Entwicklung eines menschlichen präklinischen Modell der Osteoclastogenesis aus peripherem Blut Monozyten Co mit Brustkrebszelllinien kultiviert

Das übergeordnete Ziel dieses präklinischen In-vitro-Modells der Osteoklastogenese am Menschen, das aus peripheren Blutmonozyten (PBMCs) gewonnen wird, die mit Brustkrebszelllinien kultiviert wurden, besteht darin, die Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Osteoklasten nachzuahmen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Knochenmetastasierung über die Auswirkungen der Interaktion von Krebszellen und Knochenzellen innerhalb der Knochenmikroumgebung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein vollständig menschliches präklinisches Modell handelt.

Diese Methode kann auch Aufschluss über die Knochenmetastasierung geben. Es kann auch zur Untersuchung anderer knochenbezogener pathologischer Mechanismen, wie z. B. Osteoporose, angewendet werden. Personen, die neu in dieser Methode sind, können aufgrund der Variabilität unter den gesunden Spendern und bei der Auswahl der geeigneten PBMC-Zelldichte Schwierigkeiten haben.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie unsere PBMC-Auswahl und die Seeding-Schritte sehen müssen, die einige manuelle Erfahrung erfordern, bevor die Kompetenz erreicht werden kann. Beginnen Sie damit, mindestens 20 Milliliter Vollblut von gesunden Spendern in EDTA im Verhältnis eins zu eins in PBS zu verdünnen. Nach gründlichem Mischen die Blutlösung in 30 Milliliter Aliquots in konische 50-Milliliter-Röhrchen aufteilen.

Unterlegen Sie vorsichtig 15 Milliliter Lymphozytentrennmedium in den Boden jedes Röhrchens. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Und ziehen Sie die weißen, mononukleären Zellen mit den Buffy Coats in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen.

Waschen Sie die geernteten Zellen zweimal in 20 Millilitern PBS pro Waschgang, gefolgt von einer Lyse der roten Blutkörperchen mit fünf Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen für drei bis fünf Minuten auf Eis. Stoppen Sie die Reaktion mit 20 Millilitern PBS und sammeln Sie die weißen Blutkörperchen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet wieder und vervollständigen Sie alpha M-E-M zum Zählen.

Dann plattieren Sie die Zellen bei einer Siebenkommatemperatur fünfmal 10 bis zu einer Konzentration von fünf PBMC pro Quadratzentimeter in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Entfernen Sie nach etwa drei Stunden den Überstand, die Ablagerungen, die nicht gebundenen Zellen und die unlysierten Erythrozyten aus den Kulturen. Und fügen Sie frisches Medium hinzu, ergänzt mit MCSF.

Waschen Sie die Zellen vierzehn Tage nach der Aussaat zweimal mit PBS und fixieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in vier Prozent Paraformaldehyd. Führen Sie die Fallenfärbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Die osteoklastenähnlichen Zellen sind TRAP-positiv und haben mindestens vier Zellkerne.

Zählen Sie die osteoklastenähnlichen Zellen manuell unter dem Mikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung. Für die durch Krebszellen induzierte Osteoklastendifferenzierung, wenn die Krebszellen eine neunzigprozentige Konfluenz erreichen, werden sie durch Trypsinisierung abgelöst und auf Nullkomma-Poreneinsätze von vier Mikrometern in einer Konzentration von vier mal 10 bis drei Zellen pro Quadratzentimeter in frischem Alpha-MEM ausgesät. Am nächsten Tag legen Sie die ausgesäten Inserts auf undifferenzierte, eintägige plattierte mononukleäre Zellkulturen in vollständigem alpha M-E-M und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.

Dann, 11 Tage nach Beginn der Co-Kultur, werden die Einsätze in eine neue Platte überführt, die das entsprechende Reagenz für die gewünschte nachgelagerte Analyse enthält. Brustkrebszellen können die Osteoklastogenese aufrechterhalten, da die Anzahl der Osteoklasten in den von Krebszellen induzierten Vertiefungen ähnlich ist wie in den Kontrollwells mit positivem Wachstumsfaktor. Die Anzahl der in allen Kulturen beobachteten Osteoklasten verringert sich jedoch, wenn die Zellen mit einem Antitumormedikament behandelt werden.

Interessanterweise sind die Oberflächen von gereiften Osteoklasten, die von Wachstumsfaktoren abgeleitet werden, größer als die, die von Krebszellen induziert werden. Dieser Effekt wird in Kulturen, die mit Antitumormedikamenten behandelt wurden, nicht beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben, acht Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche nachgelagerte Analysen wie Genexpressionsanalyse, Western Blot, Immunfluoreszenzanalyse oder ELISA durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu Krebszell-/Knochenzell-Interaktionen oder zu Anti-Tumor-Wirkstoffmechanismen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Knochenmetastasierung, um die Mikroumgebung des Knochens in einem vollständig menschlichen präklinischen Modell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Monozyten co-kultiviert und sich mit Krebszellen differenziert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben und Medikamenten äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Laborkitteln getroffen werden sollten.