MicroRNA Based Flüssigbiopsie: Die Erfahrung der Plasma MiRNA Signatur Klassifikator (MSC) für Lung Cancer Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Spiegel von 24 plasmazirkulierenden microRNAs zu messen, um das Risiko für die Entwicklung von Lungenkrebs bei starken Rauchern über 50 Jahren zu bestimmen. Diese Methoden können die Kosteneffizienz eines niedrig dosierten Computertomographie-Screening-Programms zur Früherkennung von Lungenkrebs erhöhen, indem sie die Anzahl falsch positiver Knoten und möglicherweise eine Überdiagnose reduzieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Sekretion von microRNA mit Standardgeräten, die gängige Molekularlaboratorien verwenden, einfach zu messen ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir begannen, die Rolle der Tumormikroumgebung bei der Entstehung von Lungenkrebs zu untersuchen. MicroRNAs spiegeln die Reaktion des Wirts und die dynamische Interaktion zwischen dem Tumor und seiner Mikroumgebung wider. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Standardverfahren für diese Art der molekularen Analyse besser zu verstehen.

Um dieses Protokoll zu starten, verwenden Sie Vacutainer-Röhrchen, um 10 Milliliter Vollblutprobe zu entnehmen. Bei Raumtemperatur lagern. Lagern Sie Vollblut nicht bei niedrigen Temperaturen, wie z. B. bei vier Grad Celsius, um Temperaturschocks und Zelllyse zu vermeiden.

Das führte uns zu einer spezifischen microRNA-Freisetzung. Zentrifugieren Sie das Plasma innerhalb einer Stunde, um es zu trennen. Achten Sie jedoch darauf, den Kontakt mit dem Lymphring zu vermeiden.

Den Überstand in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Dann zentrifugieren Sie den Überstand unter den gleichen Bedingungen. Aliquotieren Sie einen Milliliter dieses Plasmaüberstands in 1,5-Milliliter-Kryofläschchen, wobei darauf zu achten ist, dass sich die Plasmafraktion nicht vom Röhrchenboden sammelt

Um mit der RNA-Isolierung zu beginnen, fügen Sie 200 Mikroliter vorgekühlte OMG-Lösung zu 200 Mikrolitern Plasma für jede Probe hinzu. Um eine vollständige Homogenisierung zu gewährleisten, wirbeln Sie den Wirbel für 15 bis 30 Sekunden ein. Um die Probe zu homogenisieren, fügen Sie 200 Mikroliter Lysepuffer und 25 Mikroliter Protein-ASK pro Probe hinzu und wirbeln Sie sie 20 Sekunden lang auf.

Anschließend werden die Proben 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermomischer inkubiert. Wählen Sie als Nächstes die RSC mi-RNA-Gewebemethode und legen Sie eine Kartusche für jede Probe auf eine Deckschale eines automatischen Nukleinsäureextraktors, wobei Sie den Kolben richtig platzieren. Übertragen Sie das Lysat und fügen Sie fünf Mikroliter DNase one Lösung an die entsprechenden Positionen in der Instrumentenkartusche hinzu.

Geben Sie an den Boden jedes Elutionsröhrchens 60 Mikroliter nukleasefreies Wasser. Um die automatische Reinigung zu starten, starten Sie den Lauf. Lagern Sie die gesamten RNA-Proben bei 80 Grad Celsius.

Um die RNA mit dem Taq miroRNA Reverse Transkriptionskit in CDNA umzuwandeln, verwenden Sie das Taq RT Primer-Tool mit den gewünschten mi-RNAs. Bereiten Sie in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird, die RT-Reaktionsmischung gemäß den Anweisungen des Kits vor. Fügen Sie dann 3 Mikroliter Gesamt-RNA pro Probe zu einem Endvolumen von 15 Mikrolitern hinzu.

Fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Laden Sie abschließend die Proben auf einen Thermocycler und führen Sie die RT-Reaktion durch. Mischen Sie dann 2,5 Mikroliter jedes RT-Reaktionsprodukts mit Taq Master Mix 2X und Custom Taq Pool.

Geben Sie nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 25 Mikrolitern hinzu. Führen Sie die Voramplifikationsreaktion in einem Thermocycler unter Verwendung eines spezifischen thermischen Profils durch. Verdünnen Sie dann jedes Produkt durch Zugabe von 175 Mikrolitern 0,1 XTE PH 8,0.

Mischen Sie zunächst 1,13 Mikroliter der verdünnten voramplifizierten Probe mit 2X Taq Universal Master Mix in einem 0,5-Milliliter-Röhrchen. Und dann füge nukleasefreies Wasser hinzu. Um die Plasmaspiegel von 24 spezifischen miRNAs an acht Proben gleichzeitig zu messen, verwenden Sie eine 384-Well-Mikrofluidik, eine kundenspezifische Taq-Array-microRNA-Karte.

Laden Sie bis zu acht Reaktionen mit dem PCR-Reaktionsmix auf die Karte. Zentrifugieren Sie die benutzerdefinierte Karte zwei Minuten lang bei 311 mal G und versiegeln Sie sie mit einem Array-Kartensiegel. Legen Sie die Karte abschließend in ein Echtzeit-PCR-System und führen Sie die Echtzeit-PCR-Reaktion durch.

Um Daten zu extrapolieren und zu analysieren, verwenden Sie geeignete Software und erhalten Sie CT-Rohwerte. Legen Sie eine automatische Baseline fest, um die Hintergrundsignale zu entfernen, und einen festen Schwellenwert von 0,15 für alle Assays und Proben. Ein präanalytischer Qualitätskontrollschritt muss durchgeführt werden, um nicht analysierbare hämolysierte Plasmaproben zu identifizieren, in denen falsche Ergebnisse durch eine unspezifische Freisetzung von miRNA durch Blutzellen auftreten könnten.

Eine spektrophotometrische Analyse von Plasmaproben, die das Absorptionsverhältnis zwischen den Wellenlängen A414 und A375 misst, zeigt den Unterschied zwischen hämolysierten, nicht analysierbaren und nicht hämolysierten Proben. Um technische Probleme zu identifizieren, wird die RT-QPCR-Leistung bewertet. Vier hochwertige Mikrofluidikkarten führen zu RT-QPCR mit geringer Leistung, und in diesem Fall sollte das Vorverstärkerprodukt auf eine neue Mikrofluidikkarte geladen werden.

Mikrofluidikkarten von guter Qualität führen zu einer guten Leistung, und diese werden dann zwei nachanalytischen Qualitätskontrollschritten unterzogen. Nach Durchführung der Qualitätskontrolle wird der microRNA-Signaturklassifikator angewendet. Die vier Signaturen der miRNA-Verhältnisse, aus denen sich die MSC zusammensetzt, werden generiert.

Krankheitsrisiko, Risiko einer aggressiven Krankheit, Vorhandensein einer Krankheit und Vorhandensein einer aggressiven Krankheit. Durch die Kombination der vier Signaturen wird das Risikoniveau schließlich als niedrig, mittel oder hoch definiert. Einmal gemeistert, abgesehen von einer Woche Plasmalagerung bei 80 Grad Celsius, kann diese Technik in zehn Stunden durchgeführt werden.

Analyse von acht Proben gleichzeitig. Der microRNA-Signaturklassifikator wurde bisher an mehr als 10.000 Proben getestet, die von mehr als 4.000 Freiwilligen gesammelt wurden, die an der BioMed Lancaster Screening-Studie teilgenommen haben. Möglicherweise könnten diese Tests eine größere Konsistenz des Diagnosealgorithmus ermöglichen.

Sie senken auch die Screening-Kosten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, die zirkulierenden miRNA-Spiegel zu messen, um sie als Biomarker für die Krebsdiagnose und andere schwere Erkrankungen zu verwenden.