Name: Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines Organ-on-Chip-Systems mit integrierten Elektroden zur direkten Quantifizierung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER). Diese Methode ermöglicht präzise Barrieremessungen für die Blut-Hirn-Schranke und andere Organsysteme.

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Wir erkennen dankbar Johan Bomer für die Fertigung von Schimmel und Mathijs Bronkhorst für fruchtbare Diskussionen und Hilfe bei der Darstellung der Daten.
Diese Forschung wurde finanziert durch: SRO biomedizinische Abformverfahren der L.I. Segerink, MIRA Institut für biomedizinische Technik und technische Medizin, Universität von Twente; SRO Organe-on-Chips von n. van der Meer, MIRA-Institut für biomedizinische Technik und technische Medizin, Universität von Twente; und VESCEL, ERC Advanced Grant A. van Den Berg (Grant Nr. 669768).

1. Herstellung von der Orgel-on-Chip-Gerät <ol><li>machen ein PDMS-Nachbau einer Form mit den Kanal-Designs, hergestellt mit standard Photolithographie Techniken und erhalten die PDMS Teile der Mikrofluidik-Chip.
	<ol><li>Wiegen ca. 27 g PDMS base Agent und 2,7 g Härtemittel; das Massenverhältnis muss 10:1 sein. Das ist gut für eine 3 mm Dicke PDMS-Platte auf eine Form mit Durchmesser von 130 mm (5 Zoll). Diese Komponenten mischen.</li>
		<li>Entgasen der Mischung in einem Exsikkator für ca. 45 min um Luftblasen zu entfernen.</li>
		<li>Unterdessen PDMS-Flüssigkeitsgemisch durch Kleben durchsichtigem Klebeband um die Form die Form vorbereiten oder legen Sie die Form in einer Halterung geeignet Wafer.</li>
		<li>Den Teig entgast PDMS auf die Form. Wenn keine Luft Luftblasen blieb in der PDMS-Gemisch oder an der Oberfläche Schimmel entgasen es wieder für ca. 30 min.</li>
		<li>Heilen die PDMS-Mischung in einem Ofen bei 60 ° C für 4 Std. abkühlen zulassen.</li>
		<li>In einen Querstrom-Haube, ziehen die ausgehärtete PDMS aus der Form; die Form kann sofort wiederverwendet werden, um mehr PDMS Repliken machen.</li>
		<li>Schneiden das PDMS-Replikat in separate Ober- und Unterteile Chip mit Schnittlinien in der PDMS.</li>
		<li>Schlagen Sie vier Löcher in die oberen Teile mit einem scharfen Biopsie-Punch mit 1 mm Durchmesser, Form ein- und Ausläufe. Schlag von innen nach außen zu verhindern, dass PDMS Schmutz sammeln auf dem Chip. Die Chip Teile mit durchsichtigem Klebeband vor Staub schützen.</li>
		<li>Polycarbonat Membranen aus Transwell Einsätze in Quadrate von ca. 3 × 3 mm schneiden 2.</li>
	</ol></li> <li>Montieren, die eine poröse Membran leckagefrei zwischen zwei PDMS-teilen um ein zwei-Schicht-Gerät montieren eine mit einer porösen Membran Schnittstelle. 
	Hinweis: Dieses Protokoll wird von Griep Et al. angepasst. 19 und Ganea Et Al. 26 <ol><li>bereiten einem PDMS/Toluol-Mörser mit 0,7 g PDMS base Agent, 0,07 g härter und 540 µL Toluol, was zu einem 5:3-Gewichts-Verhältnis. Wirbel der Mörser gründlich.</li>
		<li>Spin-Mantel 200 µL des Mörtels auf ein Glas Deckglas bei 1500 u/min für 60 s (bei 1000 u/min/s hochgefahren), eine dünne, gleichmäßige Schicht von Mörtel zu erwerben.</li>
		<li>Eine dünne Schicht von Mörtel von dem Deckglas auf einem Unterteil und einem Oberteil des Chips mit einem Tintenrolle übertragen. Legen Sie den Unterteil in einem Ofen-Safe.</li>
		<li>Mit einer Pinzette Tauchen Sie die Kanten einer Membran in den Spin-beschichtete Mörtel und legen Sie sie vorsichtig in der Mitte der unteren Teil</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig den oberen Teil auf den Unterteil unter Beachtung der Ausrichtung. 
		Hinweis: Üben Sie keinen Druck auf dem Chip und schieben Sie den oberen Teil nicht über den Unterteil Mörtel vom Betreten der Kanäle und verstopfen die Membran zu verhindern.</li>
		<li>Decken Sie die Chips Buchten mit durchsichtigem Klebeband zu verhindern, dass Staub vom Betreten des Chips und Backen sie bei 60 ° C für 3 h.</li>
	</ol></li> <li>Elektroden in den Seitenarmen integrieren. 
	Hinweis: Dieses Protokoll wird von Griep Et al. angepasst. 19 und weff Et Al. 18 <ol><li>Platindraht in Stücke von ca. 2 cm. sauber durch Untertauchen sie in Aceton für 30 min. Spülen mit Wasser und Ethanol schneiden und trocknen lassen.</li>
		<li>In einen Querstrom-Haube, legte einen Chip auf einer Plastikschale. Legen Sie vier Platindrähte in die Elektrode Kanäle eines Chips mit der Pinzette und biegen sie nach unten auf die Plastikschale Fixierung auf den Teller in einem weiteren Schritt zu ermöglichen. Legen Sie die Drähte 0,7-1 mm in den Kulturkanal, vorbei an der t-förmigen Kanal Kreuzung.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen des UV-härtender Klebstoff an der Elektrode Kanaleingang und lassen Sie den Kleber füllen die Kanäle rund um die Elektrode durch Kapillarkräfte.</li>
		<li>Einschalten UV- und Heilung der Kleber, wenn das Ende des Kanals Elektrode erreicht. 
		Vorsicht: Sehen Sie nicht in der UV-Lichtquelle, wie dies die Augen schädigen kann.</li>
		<li>Fixieren die vier integrierten Elektroden an der Plastikschale mit einem Zweikomponenten-Epoxy-Kleber. Dies ermöglicht einfachere Handhabung der Elektroden während der Messung ohne das Risiko des Ziehens der Elektroden vom Chip.</li>
		<li>Die Chips mit durchsichtigem Klebeband abdecken und bei 60 ° C für 2 h zulassen abkühlen lassen und bis zur Verwendung aufbewahren staubfrei zu backen. Auf diese Weise können sie sicher gelagert für bis zu einem Monat.</li>
	</ol></li></ol> 2. Kultur des Gehirns abgeleitet Endothelzellen auf dem Chip <ol><li>beschichten die Chips um Zellhaftung zu fördern.
	<ol><li>Füllen beide Kanäle mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis sie nass vor der Einführung von Reagenzien. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, gibt es keine Luftblasen in den Kanälen. Wenn ja, entfernen Sie sie durch Spülen mit zusätzlichen PBS.</li>
		<li>Füllen Sie beide Kanäle mit 30 µL 20 µg/mL menschlichen Fibronektin in PBS. 3 Stunden bei 37 ° C inkubieren. Auf Luftblasen überprüfen und bei Bedarf Spülen der Kanäle mit PBS und Nachfüllen mit Fibronektin Lösung.</li>
		<li>Spülen Sie die Chips mit endothelialen Wachstumsmedium und inkubieren sie bei 37 ° C und 5 % CO 2 im Brutkasten für 2 h.</li>
		<li>Messen den TEER der leeren Chips, wie in Schritt 3, um sicherzustellen, dass alle Elektroden in direktem Kontakt mit Flüssigkeit in den Kanälen sind beschrieben. In leeren Chips, typische TEER Werte sind 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>Samen Zellen in den oberen Kanal.
	<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus einem Kultur-Flasche (75 cm 2 Kulturkreis) mit eine konfluierende Monolage von menschlichen zerebralen mikrovaskuläre Endothelzellen (hCMEC/D3).</li>
		<li>Waschen der Zellen mit PBS. 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 2-5 Minuten, bis die Zellen aus der Kultur-Flasche getrennt haben.</li>
		<li>Deaktivieren die Trypsin mit Kulturmedium mit 20 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt. Zählen der Zellen und die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension rechnen.</li>
		<li>Unterdessen die hCMEC/D3 Zellen bei 390 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand entfernen.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in das entsprechende Volumen der endothelialen Wachstumsmedium (EGM-2) in einer Konzentration von 5 x 10 6 Zellen/mL zu kommen. Dies führt zu einer Aussaatdichte von 2 x 10 5 Zellen/cm 2 im Chip.</li>
		<li>Langsam 30 µL die gut gemischte Zellsuspension in den oberen Kanal pipette und entfernen Sie die Pipette vom Einlass in einer fließenden Bewegung während noch Druckmittel.</li>
		<li>Überprüfen die Aussaatdichte unter dem Mikroskop. Eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den oberen Kanal erreicht werden sollte.</li>
		<li>Die Chips bei 37 ° C und 5 % CO 2 für mindestens 1 Stunde Sie alle fraktionslosen Zellen mit Endothelzellen Kulturmedium spülen inkubieren.</li>
	</ol></li> <li>Pflegen die Endothelzellen auf dem Chip.
	<ol><li>Zweimal pro Tag einsetzen Nährmedium gefüllten Pipettenspitzen als Reservoir in den Zuläufen und das Medium im Chip durch Schwerkraft angetrieben fließen. 
		Hinweis: Zur Vermeidung von Luftblasen in den Mikrokanälen und zerstören die Zellschicht stellen Sie sicher, flüssig-flüssig Kontakt zwischen der Pipettenspitze und die Flüssigkeit auf den Chip zu machen, vor dem Einlegen der Spitze in einer Bucht. Dies kann erleichtert werden, indem man einen kleinen Tropfen auf die in / Steckdose vor Pipette einsetzen.</li>
		<li>Auch hinzufügen Pipette Tipp Stauseen in den Verkaufsstellen, die Kanäle vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Brüten die Chips bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	</ol></li></ol> 3. TEER-Messungen auf dem Chip <ol><li>th einrichtene TEER Messung Apparat, bestehend aus einem Lock-in-Verstärker und eine Sonde Kabel Schaltung in Van der Helm Et al. angegeben wurde. 16 Alternativ Forschung oder Impedanz Analysatoren eignen sich auch für diese Impedanz-basierte TEER Messungen.</li>
	<li>Den Chip aus dem Inkubator nehmen und lassen Sie es auf Zimmertemperatur mindestens 10 min. entfernen Flüssigkeit aus der Plastikschale um die Elektroden zu verhindern, dass Elektrode Überbrückung außerhalb des Chips kommen.</li>
	<li>Nehmen die Impedanz-Spektrum von 200 Hz bis 1 MHz für jede Kombination von zwei Elektroden in 6 Impedanz Spektren pro Chip in nur 5-10 min. Check was, wenn die Impedanz-Spektren haben die erwarteten Größen und Formen, die TEER-Messung, wie zu validieren beschrieben im Abschnitt Ergebnisse.</li>
	<li>Setzen den Chip zurück in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO 2 nach Beendigung der Mess.</li>
	<li>Verarbeiten die erhaltenen Impedanz Spektren um einen normalisierten TEER-Wert zu erreichen.
	<ol><li>Get der gemessene Widerstand <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> zwischen Elektroden <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> und <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, wie in Abbildung 2 b und D, von der resistiven Hochebene bei 10 kHz in den entsprechenden Impedanz Spektren bezeichnet.</li>
		<li>Berechnen den TEER mit sechs gemessenen Widerstände entspricht einem Chip gleichzeitig zeigen Sie mithilfe der Gleichung von Abbildung 2- 16: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> in dieser Gleichung, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg"> ist der Kultur-Bereich, wodurch der Widerstand gemessen wurde, &lt; Img Alt = " Gleichung 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt; ist der Widerstand des zellulären Barriere und die Membran, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> und <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg"> sind der Widerstand Messwerte durch die zelluläre Barriere und <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> und <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> sind die Widerstandswerte gemessen der gerade Kanäle. 16 die Gleichung ergibt sich aus dem Ersatzschaltbild dargestellt in Abbildung 2.</li>
	</ol></li> <li>Subtrahieren die leere TEER aus dem TEER zu allen Zeitpunkten, die Entwicklung der TEER rechtzeitig zu erhalten.</li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Manuskript wurden das Engineering von einem Organ-on-Chip-Gerät und die direkte Bestimmung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER) einer zellulären Barriere im Gerät kultiviert vorgestellt. Die vorgestellte Methode der Integration von Elektroden ohne Reinraum Equipment und die direkte TEER-Bestimmung mit vier Elektroden gilt für jedes Organ-on-Chip-Gerät mit zwei mikrofluidischen Fächern. Die Chip-Layout und die Geometrie können an die Anforderungen der anvisierten Experimente angepasst werden, solange die vier Elektroden in zwei Kammern getrennt sind. Die vier Elektroden können auch bequem in die Buchten von vorhandenen Chips eingefügt werden, vorausgesetzt, dass sie für die Dauer von sechs Messungen an Stelle fixiert werden. Leckagefreie Bonding-Methode kann für verschiedene Membranen und Kanal Geometrien durch Ändern der PDMS/Toluol-Verhältnis optimiert werden. Ein höherer Toluol Gehalt führt zu einer dünneren Spin-beschichtete Schicht von Mörtel26 und möglicherweise besser geeignet für flacher und schmaler Kanäle in der PDMS-teilen. Eine niedrigere Toluol Inhalte führt ein dicker Mörtel Schicht26 und möglicherweise besser geeignet, um dickere Membranen zwischen den Teilen PDMS umschließen.
Wie in der schematischen Impedanz Spektren in Abbildung 2A und der experimentellen Spektren in Abbildung 2E und 2Fersichtlich ist, sind die double-Layer-Kapazität an der Elektrode-Medium-Schnittstelle die Impedanz Messungen beeinflusst. Aufgrund der geringen Größe der Elektroden in den Mikrokanälen kann die double-Layer-Kapazität über die resistive Plateau der zellulären Barriere in Impedanz Spektren, Quantifizierung der TEER zu verkomplizieren dominieren. Um dies zu überwinden, die Elektroden eingesetzt werden weiter in die Kultur-Kanäle vor Fixierung. Dadurch erhöht sich die Fläche der Elektrode ausgesetzt auf dem Kulturmedium und damit steigen die double-Layer-Kapazität auch. Dadurch eine Verschiebung der kapazitiven Neigung zu niedrigeren Frequenzen, so dass die resistive Plateau der zellulären Barriere leichter erkannt und quantifiziert werden kann. Obwohl der Widerstand der gemessenen Strecke zwischen zwei Elektroden kleiner werden wird, beeinflusst dies nicht die TEER-Quantifizierung nach der vorgestellten Methode.
Während der Messung durch die zelluläre Schranke, ist es möglich, dass zusätzliche ohmsche Plateau nicht erkannt werden. Dies ist das Ergebnis einer fluidische Verbindung zwischen den beiden Kanälen, z. B. wenn die Membran führt zu einem gemessenen Weg um den zellulären Barriere schlecht durch den Mörtel eingeschlossen ist. Darüber hinaus können elektrische Überbrückung außerhalb des Chips, wenn die Elektroden durch einen Tropfen Kulturmedium verbunden sind. Dies ist in der Regel kombiniert mit einer niedrigeren gemessenen Impedanz und kann durch das Entfernen dieser Brücke Kulturmedium gelöst werden. Schließlich, wenn es kein resistiven Plateau und die gemessenen Impedanz ist um Größenordnungen höher als erwartet, möglicherweise eine lose Verbindung in die elektrischen Leitungen oder an der Stromquelle.
In Zukunft kann die physiologische Bedeutung der aktuellen BBB-on-Chip erhöht werden, indem man die Endothelzellen um Stress bei der physiologischen Ebenen, Scheren, wird berichtet, dass BBB Differenzierung und Erhöhung der Barrier Dichtigkeit zu fördern und ist schwer zu erreichen in konventionellen in-vitro- Modelle. 29 darüber hinaus bietet der unteren Kanal des vorgestellten Geräts eine geeignete Fach für das Gehirn-abgeleitete Zellen zusammen mit dem Endothel kultiviert werden. Dies wird voraussichtlich auch die Barrierefunktion zu erhöhen und auch ermöglicht die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen zwischen relevante Zelltypen unter pathologischen Bedingungen. 29
Abschließend das Orgel-on-Chip-Gerät in dieser Publikation beschriebenen kann mit standard-Labor-Ausrüstung hergestellt werden und erweist sich bieten direkte TEER-Messungen mit vier integrierten Elektroden, die visuelle Inspektion der untersuchten Zelle nicht behindern Schicht. Die Anwendbarkeit dieses Gerätes im Feld Organe-on-Chips zeigte sich durch Nachahmung der BBB in dieser Chip und Überwachung der TEER während der Kultur. Eine Vielzahl von anderen Organen (Barriere) kann auch andere relevante Zelltypen in diesem Chip nachgeahmt werden. Darüber hinaus kann die Methode zur Messung von TEER leicht angewendet werden, im anderen zwei Fach-basierte Orgel-on-Chip-Geräte, reproduzierbare und aussagekräftige TEER-Werte zu erreichen, die für Geräte und Systeme verglichen werden kann.

Organe-on-Chips sind schnell entwickelt sich eine neue und vielversprechende Klasse von in-vitro- Gewebemodelle. 1 in diesen Modellen sind Zellen in mikrofluidischen Geräten kultiviert, die so konstruiert sind, dass sie die physiologische Mikroumgebung dieser Zellen zu imitieren. 1 , 2 das Ergebnis realistischer physiologische oder pathologische Verhalten dieser Zellen als von konventionellen in-vitro- Modelle von schlichtem Design und grundlegende Funktion erwartet werden kann. 3 , 5 , 6 zusätzlich Organe-on-Chips bieten eine besser steuerbare Umgebung als in Vivo Modelle und gesundem und krankem Gewebe aus menschlichen Ursprungs, treu zu replizieren, menschliche Physiologie und Pathologie zu integrieren. Die kürzlich zusammengefasste Fortschritte in der Entwicklung von Blut – Hirn Barrieren auf Chips (BBBs-on-Chips) zeigen, dass das Feld nach vorne schnell bewegt. 7
Ein weiterer Vorteil der Organe-on-Chips ist, dass sie ermöglichen, in Echtzeit und kontinuierliche Überwachung des Gewebes im Inneren des Gerätes durch Mikroskopie, Online-biochemische Analysen und integrierten Sensoren kultiviert. 1 , 2 Messung Transendothelial oder berührt elektrischen Widerstands (TEER) beispielsweise ist eine leistungsfähige Methode für die Entwicklung nicht-invasiv zu überwachen und die Störung der Barriere-bildenden Gewebe. 8 , 9 , 10 TEER ist der elektrische Widerstand durch eine zelluläre-Schranke und ist deshalb bezeichnend für die Barriereintegrität und Durchlässigkeit. 10 Organe-on-Chips sind zelluläre Barrieren in der Regel auf eine Membran kultiviert, die zwei fluidische Kanäle, Vertretung der apikalen und basolateralen Fächer des Gewebes Barriere trennt. Diese Chips können TEER Messungen bequem mit Elektroden, die in der ein- und Ausgänge der beiden Kanäle eingefügt durchgeführt werden. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 können jedoch manuell einfügen und Wiedereinfügung der Elektroden leicht Platzierung Fehler und damit Schwankungen in der gemessene Widerstand wie z.B. die Unterschiede im Widerstand der längere oder kürzere Wege durch Mikrokanäle führen sind wesentliche Barriere Zellresistenz im Vergleich zu. 16 um Wiedereingliederung Fehler zu beseitigen, sind Geräte mit integrierten Elektroden vorgeschlagen worden. Doch die meisten von diesen integrierten Elektroden blockieren die Ansicht bei der Inspektion der Gewebekultur17,18,19,20,21 und/oder erfordern spezielle Reinraum-Prozesse für die Herstellung. 17 , 22
In dieser Publikation, zunächst in einer früheren Publikation,16 beschriebenen Orgel-on-Chip-Gerät vereint die Stabilität der integrierten Elektroden mit Sicht auf die gemessenen Zellschicht und einfache Herstellung. Die Konstruktion und Herstellung von diesem Chip ist in Abbildung 1dargestellt. Kurzum: dieses Gerät besteht aus zwei Polydimethylsiloxan (PDMS) Teile mit Kanal-Abdrücke, die miteinander verklebt sind leckagefrei mit einem Polycarbonat-Membran mit 0,4 µm Poren dazwischen. Vier Platindraht Elektroden sind eingelegt und fixiert in Stelle mit einem lichthärtenden Klebstoff gut außerhalb der Kulturkreis. Alle diese Fertigungsschritte kann mit Allgemeine Laborgeräte, ohne die Notwendigkeit für einen Reinraum durchgeführt werden. Darüber hinaus können sechs Impedanz Messungen erfolgen mit diesen vier Elektroden, wodurch direkte Isolierung von der gemessenen TEER, unabhängig von den Widerstand der Mikrokanäle der Querschnitt im Vorfeld und minimiert so den Einfluss der nicht-biologischen Schwankungen im System wie z. B. (wieder-) Aufnahme Fehler. 16
Der Anwendbarkeit dieses Gerät und die direkte TEER-Messungen zeigen die Blut - Hirn-Schranke (BBB) in dieser Chip repliziert wurde. Dieser biologische Barriere besteht aus spezialisierten Endothelzellen und regelt Verkehr zwischen Blut und Gehirn zu Gehirn Homöostase. 23 , 24 um die BBB zu imitieren, wurde der obere Kanal des Gerätes mikrofluidischen mit menschlichen zerebralen mikrovaskuläre Endothelzellen aus der hCMEC/D3 Zelllinie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P.-O. ausgekleidet Couraud, INSERM, Paris, Frankreich). 25 die vorgestellte Methode ist, aber ganz allgemein gilt für jedes Organ-on-Chip-Gerät mit zwei Fächern, ermöglicht direkte TEER-Bestimmung mit leicht integriert Elektroden.
In diesem Manuskript wird zuerst der Fertigungsprozess von der Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden beschrieben. Nächsten Aussaat Verfahren und der Kultur der Gehirn endothelial Zellen im Inneren des Gerätes erläutert, sowie die auf dem Chip-TEER-Messungen. Im Abschnitt "Ergebnisse" repräsentative TEER Messungen gezeigt und Datenverarbeitung ist geklärt. Zu guter Letzt wird die Barrierefunktion der BBB-on-Chip, überwacht während 3 Tagen präsentiert, zeigt die Anwendbarkeit der vorgestellten Geräte und Methoden zur Überwachung von TEER.

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS) Ausgangs- und Härter: Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopsiestanze, 1,0 mm</td><td>Durchmesser Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membran, 0,4 &; Mikro; m Porengröße</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Schnitt aus Transwell-Kultureinsätzen</td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht, 200 & Mikro; m Durchmesser</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>UV-härtender Klebstoff: Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Epoxid-Klebstoff: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3-Zellen</td><td></td><td></td><td>Menschliche zerebrale mikrovaskuläre Endothelzelllinie, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. P.-O. Couraud, INSERM, Paris, Frankreich</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin im menschlichen Plasma, 20 & micro; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Endotheliales Wachstumsmedium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Endotheliales Basalmedium-2 (EBM-2) ergänzt mit EGM-2 SingleQuots</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven Binder</td><td></td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtquelle, 365 nm für 5 s bei 350 mW/cm2</td><td>Im eigenen Haus</td><td></td> <td>hergestellt</td></tr><tr><td>Zentrifuge: Allegra X-12R Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Binder</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense Lock-in-Verstärker</td><td></td><td>mit Sondenkabelschaltung, spezialisiert für On-Chip-TEER-Messungen</td></tr></tbody></table>

herstellung und validierung von einer orgel-on-chip-system mit integrierten elektroden, direkt transendothelial elektrischen widerstand zu quantifizieren

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organe-on-Chips, in-vitro- Modelle mit der Kultur des (menschlichen) Gewebe in mikrofluidischen Geräten, sind schnell Schwellen- und versprechen, bieten nützliche Forschung Werkzeuge für die menschliche Gesundheit und Krankheit zu studieren. Um die Barrierefunktion der Zellschichten kultiviert im Inneren Organ-on-Chip-Geräte zu charakterisieren, wird oft Transendothelial oder Ttransepitelialen elektrischer Widerstand (TEER) gemessen. Zu diesem Zweck werden Elektroden in der Regel durch Mikromaterialbearbeitung Methoden für stabilere Messungen als manuelles Einfügen von Elektroden in die Buchten von der Chip erreicht wird in den Chip integriert. Aber diese Elektroden häufig behindern Sichtprüfung der untersuchten Zelle Schicht oder erfordern teure Reinraum Prozesse für die Herstellung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, enthält die hier beschriebene Geräte vier leicht integrierte Elektroden, die platziert und fixiert außerhalb den Kultur-Bereich, indem visuelle Inspektion möglich. Verwenden diese vier Elektroden, die der Widerstand der sechs Messstrecken quantifiziert werden kann, von dem kann der TEER direkt, unabhängig von den Widerstand der Nährmedium gefüllten Mikrokanäle isoliert werden. Die Blut - Hirn-Schranke wurde in diesem Gerät repliziert und seine TEER wurde überwacht, um die Anwendbarkeit des Geräts zeigen. Dieser Chip, den integrierten Elektroden und die TEER-Bestimmung-Methode gelten in der Regel in Organe-on-Chips, um andere Organe zu imitieren oder bestehende Orgel-on-Chip-Systeme integriert werden.

Die schematische Ergebnisse der elektrischen Impedanz Spektroskopie durch einen Chip ohne Zellen (durchgezogene Linie) und durch eine zelluläre Barriere (gestrichelte Linie) sind in Abbildung 2Adargestellt. Vier Hauptregionen identifiziert werden können, jeweils eine bestimmte elektrische Komponente dominiert. Unterhalb von etwa 1 kHz dominiert die double-Layer-Kapazität an der Elektrode-Kultur mittlere Schnittstelle, zeichnet sich durch eine negative Neigung für Impedanz Größe und eine Annäherung an-90 ° Phasenverschiebung. Die Frequenz, bei dem die double-Layer-Kapazität dominiert, hängt von der Elektrodenfläche Kulturmedium ausgesetzt. Die resistive Plateau oberhalb 1kHz (ohne Zellen) oder 100 kHz (mit Zellen) mit einer Phasenverschiebung in der Nähe von 0°, entspricht der Widerstand des Kulturmediums innen mikrofluidische Kanäle, je nach Kanal Länge und Querschnittsfläche und Innenseite der Membran, je nach der Porosität und der Dicke. Bei der Messung durch eine zelluläre Barriere ist ein zusätzliche ohmsche Plateau zwischen 1 und 10 kHz sowie ein lokales Maximum in das Phasendiagramm gesehen. Diese Region ist von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung der TEER als einen deutlichen Anstieg der Impedanz Ergebnisse, wenn Zellen befinden sich in den gemessenen Weg und ist daher die "Region von Interesse" genannt. Die zusätzliche Neigung zwischen 10 und 100 kHz entspricht der Zelle Barriere Kapazität, das ergibt sich aus der elektrisch isolierenden Lipid Bilayer Membranen und ist abhängig von der Gesamtfläche von der Zellschicht. 27 die Grenzen dieser Regionen sowie die Impedanz-Größen hängt das System untersucht und ändern mit, unter anderem, Kanal Abmessungen, Kulturmedium Leitfähigkeit, Elektrodenposition und Zelltyp. Zur weiteren Lektüre über die Theorie und Praxis der elektrischen Impedanz Spektroskopie auf Barriere-bildenden Gewebe der Übersichtsartikel von Benson Et Al. wird empfohlen. 28
Repräsentative Daten der TEER Messungen zeigt einen leeren Chip und einen Chip mit einer hCMEC/D3 Gehirn endotheliale Zellschicht in Abbildung 2E und 2F. Kurzum, Impedanz Spektroskopie erfolgte mittels sechs Messungen mit vier Elektroden: zwei Messungen durch Zelle Kulturmedium gefüllte Kanäle (durchgezogene Linien) und vier Messungen durch die Kanäle sowie die Membran und - falls vorhanden - die zelluläre Barriere (gestrichelte Linien). Diese sechs Messstrecken erkennbar in die resistive Ersatzschaltbild der Abb. 2 b, die schematische Querschnitt (Abbildung 2) und Draufsicht (Abb. 2D) abgeleitet ist. Die leeren Chip Messungen (Abb. 2E) zeigen die typische Form der Impedanz Spektren ohne Zellen, wie in Abbildung 2Adargestellt. Die Messungen durch die zelluläre Schranke (gestrichelte Linien in Abbildung 2F) ähneln die typischen Impedanz-Spektren mit Zellen in Abbildung 2A. Beachten Sie, dass die Impedanz-Betrag und die Phase Anstieg Shift in Richtung 1 MHz. Dies ist die typische Reaktion des Messaufbaus bei hohen Frequenzen und nicht experimentellen Ursprungs.
Um den TEER mit diesen experimentellen Impedanz Spektren zu ermitteln, wird zuerst der gemessenen Chip Widerstand bestimmt, ist der Gesamtwiderstand der Zellschicht, Kanäle und Membran. Zu diesem Zweck eine geeignete Anzeige Frequenz in der Region von Interesse gewählt wurde, ist das lokale Maximum in der Phase Handlung mit Zellen und in der Nähe von 0° Phasenverschiebung ohne Zellen: 10 kHz. Mit den sechs gemessenen Widerstände bei 10 kHz gemessen zwischen den vier Elektroden, die TEER direkt errechnet sich unter Verwendung der Gleichung in Abbildung 2F.
Um zu zeigen, dass das vorgestellte Gerät zur Bestimmung von TEER in Organe-on-Chips geeignet ist, wurde die BBB im Chip repliziert und seine TEER war während der 3 Tage der Kultur überwacht. In Abbildung 3A ist der durchschnittliche TEER ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) für vier BBBs-on-Chips, dargestellt auf einer Hochebene von 22 ± 1,3 Ω cm2, was ist vergleichbar mit dem TEER Diese Zelllinie wie in der Literatur berichtet. 29 darüber hinaus nach Beendigung des Experiments und Fluoreszenz Färbung der Kerne, ist ersichtlich, dass das Gehirn Endothel eine kontinuierliche Monolage im Inneren des Gerätes (Abb. 3 b) gebildet. Immunfluoreszenz-Färbung der tight Junction Proteins Zonula Occludens-1 (ZO-1) zeigte, dass die Gehirn endothelial Zellen ihre BBB-spezifischen Phänotyp erhalten und engen Knoten komplexe gebildet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Planung und Montage von der Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden. 
(A) Explosionszeichnung der Mikrofluidik-Chip, bestehend aus einem PDMS-Oberteil mit Top-Channel (TC), einer Membran (M) und einer unteren PDMS Teil mit dem unteren Kanal (BC). Vier Platindraht Elektroden (E1-4) sind eingelegt und fixiert in den Seitenarmen. In den oberen Kanal und auf die Membran wurden hCMEC/D3 Gehirn endothelial Zellen kultiviert, um die BBB zu replizieren. (B) montiert-Chip an einer Plastikschale befestigt. Nachgedruckt und angepasst mit Genehmigung von Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Repräsentative Impedanz Daten und Bestimmung der TEER. 
(A) schematische Impedanz Spektrum zeigt Impedanz Größe (Ω) und Phasenverschiebung (°) versus Frequenz (Hz), typisch für elektrische Impedanz Spektroskopie auf Chips ohne Zellen (durchgezogene Linie) und mit Zellen (gestrichelte Linie). Es gibt vier Hauptregionen, jeweils dominiert: die double-Layer-Kapazität an die Elektroden, der Kulturmedium Widerstand, die Zellresistenz Barriere und die Zellmembran-Kapazität. Die "Region des Interesses" zeigt an, wo der Beitrag der Zellschicht quantifizierten (roter Pfeil) sein kann. (B) resistiven Ersatzschaltbild des Chips, zeigt die Top-Channel Widerstände R1 und R3, den unteren Kanal Widerstände R2 und R4 und Membran und EC Barriere Widerstand Rm. (C) schematischer Querschnitt zeigt die Endothelzellen (EG) in den oberen Kanal kultiviert. (D) schematische Draufsicht der BBB chip zeigt die Konfiguration der Elektroden und dem Kulturkreis von 0,25 mm2 , durch welche die Impedanz gemessen wird. (E) repräsentative Impedanz Spektren eines leeren Chips gefüllt mit Zellkulturmedium. (F) repräsentative Impedanz Spektren eines Chips in welche hCMEC/D3 Gehirn endotheliale Zellen waren Kultur für 3 Tage. (G) Formel zur Berechnung von TEER aus den gemessenen Widerstände zwischen allen sechs Kombinationen der vier Elektroden. Nachgedruckt und angepasst mit Genehmigung von Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere vers</a>Ion dieser Figur.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Repräsentative TEER Entwicklung der BBB-on-Chip. 
(A) durchschnittliche TEER ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) von vier BBBs-on-Chips in einem Kultur-Zeitraum von drei Tagen, eine Hochebene am 22 ± 1,3 Ω cm2 (durchschnittliche ± SEM) zu erreichen. Zum Vergleich: Daten von leeren Chips enthalten ist, zeigt marginale Unterschiede und Abweichungen von 0 Ω cm2 im gleichen Zeitraum im Vergleich zu der Variation und TEER Wert der Chips mit Zellen. (B) Fluoreszenz-Mikroskopie von gefärbten Kernen enthüllt eine kontinuierliche Monolage von Endothel, sowohl auf PDMS und die Membran an der Stelle im Einschub angegeben. (C) Immunfluoreszenz ergab das Vorhandensein von tight Junction Protein Zonula Occludens-1, darauf hinweist, dass die gemessenen TEER BBB-spezifische enge Verbindungen zwischen den Zellen entstehen. Nachgedruckt und angepasst mit Genehmigung von Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

Diese Publikation beschreibt die Herstellung von einer Orgel-on-Chip-Gerät mit integrierten Elektroden für die direkte Quantifizierung der Transendothelial elektrischen Widerstand (TEER). Für die Validierung die Blut - Hirn-Schranke wurde innerhalb dieses Gerät mikrofluidischen nachgeahmt und seiner Barrierefunktion wurde überwacht. Die vorgestellten Methoden zur Elektrode Integration und direkte Quantifizierung der TEER sind allgemein anwendbar.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu zeigen, wie mikrofluidische Chips mit integrierten Elektroden für transendotheliale oder transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen oder TEER-Messungen hergestellt und verwendet werden. Demonstriert wird dies anhand einer Blut-Hirn-Schranke im mikrofluidischen Chip. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Organs-on-Chips zu beantworten, indem sie die direkte Messung der Barrierefunktion von beispielsweise Blut-Hirn-Schrankengewebe mit integrierten Elektroden ermöglicht.Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass Elektroden leicht in Organ-on-Chip-Systeme integriert werden können und dass die Ergebnisse zwischen den verschiedenen Systemen verglichen werden können. Die Auswirkungen dieser Technologie erstrecken sich auf das Verständnis der Blut-Hirn-Schrankenfunktion in Gesundheit und Krankheit, die Arzneimittelforschung und die personalisierte Medizin. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Funktion der Blut-Hirn-Schranke zu erhalten, kann sie auch im Zusammenhang mit anderen Organ-on-Chip-Systemen wie dem Lung-on-Chip und dem Gut-on-Chip verwendet werden.Um diesen Vorgang zu beginnen, mischen Sie 27 Gramm PDMS-Basismittel und 2,7 Gramm Härtungsmittel gründlich. Entgasen Sie dann das Gemisch ca. 45 Minuten lang in einem Exsikator, um Luftblasen zu entfernen. Bereiten Sie in der Zwischenzeit die Form für die flüssige PDMS-Mischung vor, indem Sie durchsichtiges Klebeband um die Form kleben oder die Form in einen geeigneten Waferhalter legen.Gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung in die Form. Anschließend die PDMS-Mischung im Backofen bei 60 Grad Celsius vier Stunden lang aushärten und anschließend abkühlen lassen. Ziehen Sie in einer Kreuzstromhaube das ausgehärtete PDMS aus der Form.Schneiden Sie die PDMS-Replik mithilfe von Schnittlinien im PDMS in separate obere und untere Spanteile. Stanzen Sie anschließend mit einem scharfen Biopsiestempel mit einem Millimeterdurchmesser vier Löcher in die oberen Teile, um Ein- und Auslässe zu bilden. Stanzen Sie von innen nach außen, um zu verhindern, dass sich PDMS-Schmutz im Chip ansammelt.Decken Sie dann die Chipteile mit durchsichtigem Klebeband ab, um sie vor Staub zu schützen. Schneiden Sie anschließend die Polycarbonat-Membranen aus Transwell-Einsätzen in Quadrate von etwa drei mal drei Quadratmillimetern. Montieren Sie danach eine poröse Membran leckagefrei zwischen zwei PDMS-Teilen, um ein zweischichtiges Gerät zusammenzubauen, das mit einer porösen Membran verbunden ist.Bereiten Sie dazu einen PDMS-Toluol-Mörtel mit 0,7 Gramm PDMS-Basismittel, 07 Gramm Härter und 540 Mikrolitern Toluol vor. Den Mörtel gründlich vortexen und dann 200 Mikroliter Mörtel bei 1500 U/min 60 Sekunden lang auf ein Glasdeckglas schleudern, um eine dünne, gleichmäßige Mörtelschicht zu erhalten. Übertragen Sie anschließend mit einer Farbwalze eine dünne Schicht Mörtel vom Deckglas auf den unteren Teil des Chips.Legen Sie den unteren Teil in eine ofenfeste Form und geben Sie dann den Mörser auf den oberen Teil des Chips. Tauchen Sie mit einer Pinzette die Ränder einer Membran in den Schleudermörtel und platzieren Sie sie vorsichtig in der Mitte des unteren Teils. Platzieren Sie anschließend das Oberteil vorsichtig auf dem Unterteil und achten Sie dabei auf die Ausrichtung.Decken Sie die Chipseinlässe mit durchsichtigem Klebeband ab, um das Eindringen von Staub in die Chips zu verhindern, und backen Sie sie drei Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Vorsicht ist in diesem Schritt sehr wichtig. Üben Sie keinen Druck auf den Span aus und schieben Sie das Oberteil nicht über das Unterteil, um zu verhindern, dass Mörtel in die Kanäle eindringt und die Membran verstopft.Um Elektroden in die Seitenkanäle zu integrieren, schneidet man einen Platindraht in zwei Zentimeter lange Stücke. Tauchen Sie sie anschließend 30 Minuten lang in Aceton. Spülen Sie sie dann mit Wasser und Ethanol ab und lassen Sie sie trocknen.Legen Sie in einer Kreuzstromhaube einen Chip auf eine Kunststoffschale. Führen Sie vier Platindrähte mit einer Pinzette in die Elektrodenkanäle des Chips ein und biegen Sie sie auf die Kunststoffschale, um im nächsten Schritt eine Fixierung an der Schale zu ermöglichen. Führen Sie die Drähte von 0,7 bis 1 Millimeter in den Kulturkanal über die T-förmige Kanalverbindung hinaus ein.Tragen Sie anschließend einen Tropfen UV-härtenden Kleber am Elektrodenkanaleingang auf und lassen Sie den Kleber durch Kapillarkräfte den Kanal füllen. Schalten Sie dann das UV ein und härten Sie den Kleber aus, wenn er das Ende des Elektrodenkanals erreicht. Fixieren Sie die vier integrierten Elektroden mit einem Zweikomponenten-Epoxidkleber an der Kunststoffschale.Anschließend die Chips mit klarem Klebeband abdecken und bei 60 Grad Celsius zwei Stunden backen. Abkühlen lassen und bis zur Verwendung staubfrei lagern. Um die Chips so zu beschichten, dass sie die Zelladhäsion fördern, füllen Sie zuerst beide Kanäle mit PBS, bevor Sie Reagenzien einführen.Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich Luftblasen in den Kanälen befinden. Wenn ja, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit zusätzlichem PBS spülen. Füllen Sie anschließend beide Kanäle mit 30 Mikrolitern 20 Mikrogramm pro Milliliter humanem Fibronektin in PBS.Inkubieren Sie sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie dann die Chips mit endothelialem Wachstumsmedium und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Messen Sie anschließend die TEER der Rohlingspäne, um sicherzustellen, dass alle Elektroden in direktem Kontakt mit der Flüssigkeit in den Kanälen stehen.Nehmen Sie dazu einen Chip aus dem Inkubator und lassen Sie ihn mindestens zehn Minuten lang Raumtemperatur erreichen. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten aus der Kunststoffschale um die Elektroden, um Elektrobrückenbildung außerhalb des Chips zu verhindern. Nehmen Sie als nächstes das Impedanzspektrum von 200 Hertz bis zu einem Megahertz für jede Kombination von zwei Elektroden, was in fünf bis zehn Minuten sechs Impedanzspektren pro Chip ergibt, aus denen der TEER direkt bestimmt werden kann.Überprüfen Sie, ob die Impedanzspektren die erwarteten Größen und Formen aufweisen, um die TEER-Messung zu validieren. Bereiten Sie nun eine Zellsuspension vor, die in den oberen Kanal eingesetzt wird, indem Sie das Kulturmedium aus einem Kulturkolben mit einer konfluenten Monoschicht aus hcMEC/D3-Zellen entfernen. Waschen Sie danach die Zellen mit PBS.Entfernen Sie das PBS, fügen Sie dann zwei Milliliter 05-prozentiges Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie zwei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen vom Kulturkolben gelöst haben. Deaktivieren Sie dann das Trypsin mit Nährmedium, das mit 20 Prozent FBS angereichert ist. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie ihre Gesamtanzahl in Suspension.In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die hcMEC/D3-Zellen fünf Minuten lang bei 390 mal g. Entfernen Sie anschließend den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet erneut in dem entsprechenden Volumen des endothelialen Wachstumsmediums, um eine Konzentration von fünf Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten, was einer Aussaatdichte von 200 Tausend Zellen pro Quadratzentimeter im Chip entspricht. Pipettieren Sie anschließend langsam 30 Mikroliter der gut gemischten Zellsuspension in den oberen Kanal und entfernen Sie die Pipette in einer fließenden Bewegung aus dem Einlass, während Sie immer noch Druck ausüben.Überprüfen Sie die Saatdichte unter dem Mikroskop. Es sollte eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im oberen Kanal erreicht werden. Anschließend werden die Chips bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid mindestens eine Stunde lang inkubiert.Spülen Sie anschließend alle nicht anhaftenden Zellen mit Endothelkulturmedium aus. Denken Sie daran, dass TEER während des Kulturzeitraums überwacht wird. Dies ist das typische schematische Impedanzspektrum, das die Impedanzgröße und die Phasenverschiebung gegen die Frequenz für die elektrische Impedanzspektroskopie auf Chips ohne Zellen und mit Zellen zeigt.Es gibt vier Hauptbereiche, die von der Doppelschichtkapazität an den Elektroden, dem Nährmediumwiderstand, dem Zellbarrierewiderstand oder der Zellmembrankapazität dominiert werden. Die Region of Interest gibt an, wo der Beitrag der Zellschicht quantifiziert werden kann. Und das ist die Formel, um TEER aus den gemessenen Widerständen zwischen allen sechs Kombinationen von vier Elektroden zu berechnen.Hier ist der durchschnittliche TEER von vier BBBs auf Chips während des Kulturzeitraums von drei Tagen dargestellt, der ein Plateau von 22 plus oder minus 1,3 Ohm Quadratzentimeter erreicht. Zum Vergleich sind Daten von Blanko-Chips enthalten, die eine marginale Variation und Abweichung von null Ohm Quadratzentimeter im gleichen Zeitraum im Vergleich zur Variation des TEER-Wertes von Chips mit Zellen zeigen. Die Fluoreszenzmikroskopie der gefärbten Zellkerne zeigte eine kontinuierliche Monoschicht des Endothels sowohl auf dem PDMS als auch auf der Membran an der im Einschub angegebenen Stelle.Die Immunfluoreszenz zeigte das Vorhandensein des Tight-Junction-Proteins zonula occludens eines, das darauf hindeutet, dass BHS-spezifische Tight Junctions zwischen den Zellen den gemessenen TEER erzeugen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Herstellung und Verwendung von Chips mit integrierten Elektroden für TEER-Messungen in Organs-on-Chips haben. Diese Technik kann im Bereich der Blut-Hirn-Schranken-Forschung eingesetzt werden, um die direkte Verabreichung und die Krankheitsmerkmale beispielsweise bei der Alzheimer-Krankheit zu untersuchen.Nach diesem Verfahren kann die Barrierefunktion von Hirnendothel, differenziert von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, auch für Anwendungen in der personalisierten Medizin überwacht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bestimmung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) in mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns in vitro. Ein hoher TEER-Wert deutet auf intakte Endothelzellverbindungen hin, während die Zugabe von aktivierten T-Zellen den TEER-Wert senkt, was eine Störung der Verbindungsbarriere widerspiegelt.

Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Die Organische elektrochemischen Transistor mit lebenden Zellen integriert und zur Ionenfluss über den Magen-Darm-Epithel-Barriere zu überwachen. In dieser Studie wurde eine Erhöhung des Ionenflusses, um eine Unterbrechung der tight junctions, die durch die Anwesenheit der Calcium-Chelatbildner EGTA (Ethylenglykol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetra-Essigsäure induzierten verwandten Säure), wird gemessen.

Erkundung der Barrier Gewebestörung mit einem organischen Transistor Elektro

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die beschreibt die Herstellung von dehnbar, dual Channel, Orgel Chip mikrofluidischen Zelle Kultur Geräte zur Rekapitulation ORGANEBENE Funktionalität in Vitro.

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

Hier zeigen wir, wie man ein kostengünstiges Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz aufstellt, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandsmessungen verwendet werden kann.

Ein einfacher Ansatz zur Durchführung von TEER-Messungen mit einem selbst gefertigten Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ist eine multizelluläre neurovaskuläre Einheit, die die Homöostase des Gehirns streng reguliert. Durch die Kombination menschlicher iPSCs und Organ-on-Chip-Technologien haben wir einen personalisierten BBB-Chip entwickelt, der für die Krankheitsmodellierung und Diedurchlässigkeitsvorhersagen von CNS-Medikamenten geeignet ist. Für die Erzeugung und den Betrieb des BBB-Chips wird ein detailliertes Protokoll beschrieben.

Generierung eines humanen iPSC-basierten Blut-Hirn-Barriere-Chips

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Die Integration von caninen Darmorganoiden und einem mikrofluidischen Gut-on-a-Chip-System bietet relevante translationale Modelle für menschliche Darmerkrankungen. Die vorgestellten Protokolle ermöglichen eine 3D-Morphogenese und eine dynamische In-vitro-Modellierung des Darms und helfen so bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Darmerkrankungen bei Hunden und Menschen mit One Health.

Dreidimensionale Morphogenese im Darm-on-a-Chip von Hunden unter Verwendung von Darmorganoiden, die von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen stammen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines einzigartigen zweischichtigen mikrofluidischen Geräts vor, um die elektromechanische Regulation der Homöostase des Epithelgewebes zu untersuchen. Das Gerät legt statische physiologische elektrische Ströme senkrecht zur Gewebeebene an, die die Zell-Zell-Adhäsion, Proliferation und Extrusion beeinflussen. Lebendzell-Imaging und mechanische Stressmessungen enthüllen die Mechanismen dieser Prozesse.

Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Erfahren Sie die Herstellung eines Organ-on-Chip-Systems mit integrierten Elektroden zur direkten Quantifizierung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER). Diese Methode ermöglicht präzise Barrieremessungen für die Blut-Hirn-Schranke und andere Organsysteme.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren (Video) | JoVE Journal

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

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