Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Das übergeordnete Ziel des Organoid-Rekonstitutionsassays ist die funktionelle Analyse der beiden Hauptkomponenten der intestinalen Stammzellnische Lgr5, die in den Paneth-Zellen positiv sind, durch ihre genetische oder biochemische Modifikation, gefolgt von der Rekonstitution in selbsterneuernde Organoide. Diese Methode ermöglicht es, wichtige spezifische Fragen im Bereich der intestinalen Stammzellen zu beantworten, wie z.B. genetische oder biochemische Modifikationen in Stamm- und Nischenzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Gegensatz zu anderen Assays, die ganze Krypten verwenden, sortierte Stamm- und Nischenzellen verwendet und so eine zelltypspezifische Analyse ermöglicht.

Die Videodemonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, insbesondere wenn es um die Schritte der Gewebedissoziation und der Zellhandhabung geht. Wenn diese Schritte nicht richtig ausgeführt werden, führen sie zu einer schlechten Lebensfähigkeit der Zellen, insbesondere nach der Sortierung der Fakten. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung des Materials und dem Opfern einer Lgr5-Maus auf einem C57BL/6J-Hintergrund, wie im Textprotokoll beschrieben.

Präparieren Sie das Bauchfell in Längsrichtung mit einer Schere. Halten Sie den Magen mit der Pinzette fest und schneiden Sie ihn ab diesem Punkt mit einer Darmschere quer in zwei Hälften. Ziehen Sie den Darm heraus und legen Sie ihn in eine Petrischale, die PBS enthält.

Beginnen Sie damit, die stumpfe Spitze in den Magen zu stecken und schieben Sie sie vorsichtig durch den Pylorus. Fahren Sie fort, indem Sie mit der Schere schneiden und mit der Pinzette ziehen. Sobald der gesamte Dünndarm in Längsrichtung geöffnet ist, waschen Sie ihn in kaltem PBS, indem Sie ihn mit der Pinzette festhalten und mit U-förmigen Bewegungen vorsichtig in der PBS-Lösung spülen.

Sobald alle Stuhlreste entfernt sind, fahren Sie damit fort, den Darm auf einem Schneidebrett mit der Lumenseite nach oben flach zu drücken. Die Lumenseite ist leicht an dem Fehlen von Blutgefäßen und an ihrem blassen Aussehen im Vergleich zum äußeren Teil zu erkennen. Entfernen Sie mit einem Objektträger vorsichtig die Zotten, indem Sie den abgeflachten Darm abkratzen.

Führen Sie den Schritt zweimal über die gesamte Länge des Gewebes aus. Schneiden Sie dann den Dünndarm mit einer sterilen chirurgischen Klinge in zwei bis fünf Millimeter große Stücke. Geben Sie die Dünndarmfragmente in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern eiskaltem PBS.

Reinigen Sie die Gewebefragmente und entfernen Sie alle verbleibenden Verunreinigungen, indem Sie sie im PBS auf und ab pipettieren. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Schritt, bis der PBS vollständig frei ist. Fügen Sie als Nächstes 15 Milliliter kaltes PBS hinzu, um das Gesamtendvolumen von PBS auf 25 Milliliter zu bringen.

Fügen Sie zwei millimolare EDTA hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten lang auf einer Walze bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie das PBS-EDTA verworfen haben, fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu und lösen Sie die Krypten, indem Sie die Gewebefragmente hart auf und ab pipettieren. Sammelt dann den Überstand ein.

Wiederholen Sie diesen Schritt viermal. Kulturmedium hinzufügen, um ein Endvolumen von 50 Millilitern zu erreichen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Zum Schluss wird das Pellet in 10 Millilitern Nährmedium resuspendiert, bevor die Krypten durch Zentrifugation pelletiert werden. Für die Einzelzellpräparation verwirft man zunächst den Überstand der pelletierten Krypten und resuspendiert sie in einem Milliliter trypsinähnlicher Enzyme zusammen mit 50 Mikrolitern DNase. Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang in einem Wasserbad bei 32 Grad Celsius.

Nachdem Sie 10 Milliliter Nährmedium hinzugefügt haben, dissoziieren Sie die Krypten in einzelne Zellen, indem Sie mindestens fünfmal heftig auf und ab pipettieren. Filtern Sie die Lösung durch ein 40-Mikron-Sieb, um Klumpen und andere Verunreinigungen zu entfernen. Pelletieren Sie dann die einzelnen Zellen fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft.

Für die Durchflusszytometrie resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter einer gepufferten Salzlösung von X Hank mit 2 % fötalem Kuhserum pro Million Zellen. Zur Zellsuspension fügen Sie mit Brillantviolett 421 markierte Antikörper für die Abstammungsmarker CD31, CD45 und Ter119 in einer Konzentration von eins zu 100 hinzu. Fügen Sie außerdem Anti-CD24 APC und Anti-CD117 PE in einer Konzentration von eins bis 250 hinzu.

Nach 30 Minuten sortieren Sie Lgr5-positive Stammzellen und Paneth-Zellen in separate niedrig bindende Röhrchen. Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Medium mit den im Textprotokoll beschriebenen Komponenten.

Zur Behandlung der Zellen verwenden Sie fünf Mikroliter Liposomen-vermitteltes Transfektionsreagenz in einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern Kulturmedium und kleine interferierende RNA in einer Konzentration von 100 Nanomolaren. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius für kleine interferierende RNA oder für die Zeit, die für die gewählte Modifikation erforderlich ist. Waschen Sie die Zellen zweimal in 500 Mikrolitern Nährmedium.

Nachdem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei der 300-fachen Schwerkraft zentrifugiert haben, resuspendieren Sie sie in 10 Mikrolitern Kulturmedium. Als nächstes poolen Sie die beiden zellulären Komponenten in einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-facher Schwerkraft zentrifugieren. Inkubieren Sie die Paneth- und Lgr5-positiven Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

10 Mikroliter des Überstands werden entfernt und in einem Behälter mit Flüssigkeit belassen, um ein Ansaugen der Zellpellets zu vermeiden. Geben Sie dann 30 Mikroliter rekonstituierte Basalmembran zu den Zellen, um ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern zu erhalten. Resuspendieren Sie die Zellen und plättieren Sie sie in einer vorgewärmten 96-Well-Platte.

Nach 10 Minuten 200 Mikroliter volles Medium hinzufügen. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Zählen Sie schließlich die Multiplizität der Organoide am fünften Tag.

Ein kleiner interferierender RNA-vermittelter Knockdown des murinen APC-Gens in Lgr5-positiven Stammzellen und die daraus resultierende Aktivierung des kanonischen Wnt/beta-Catenin-Signalwegs wirkt sich positiv auf die Multiplizität der Organoide aus, verglichen mit ihren unbehandelten Gegenstücken oder der verschlüsselten Sequenzkontrolle. Die Konstitution der Wnt-Aktivierung rettet auch den Bedarf an Paneth-Zellen, wie bereits berichtet. Darüber hinaus erscheinen diese Organoide als Hohlkugeln, ein gut beschriebener Phänotyp für APC-mutierte oder Wnt-stimulierte Organoide, wenn man sie mit der Morphologie derjenigen vergleicht, die aus Paneth-Lgr5-Zelldubletten gewonnen wurden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieser Technik ist es wichtig, alle Schritte und Inkubationszeiten zu befolgen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Darmkrypten extrahiert, einen Einzelzellverdau vorbereitet und Nischen- und Stammzellen rekonstituiert, um Organoide zu erzeugen.

Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Darmstammzellen den Weg, um die spezifischen Wirkungen von Stamm- oder Nischenzellen im Dünndarm oder Dickdarm der Maus zu analysieren. Obwohl diese Methode für die funktionelle Analyse der Darmstammzellnische etabliert wurde, kann sie auch auf andere somatische Stammzellnischen wie die Brustdrüse oder den Haarfollikel angewendet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um die Expression von Genomproteinen in den Organoiden zu analysieren, wie z. B. QPCR oder Western Blotting.