Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu zeigen, wie mikrofluidische Chips mit integrierten Elektroden für transendotheliale oder transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen oder TEER-Messungen hergestellt und verwendet werden. Demonstriert wird dies anhand einer Blut-Hirn-Schranke im mikrofluidischen Chip. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Organs-on-Chips zu beantworten, indem sie die direkte Messung der Barrierefunktion von beispielsweise Blut-Hirn-Schrankengewebe mit integrierten Elektroden ermöglicht.

Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass Elektroden leicht in Organ-on-Chip-Systeme integriert werden können und dass die Ergebnisse zwischen den verschiedenen Systemen verglichen werden können. Die Auswirkungen dieser Technologie erstrecken sich auf das Verständnis der Blut-Hirn-Schrankenfunktion in Gesundheit und Krankheit, die Arzneimittelforschung und die personalisierte Medizin. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Funktion der Blut-Hirn-Schranke zu erhalten, kann sie auch im Zusammenhang mit anderen Organ-on-Chip-Systemen wie dem Lung-on-Chip und dem Gut-on-Chip verwendet werden.

Um diesen Vorgang zu beginnen, mischen Sie 27 Gramm PDMS-Basismittel und 2,7 Gramm Härtungsmittel gründlich. Entgasen Sie dann das Gemisch ca. 45 Minuten lang in einem Exsikator, um Luftblasen zu entfernen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Form für die flüssige PDMS-Mischung vor, indem Sie durchsichtiges Klebeband um die Form kleben oder die Form in einen geeigneten Waferhalter legen.

Gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung in die Form. Anschließend die PDMS-Mischung im Backofen bei 60 Grad Celsius vier Stunden lang aushärten und anschließend abkühlen lassen. Ziehen Sie in einer Kreuzstromhaube das ausgehärtete PDMS aus der Form.

Schneiden Sie die PDMS-Replik mithilfe von Schnittlinien im PDMS in separate obere und untere Spanteile. Stanzen Sie anschließend mit einem scharfen Biopsiestempel mit einem Millimeterdurchmesser vier Löcher in die oberen Teile, um Ein- und Auslässe zu bilden. Stanzen Sie von innen nach außen, um zu verhindern, dass sich PDMS-Schmutz im Chip ansammelt.

Decken Sie dann die Chipteile mit durchsichtigem Klebeband ab, um sie vor Staub zu schützen. Schneiden Sie anschließend die Polycarbonat-Membranen aus Transwell-Einsätzen in Quadrate von etwa drei mal drei Quadratmillimetern. Montieren Sie danach eine poröse Membran leckagefrei zwischen zwei PDMS-Teilen, um ein zweischichtiges Gerät zusammenzubauen, das mit einer porösen Membran verbunden ist.

Bereiten Sie dazu einen PDMS-Toluol-Mörtel mit 0,7 Gramm PDMS-Basismittel, 07 Gramm Härter und 540 Mikrolitern Toluol vor. Den Mörtel gründlich vortexen und dann 200 Mikroliter Mörtel bei 1500 U/min 60 Sekunden lang auf ein Glasdeckglas schleudern, um eine dünne, gleichmäßige Mörtelschicht zu erhalten. Übertragen Sie anschließend mit einer Farbwalze eine dünne Schicht Mörtel vom Deckglas auf den unteren Teil des Chips.

Legen Sie den unteren Teil in eine ofenfeste Form und geben Sie dann den Mörser auf den oberen Teil des Chips. Tauchen Sie mit einer Pinzette die Ränder einer Membran in den Schleudermörtel und platzieren Sie sie vorsichtig in der Mitte des unteren Teils. Platzieren Sie anschließend das Oberteil vorsichtig auf dem Unterteil und achten Sie dabei auf die Ausrichtung.

Decken Sie die Chipseinlässe mit durchsichtigem Klebeband ab, um das Eindringen von Staub in die Chips zu verhindern, und backen Sie sie drei Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Vorsicht ist in diesem Schritt sehr wichtig. Üben Sie keinen Druck auf den Span aus und schieben Sie das Oberteil nicht über das Unterteil, um zu verhindern, dass Mörtel in die Kanäle eindringt und die Membran verstopft.

Um Elektroden in die Seitenkanäle zu integrieren, schneidet man einen Platindraht in zwei Zentimeter lange Stücke. Tauchen Sie sie anschließend 30 Minuten lang in Aceton. Spülen Sie sie dann mit Wasser und Ethanol ab und lassen Sie sie trocknen.

Legen Sie in einer Kreuzstromhaube einen Chip auf eine Kunststoffschale. Führen Sie vier Platindrähte mit einer Pinzette in die Elektrodenkanäle des Chips ein und biegen Sie sie auf die Kunststoffschale, um im nächsten Schritt eine Fixierung an der Schale zu ermöglichen. Führen Sie die Drähte von 0,7 bis 1 Millimeter in den Kulturkanal über die T-förmige Kanalverbindung hinaus ein.

Tragen Sie anschließend einen Tropfen UV-härtenden Kleber am Elektrodenkanaleingang auf und lassen Sie den Kleber durch Kapillarkräfte den Kanal füllen. Schalten Sie dann das UV ein und härten Sie den Kleber aus, wenn er das Ende des Elektrodenkanals erreicht. Fixieren Sie die vier integrierten Elektroden mit einem Zweikomponenten-Epoxidkleber an der Kunststoffschale.

Anschließend die Chips mit klarem Klebeband abdecken und bei 60 Grad Celsius zwei Stunden backen. Abkühlen lassen und bis zur Verwendung staubfrei lagern. Um die Chips so zu beschichten, dass sie die Zelladhäsion fördern, füllen Sie zuerst beide Kanäle mit PBS, bevor Sie Reagenzien einführen.

Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich Luftblasen in den Kanälen befinden. Wenn ja, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit zusätzlichem PBS spülen. Füllen Sie anschließend beide Kanäle mit 30 Mikrolitern 20 Mikrogramm pro Milliliter humanem Fibronektin in PBS.

Inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie dann die Chips mit endothelialem Wachstumsmedium und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Messen Sie anschließend die TEER der Rohlingspäne, um sicherzustellen, dass alle Elektroden in direktem Kontakt mit der Flüssigkeit in den Kanälen stehen.

Nehmen Sie dazu einen Chip aus dem Inkubator und lassen Sie ihn mindestens zehn Minuten lang Raumtemperatur erreichen. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten aus der Kunststoffschale um die Elektroden, um Elektrobrückenbildung außerhalb des Chips zu verhindern. Nehmen Sie als nächstes das Impedanzspektrum von 200 Hertz bis zu einem Megahertz für jede Kombination von zwei Elektroden, was in fünf bis zehn Minuten sechs Impedanzspektren pro Chip ergibt, aus denen der TEER direkt bestimmt werden kann.

Überprüfen Sie, ob die Impedanzspektren die erwarteten Größen und Formen aufweisen, um die TEER-Messung zu validieren. Bereiten Sie nun eine Zellsuspension vor, die in den oberen Kanal eingesetzt wird, indem Sie das Kulturmedium aus einem Kulturkolben mit einer konfluenten Monoschicht aus hcMEC/D3-Zellen entfernen. Waschen Sie danach die Zellen mit PBS.

Entfernen Sie das PBS, fügen Sie dann zwei Milliliter 05-prozentiges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen vom Kulturkolben gelöst haben. Deaktivieren Sie dann das Trypsin mit Nährmedium, das mit 20 Prozent FBS angereichert ist. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie ihre Gesamtanzahl in Suspension.

In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die hcMEC/D3-Zellen fünf Minuten lang bei 390 mal g. Entfernen Sie anschließend den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in dem entsprechenden Volumen des endothelialen Wachstumsmediums, um eine Konzentration von fünf Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten, was einer Aussaatdichte von 200 Tausend Zellen pro Quadratzentimeter im Chip entspricht. Pipettieren Sie anschließend langsam 30 Mikroliter der gut gemischten Zellsuspension in den oberen Kanal und entfernen Sie die Pipette in einer fließenden Bewegung aus dem Einlass, während Sie immer noch Druck ausüben.

Überprüfen Sie die Saatdichte unter dem Mikroskop. Es sollte eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im oberen Kanal erreicht werden. Anschließend werden die Chips bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid mindestens eine Stunde lang inkubiert.

Spülen Sie anschließend alle nicht anhaftenden Zellen mit Endothelkulturmedium aus. Denken Sie daran, dass TEER während des Kulturzeitraums überwacht wird. Dies ist das typische schematische Impedanzspektrum, das die Impedanzgröße und die Phasenverschiebung gegen die Frequenz für die elektrische Impedanzspektroskopie auf Chips ohne Zellen und mit Zellen zeigt.

Es gibt vier Hauptbereiche, die von der Doppelschichtkapazität an den Elektroden, dem Nährmediumwiderstand, dem Zellbarrierewiderstand oder der Zellmembrankapazität dominiert werden. Die Region of Interest gibt an, wo der Beitrag der Zellschicht quantifiziert werden kann. Und das ist die Formel, um TEER aus den gemessenen Widerständen zwischen allen sechs Kombinationen von vier Elektroden zu berechnen.

Hier ist der durchschnittliche TEER von vier BBBs auf Chips während des Kulturzeitraums von drei Tagen dargestellt, der ein Plateau von 22 plus oder minus 1,3 Ohm Quadratzentimeter erreicht. Zum Vergleich sind Daten von Blanko-Chips enthalten, die eine marginale Variation und Abweichung von null Ohm Quadratzentimeter im gleichen Zeitraum im Vergleich zur Variation des TEER-Wertes von Chips mit Zellen zeigen. Die Fluoreszenzmikroskopie der gefärbten Zellkerne zeigte eine kontinuierliche Monoschicht des Endothels sowohl auf dem PDMS als auch auf der Membran an der im Einschub angegebenen Stelle.

Die Immunfluoreszenz zeigte das Vorhandensein des Tight-Junction-Proteins zonula occludens eines, das darauf hindeutet, dass BHS-spezifische Tight Junctions zwischen den Zellen den gemessenen TEER erzeugen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Herstellung und Verwendung von Chips mit integrierten Elektroden für TEER-Messungen in Organs-on-Chips haben. Diese Technik kann im Bereich der Blut-Hirn-Schranken-Forschung eingesetzt werden, um die direkte Verabreichung und die Krankheitsmerkmale beispielsweise bei der Alzheimer-Krankheit zu untersuchen.

Nach diesem Verfahren kann die Barrierefunktion von Hirnendothel, differenziert von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, auch für Anwendungen in der personalisierten Medizin überwacht werden.