10fache Vergrößerung zur Zählung von Osteoklasten) und Inkubation (37 °C, 5 % CO₂).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, insbesondere hinsichtlich der Herkunft der PBMC-Spender, der Optimierung der Zelldichte (7,5 × 10⁵ PBMC/cm²) und des Zeitpunkts der Kokultur (11 Tage nach Aussaat der Krebszellen), um die Variabilität zu minimieren.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf nicht-mammakarzinomartige Zelllinien oder alternative Osteoklast-Stimuli über RANKL/MCSF hinaus ausgedehnt wird.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Spender-abhängige Variabilität des Differenzierungspotenzials von Osteoklasten sowie die Notwendigkeit manueller Erfahrung in der Aussaat von PBMCs und dem Aufbau der Kokultur.
