Name: Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexen mit magnetischen Pinzetten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Faltungsdynamiken und Proteinregulation für biophysikalische Forschung.

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Die Autoren danken Meng Pan für Korrekturlesen Manuskript. Diese Arbeit wird von Singapur Ministerium der Ausbildung akademische Forschung Fonds Stufe 3 (MOE2012-T3-1-001), J.Y unterstützt; der National Research Foundation über das Mechanobiology Institut Singapur, J.Y; der National Research Foundation, des Premierministers Büro, Singapur, unter seinem NRF Investigatorship Programm (NRF Investigatorship Award Nr. 03 / NRFI2016 / NRF, J.Y; die Grundlagenforschung Fonds für den Central-Universitäten (2017KFYXJJ153), H. Y.

1. Vorbereitung der G4 DNA Einzelmolekül-Stretching <ol><li>Prepare 5 '-Thiol beschriftet und 5 '-Biotin beschriftet DsDNA Griffe durch PCR mit DDNA Polymerase auf einen Lambda-Phagen DNA Schablone mit 5 '-Thiol und 5 '-Biotin Primer 14 ( Abbildung 1). Beide DsDNA-Griffe haben hohen GC-Gehalt (&gt; 60 %), um DNA zu verhindern schmelzen wenn DNA zu hohen Kräften oder während DNA Überdehnung stattfindet Übergang 15.</li>
	<li>Reinigen PCR-Produkte mit BstXI Restriktionsenzym laut Hersteller eine kommerzielle Reinigung Kit und verdauen ' s Protokoll.</li>
	<li>Verbinden G4 bilden SsDNA und Flanke SsDNA und DsDNA Griffe mit T4 DNA-Ligase laut Hersteller ' s-Protokoll. Die aufgespaltenen Produkt durch Gel-Extraktion mithilfe eines gewerblichen Reinigung-Kits nach Angaben des Herstellers zu reinigen ' s Protokoll.</li>
</ol> 2. Vorbereitung des Strömungskanals <ol><li>Deckglas Reinigung und Oberflächen Funktionalisierung <ol><li>Ort unten Deckgläsern (#1.5, 22 mm × 32 mm) und oberen Deckgläsern (#1.5, 20 x 20 mm) in Abdeckung Glas Gläser (jedes Glas fasst 7 Stück Deckgläsern, Färbung das Volumen beträgt ~ 20 mL). Spülen Sie die Deckgläsern in den Gläsern mit destilliertem Wasser 2-5 Mal.</li>
		<li>Add ~ 20 mL Reinigungslösung 5-40 % in jedes Glas und legen Sie dann in ein Ultraschall Reinigungsbad für 30 min. Spülen mit destilliertem Wasser für &gt; 10 Mal um die Reinigungsmittel zu entfernen.</li>
		<li>Deckgläsern in die Gläser im Ofen trocknen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß), oder durch N 2 Gas. Speichern Sie die getrockneten Top Deckgläsern in einem Trockenschrank.</li>
		<li>Einsatz Plasma (O 2 Gas) zu die Deckgläsern in der Dose für 10 min reinigen. Bereiten Sie während 10 min, 20 mL von 1 % (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) Lösung in Methanol (Vorsicht, giftig/entzündlich). Verwenden eine chemischen Dampfhaube APTES Methanol auflösen. 
		Hinweis: Vermeiden Sie Feuchtigkeit bei der Lagerung APTES Lösung. Alten APTES verursacht oft Problem in Oberfläche Funktionalisierung von Deckgläsern.</li>
		<li>Unmittelbar nach dem Plasma Reinigung, fügen Sie alle die 1 % APTES Lösung in die Gläser und inkubieren Sie für 1 h. Gießen Sie den Abfall in die Abfallflasche spezifisch für 1 % APTES Methanol. Führen Sie die Schritte im Zusammenhang mit Methanol in der Dunstabzugshaube für brennbare Chemikalien.</li>
		<li>Spülen Sie die Gläser einmal mit Methanol und &gt; 10 Mal mit destilliertem Wasser und dann trocknen von Ofen (~ 150 ° C; Vorsicht, heiß). Speichern der APTES-beschichtete Unterseite Deckgläsern für bis zu zwei Wochen bei Nichtgebrauch in einem Trockenschrank. 
		Hinweis: Nach jedem Teilschritt aus 2.1.1 bis 2.1.4 der Reinigungsprozess kann angehalten werden vor dem nächsten Schritt.</li>
	</ol></li> <li>Montage des Strömungskanals <ol><li>bereiten Sie zwei " Abstandshalter ", d.h., Parafilm oder doppelseitige Klebeband (~ 4 mm × 20 mm) für jeden Kanal. Legen Sie die zwei Stücke von Abstandhaltern auf einem unteren Deckgläschen entlang der langen Kante. Das Distanzstück, bilden eine Durchflusszelle dazwischen ein Top Deckglas auflegen (~ 10 mm × 20 mm Bereich, Figur 2A , B).</li>
		<li>Wenn Parafilm als Abstandhalter dient, platzieren Sie den Strömungskanal auf eine Heizung (60-120 ° C; Vorsicht, heiß) für 5-10 s drücken Sie sanft die Seiten des oberen Deckglas zwei Deckgläsern mit Parafilm zusammenhalten. Die resultierende Flow-Kanal hat eine Höhe von ~ 100 µm und damit das Volumen des Kanals beträgt ~ 20 µL.</li>
		<li>Dichtung die lange Kante des Kanals mit Silikonkleber um Leckagen zu vermeiden. Silikonkleber verwenden, um eine kleine Senke-ähnliche Struktur auf jede offene Kante des Strömungskanals, dient als ein Eingang und ein Ausgang der Lösung machen. 
		Hinweis: Die ein- und Ausreise können auch erfolgen durch andere Wege, z.B. durch anhaftenden kleinen Kunststoff-Ringe mit Wachs.</li>
		<li>Speichern von Sendern in einem Trockenschrank für bis zu 4 Wochen.</li>
	</ol></li> <li>Leine DNA auf der unteren Fläche des Strömungskanals <ol><li>verdünnen die amino-beschichtete Polystyrol-Kügelchen (Durchmesser: 3 µm) von 200 X in destilliertem 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer. Wirbel die Wulst-Lösung und dann in Kanäle fließen. Inkubieren Sie die Wulst-Lösung in Kanälen für ~ 30 min. Entfernen jede ablösen Perlen durch Waschen mit 200 µL 1 X PBS-Puffer.</li>
		<li>Anpassen (Zunahme/Abnahme) der Inkubationszeit einer Flächendichte von 1 bis 5 Perlen pro 50 mm x 50 mm-Bereich zu erreichen. Speichern Sie die Kanäle, hinterlegt mit den Referenz-Perlen für bis zu 3 Tage.</li>
		<li>Verdünnt Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC) Pulver in 1 X PBS-Lösung (~ 0,5 mg/mL). Vortex die Lösung und dann in den Kanal fließen. 
		Hinweis: Bereiten Sie frische Sulfo-SMCC-Lösung vor Gebrauch und den Kanal, Hydrolyse des SMCC zu vermeiden sofort hinzufügen.</li>
		<li>Inkubation die SMCC-Lösung in den Kanal für 30 min. Entfernen Sie die SMCC-Lösung durch Waschen mit einer großen Menge (1 mL ~ 50 X die Lautstärke des Kanals) 1 X PBS-Lösung. 
		Hinweis: Waschen Sie die überschüssige SMCC sorgfältig. Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Bindung von DNA auf das Deckglas.</li>
		<li><ol><li>DNA Anbindehaltung Verdünnen der Thiol-Biotin gekennzeichnet DNA in 1 X PBS, mit einer daraus resultierenden DNA-Konzentration von ~ 0,3 nM. Pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung, die DNA-Lösung in die SMCC-beschichtete Kanal fließen und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>Vorsichtig Waschen entfernt freien DNA mit 200 µL des Blockierens Projektmappe mit 1 X PBS mit 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01 % 2-Mercaptoethanol.</li>
		<li>Blockieren die Kanal-Oberfläche durch Inkubation des Kanals in blocking-Lösung (10 mg/mL BSA, 0,01 % 2-Mercaptoethanol) für &gt; 2 h; nach diesem Schritt, der Kanal ist bereit für Experimente. Die vorbereitete Kanal bei 4 ° C gehalten werden kann ~ 1 Tag. 
		Hinweis: Die Blockierungsschritt ist wichtig zur Reduzierung der unspezifischen Bindung von DNA und magnetische Beads zu den Deckgläsern.</li>
	</ol></li></ol> 3. Magnetischen Pinzette Setup und Identifizierung der einzelnen DsDNA Tether <ol><li>magnetischen Pinzette Setup <ol><li>Start der magnetischen Pinzette Steuern Programm. Hier die magnetischen Pinzette durch eine in-house-geschrieben LabVIEW-Programm gesteuert wurden.</li>
		<li>Richten Sie die Magnet-Zentren vor der Montage des Kanals. Ein 4 X Objektiv verwenden, um die X - und y-Achse die Magnete in der optischen Achse des Mikroskops anzupassen.</li>
		<li>Verwenden einen computergesteuerte motorisierte Manipulator zu bewegen die Magneten entlang der Z-Richtung ( Abb. 2A) und legen Sie den Abstand d = 0 (d: Abstand zwischen den Magneten und Deckglas) wenn die Magnete befestigen Ein Deckglas am Mikroskop.</li>
		<li>Programm der Bewegung des Magneten durch den Manipulator, Kontrolle von Gewalt, einschließlich konstanten Kraft (d.h., Konstante d) zu erreichen und unterschiedliche Zeit Kraft F (t) (d.h. Zeit unterschiedliche d(t )).</li>
		<li>Verwenden helle Lichtquelle Light Emitting Diode (LED) für zurückgestreute Beleuchtung des Wulstes durch das Ziel. Die Perle-Bilder bei einer Abtastrate von 100 Hz zu sammeln, indem Sie ein Ladegerät – gekoppelt (CCD) Kamera. &lt; / lIch &gt;</li></ol></li> <li>Probieren Sie Setup und identifizieren einzelne DsDNA Leine <ol><li>Leine Bildung <ol><li>sanft fließen in 200 X verdünnt M-280, paramagnetische Perlen in Assay-Lösung (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 ) in einen Kanal. Inkubieren Sie für 10 min bis die Perlen an Biotin-markierten DNA-Moleküle auf der SMCC-beschichtete Oberfläche durch Thiol-Label Ende immobilisiert binden zu lassen. Vorsichtig Waschen entfernt un-gefesselte Perlen mit 200 µL standard Reaktionslösung. 
			Hinweis: Der M-280 Perlen zeigen geringere unspezifische Bindung an die Oberfläche im Vergleich zu anderen kommerziellen magnetische Beads wie M-270.</li>
		</ol></li> <li>Montieren Sie den Kanal auf den Mikroskoptisch. Suche nach den Perlen auf der Bodenfläche mit 100 X Öl Immersion Ziel.</li>
		<li>Wählen Sie eine Referenz-Perle auf der Oberfläche und eine bewegliche gefesselte Perle. Die Anfangsbild Bibliotheken der Referenz Wulst und gefesselte Wulst an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge zu bauen.</li>
		<li>Kalibrierung des Perlen-Bildes <ol><li>vor Experimenten, verwenden Sie eine objektive Piezoaktor erhalten Sie Bilder von Referenz und gefesselte Perlen an verschiedenen Unschärfe Flugzeuge Abstand von 20-50 nm, die als zwei separate Wulst Bild gespeichert werden Bibliotheken und sind jeweils mit der Unschärfe-Abstand ( Abb. 2D) indexiert.</li>
		</ol></li> <li>X, y, Z Positionsbestimmung <ol><li>während der Experimente, bestimmen die Position der Schweißnaht in der X-y-Ebene durch die Wulst-Schwerpunkt. Bestimmen Sie die Höhenänderung des tethered Wulstes durch den Vergleich des aktuellen Bildes Wulst mit denen in der Bibliothek gespeichert. Verwenden Sie die Auto-Funktion Korrelationsanalyse der Leistungsspektrum der Fourier-Transformation der Wulst Bilder 16.</li>
		</ol></li> <li>Anti-Drift-Feedback über Referenz Perle <ol><li>während der Experimente, verwenden die Piezo, " Schloss " den Abstand zwischen dem Ziel und spezifische Referenz Wulst Bild in der Bibliothek durch eine niedrige Frequenz gespeichert Feedback zu steuern, so dass das Bild stecken Perle die beste Korrelation mit einem bestimmten Bild in der Bibliothek ( Bild 2D) gespeichert hat.</li>
		</ol></li> <li>Festzustellen, ob die Leine durch die Anwendung einer einzigen DsDNA-Molekül ist ~ 65 pN Kraft eines einzigen DsDNA-Molekül zu bestimmen, wenn die Leine durchläuft die charakteristischen DNA Überdehnung Übergang 17 , 18 , 19. Wiederholen Sie den Vorgang, bis ein einzelnes DsDNA-Tether gefunden wird. (Siehe den nächsten Abschnitt Kraft Kalibrierung und DNA Überdehnung Übergang).</li>
	</ol></li></ol> 4. Magnetischen Pinzette zwingen Kalibrierung <ol><li>bestimmen direkt die Kraft (bis zu 100 pN) für lange DNA (48.502 bp λ-DNA) Moleküle mit Wulst Fluktuation durch: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg"> , wobei k B ist die Boltzmann-Konstante, T ist die Temperatur in Kelvin-Skala, δ 2 y ist die Varianz der Wulst Fluktuation in der Richtung senkrecht zu dem Magnetfeld und die Kraft Richtung. In diese Richtung kann die Bewegung des Wulstes beschrieben werden als ein Pendel Fluktuation mit einer Länge von l + R 0, wo l ist die End-to-End Abstand entlang der Kraftrichtung (Verlängerung) der DNA, und R 0 ist der Radius der Perle 10 ( Abb. 3A).</li>
	<li>Bestimmen die Eichkurve für Kraft F als Funktion der Magnete zu Wulst Abstand d und F (d) für verschiedene Perlen mit der langen λ-DNA. In der Regel wird der Abstand zwischen Magnet und das Deckglas verwendet, wie die DNA-Tether Länge ignoriert werden kann. Passen die F-d-Kurve von der doppelten exponentiellen Zerfall-Funktion: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg"> , wo die passenden Parameter α1, α2, γ1, γ2 richten sich nach der magnetischen Pinzette und der Parameter C wird durch die heterogene Eigenschaft der magnetischen Beads bestimmt. Durch die Verlagerung der C, F-d-Kurve aus verschiedenen Perlen gewonnen werden kann überlappende 10 ( Abb. 3 b).</li>
	<li>Kalibrierung der Parameter C für die einzelnen magnetischen Kügelchen für kurze DNA experimentiert.
	<ol><li>Bestimmung der Kraft, die anhand der Fluktuation erfordert Aufzeichnung der Wulst-Position mit einer Frequenz höher als die Grenzfrequenz: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg"> , wobei γ ist die Drag Koeffizient der Wulst. Für kurze DNA bei hoher Krafteinwirkung es erfordert Aufnahmefrequenz schneller als 100 Hz, also die Kraft kann nicht direkt gemessen werden basierend auf Schwankungen mit der Kamera. Allerdings zwingen der Parameter C ermittelt werden, durch die Messung der Kraft auf einem niedrigen Bereich (&lt; 15 pN) mit Fluktuation und Anpassung der Daten mit einem kalibrierten F-d-Kurve zu den Parameter C 20.</li>
		<li>Alternativ für Experimente mit DsDNA, festlegen den Parameter C mit DNA Überdehnung Übergang bei einer Kraft von ~ 65 pN ( Abbildung 3) 21 , 22 , 23 durch die Aufnahme der d-Position an die DsDNA zeigte Erweiterung Sprung (0,6 X Längenzunahme der Kontur Länge). Nach der Festlegung des Parameters C, berechnen die Kraft für die gefesselten Perlen.</li>
	</ol></li> <li>Steuern die Raumbelastung durch die Programmierung der Bewegung des Magneten durch die Umkehrfunktion von F (d). Der Magnet sollte die Probe doppelt exponentiell nähern. 
	Hinweis: Ist der relative Fehler der Kraft, die durch solch eine Hochrechnung Methode bestimmt ~ 10 % und wird hauptsächlich durch die Perle Radius Heterogenität 20.</li>
</ol> 5. Einzelmolekül-Manipulation der G4 in Anwesenheit und Abwesenheit der verbindlichen Proteine <ol><li><ol><li>Kraft-Rampe experimentiert, nach der Identifizierung der DsDNA-Leine, führen Sie einen Kraftanstieg Scan auf eine Besatzrate von 0,2 pN/s gefolgt von einem Kraft-Ableben Scan auf -0,2 pN/s. Nach jedem stretching Zyklus halten das DNA-Molekül in 1 pN für 30 s erlauben die SsDNA zu G4 umfalten.</li>
	</ol></li> <li>Kraft-Sprung Experimente <ol><li>Zyklus der Gewalt zwischen 54 pN für 30 s, unter denen eine gefaltete G4 entfaltet werden könnte, und 1 pN für 60 s, unter denen eine gefaltete G4-15 t entfalten könnte.</li>
	</ol></li> <li>Fließende Proteinlösung <ol><li>fließen die Proteinlösung bei ~ 20 pN Kraft zur Befestigung der die Perlen auf dem Deckglas zu vermeiden. DEAH-Box RHAU Helikase, die hohen Spezifität der G4-Struktur zeigte, war verwendeten 24. Die rekombinante Drosophila Melanogaster RHAU (DmRHAU) Helikase wurde in Escherichia coli ausgedrückt und gereinigt wie zuvor beschrieben 25. Die G4 abwickeln Tätigkeit des DmRHAU auf ein Tetramolecular G4-DNA Substrat 13 untersucht wurde.</li>
	</ol></li> <li>Analysieren die sich entfaltenden Kraft mit einer hauseigenen geschrieben Matlab Programm 14.</li></ol>

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<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einzelmolekül-magnetischen Pinzette wird berichtet, wie beschrieben, eine Plattform für die Untersuchung der mechanischen Stabilität der G4-DNA und die Interaktionen von Proteinen mit G4. Begleiten die Plattform, sind hocheffiziente Protokolle zu finden, G4-DNA Haltegurt und Messung der Faltung entfaltet Dynamik und Stabilität der G4-Struktur mit Nanometer Sonderbeschluss entwickelt. Die Brennebene Verriegelung ermöglicht hochstabile Anti-Drift-Steuerelement, das ist wichtig für die Erkennung eines kleinen Struktur Überg...

Vier-Stranded DNA oder RNA G4 Strukturen spielen wichtige Rollen in viele wichtige biologische Prozesse1. Viele Proteine beteiligt sind G4 Bindung und Verordnung, einschließlich der Telomer-bindende Proteine (Telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, Transkriptionsfaktoren (Nucleolin, PARP1)3, RNA, Proteine (HnRNP A1, Verarbeitung HnRNP A2)4, Helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5und DNA-Replikation im Zusammenhang mit Proteinen (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindung kann stabilisieren oder destabilisieren G4 Strukturen; so regelt die nachfolgende biologische Funktionen. Die Stabilität des G4 wurde durch thermische schmelzen mit Ultraviolett (UV) oder kreisförmigen Dichroismus (CD) Methoden7gemessen. Solche Bedingungen sind jedoch nicht physiologischen relevant und sind schwierig, die Auswirkungen der verbindlichen Proteine7anzuwenden.
Die rasante Entwicklung im Einzelmolekül-Manipulation Technologien hat Studien von Falten und entfalten von ein Biomolekül, wie eine DNA oder ein Protein Einzelmolekül-Ebene mit Nanometer-Auflösung in Echtzeit8aktiviert. Rasterkraftmikroskopie (AFM), optische Pinzette und magnetischen Pinzette sind die am häufigsten verwendeten Methoden der Einzelmolekül-Manipulation. Im Vergleich zu AFM und optische Pinzette9, ermöglichen magnetischen Pinzette stabile Messungen der Faltung entfaltet Dynamik eines einzelnen Moleküls über Tage mithilfe einer Anti-Drift-Technik10,11.
Hier ist eine Einzelmolekül-Manipulation-Plattform magnetischen Pinzette, um die Regulierung der G4 Stabilität zu studieren, durch die Bindung von Proteinen gemeldeten12,13. Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Ansätze, einschließlich Probe und Flow-Kanal-Vorbereitung, das Setup der magnetischen Pinzette und die Kraft-Kalibrierung. Die Kraftregelung und die Anti-Drift-Protokolle wie beschrieben in Schritt 3 ermöglichen lange Zeitmessungen unter verschiedenen Kraft Steuerelemente, z. B. konstante Kraft (Kraft Klemme) und konstante laden bewerten (Kraft-Rampe) und Kraft-Sprung Messung. Das Kraft-Kalibrierung-Protokoll in Schritt 4 beschriebenen ermöglicht Kraft Kalibrierung des &#60; 1 µm kurze Anbindehaltung über eine große Kraft reichen bis zu 100 pN, mit einem relativen Fehler innerhalb von 10 %. Ein Beispiel für eine Regulierung der Stabilität der RNA-Helikase zugeordnete AU-reiche Element (RHAU) Helikase (Alias DHX36, G4R1), der spielt entscheidende Rolle bei der Lösung, dass RNA G4 verwendet wird, um die Anwendungen von dieser Plattform13demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>DNA-PCR-Primer</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA-Präparate</td></tr><tr><td>DNA-PCR-Chemikalien</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA-Präparate</td></tr><tr><td>Restriktionsenzym BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA-Präparate</td></tr><tr><td>Deckgläser (#1,5, 22*32 mm und 20*20 mm)</td><td>BMH. BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>M-280, paramganetische Kügelchen, Streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>Polybead Amino Mikrosphären 3.00 &mu; m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>Vorbereitung des Strömungskanals</td></tr><tr><td>Olympus Mikroskope IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Einrichtung der magnetischen Pinzette</td></tr><tr><td>Piezo-Z Tische P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Einrichtung der magnetischen Pinzette</td></tr><tr><td>Olympus Objektivlinse MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetpinzette einrichten</td></tr><tr><td>CCD/CMOS Kamera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetpinzette einrichten</td></tr><tr><td>Translation Lineartisch</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetpinzette einrichten</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetpinzette einrichten</td></tr><tr><td>Kubische Magnete</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetpinzette Einrichtung</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Einrichtung einer magnetischen Pinzette</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Datenanalyse</td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-manipulation von g-quadruplexe von magnetischen pinzette

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Nicht-kanonische Nukleinsäure-Sekundärstruktur, die G-Quadruplexe (G4) in verschiedenen zellulären Prozessen, wie DNA-Replikation, Transkription, RNS-Verarbeitung und Telomere Dehnung beteiligt sind. Während dieser Prozesse verschiedener Proteine binden und lösen G4 Strukturen, ihre Funktion auszuführen. Da die Funktion des G4 oft auf die Stabilität der gefaltete Struktur abhängt, ist es wichtig zu untersuchen, wie G4-bindende Proteine regulieren die Stabilität des G4. Dieses Werk stellt eine Methode zum manipulieren G4 Einzelmoleküle magnetischen Pinzette, die Studien über die Regulierung der G4-bindende Proteine auf ein einzelnes Molekül der G4 in Echtzeit ermöglicht. Im Allgemeinen ist diese Methode geeignet für ein breites Spektrum von Anwendungen in Studien für Proteine/Liganden Interaktionen und Vorschriften auf verschiedenen DNA- oder RNA-Sekundärstrukturen.

Die Testeinrichtung für die Dehnung eines einzelnen Moleküls G4 ist in Abbildung 4dargestellt. Eine einsträngige G4 bildende Sequenz erstreckte sich zwischen zwei DsDNA Griffe war zwischen einem Deckgläschen und einem paramagnetischen Perle angebunden. Um eine einzelne DsDNA gefesselte Perle zu finden, wurde ein overstretching Assay durchgeführt, durch die Erhöhung der Kraft bei konstanter Belastung. Drei Arten von Messungen dienten oft zur Untersuchung der F...

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Faltung und Entfaltung von G-Quadruplexen, abgekürzt G4, und die Regulation durch Bindung von Proteinen auf Einzelmolekülebene mit einer magnetischen Pinzette direkt zu messen. Diese Botschaft kann helfen, Schlüsselfragen im G4-Bereich zu beantworten, wie z.B. die Floating-Dynamik von G4 und die Regulation durch bindende Proteine. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine magnetische Pinzette eine stabile Messung der nanometergroßen Schwebedynamik eines einzelnen Moleküls über Tage hinweg ermöglicht, indem sie die Anti-Drift-Technik verwendet.Beginnen wir mit dieser Nachricht, die die inneren Mechanismen der G4-Stabilität liefern kann, die Helikase-Aktivitäten auf G4, es kann auch verwendet werden, um die Al-a-do-gees im Zusammenhang mit G4-Bindungsproteinen oder Ligans zu untersuchen, die potenzielle therapeutische Anwendungen haben könnten. Darüber hinaus kann es auch verwendet werden, um die äußeren Protein-DNA-Wechselwirkungen oder Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Präparation von G4-DNA im Strömungskanal, wie im Textprotokoll beschrieben.G4-DNA wurde durch Ligaten

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Magnetische Pinzette, ein leistungsfähiges Einzelmolekül-Manipulation Technik kann für die direkte Messung der Verdrehung angepasst werden (unter Verwendung einer Konfiguration mit der Bezeichnung frei umlaufenden magnetischen Pinzette) und Drehmoment (mit einer Konfigurations bezeichnet magnetischen Drehmoment Pinzette) in biologischen Makromolekülen. Richtlinien zur Durchführung solcher Messungen gegeben sind, einschließlich Anwendungen auf die Untersuchung von DNA und zugehörige...

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Optische Pinzetten wurden verwendet, um die RNA-Faltung zu untersuchen, indem einzelne Moleküle von ihren 5'- und 3'-Enden gedehnt wurden. Hier werden gängige Verfahren zur Synthese von RNA-Molekülen für die Pinzette, zur Kalibrierung des Instruments und Methoden zur Manipulation einzelner Moleküle beschrieben.

Nanomanipulation von RNA-Einzelmoleküle durch Optische Pinzetten

G4 Resolvase1 bindet an G-Quadruplex (G4) Strukturen mit dem engsten berichteten Affinität für ein G4-Bindungsprotein und stellt die Mehrheit der G4-DNA Abwickeln Aktivität in HeLa-Zellen. Wir beschreiben ein neuartiges Protokoll, das die Affinität und ATP-abhängige Abwickeln Aktivität von G4-Resolvase1 nutzt gezielt katalytisch aktive rekombinante G4R1 reinigen.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Bis-3-Chloropiperidine (B-CePs) sind nützliche chemische Sonden, um G-Quadruplex-Strukturen in DNA-Matrizen in vitro zu identifizieren und zu charakterisieren. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung von Sondierungsreaktionen mit B-CePs und zur Auflösung von Reaktionsprodukten durch hochauflösende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

In vitro Chemische Kartierung von G-Quadruplex-DNA-Strukturen durch Bis-3-Chlorpiperidine

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Dieses Protokoll stellt einen auf Fluoreszenzmikroskopie basierenden Einzelmolekül-DNA-Replikationsassay dar, der die Echtzeit-Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Polymerasen und Hindernissen wie G-Quadruplex-Strukturen ermöglicht.

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Visualisierung der DNA-Polymerase-Dynamik an G-Quadruplexen

Ein Protokoll für hochpräzise FRET-Experimente auf der Ebene der einzelnen Moleküle wird hier vorgestellt. Zusätzlich kann diese Methodik verwendet werden, um drei Konformationszustände in der Ligandenbindungsdomäne des N-Methyl-D-aspartat (NMDA) -Rezeptors zu identifizieren. Die Bestimmung von präzisen Abständen ist der erste Schritt zum Aufbau von Strukturmodellen auf der Basis von FRET-Experimenten.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

Erfahren Sie die Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexen mit magnetischen Pinzetten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Faltungsdynamiken und Proteinregulation für biophysikalische Forschung.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

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