Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zellteilung von Säugetieren und Zellmatrix-Interaktionen in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen effizienten und allgemeinen Ansatz zur Untersuchung der Zellteilung von Säugetieren und der Zellmatrix-Interaktionen bietet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Zellbiologie zu beantworten, wie z.B. die molekularen Grundlagen der Entwicklung von normalem und krankem Gewebe.

Einen Tag vor der Transfektion werden fünf Millionen HEK-293-T-Zellen in einer 100-Milliliter-Zellkulturschale in 10 Milliliter normales Zellkulturmedium distratiert. Inkubieren Sie diese Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nehmen Sie am nächsten Tag, kurz vor Beginn der Transfektionen, ein Fläschchen mit dem Transfektionsreagenz bei vier Grad Celsius heraus und lassen Sie es auf Raumtemperatur kommen.

Geben Sie dann zunächst einen Milliliter reduziertes Serummedium in ein steriles Mikrofugenröhrchen. Zu diesem werden bestimmte Mengen an lentiviralen Vektorplasmiden, die für die Transfektion verwendet werden, hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt. Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie nach fünf Minuten 48 Mikroliter des Transfektionsreagenzes in dieses Röhrchen und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren Sie diese Mischung anschließend mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte mit HEK-293 T-Zellen aus dem Inkubator.

Geben Sie die vorbereitete DNA-Transfektionsreagenzmischung tropfenweise auf die Zellen und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung in der Platte zu gewährleisten. Setzen Sie die Platte wieder in den Inkubator ein. Etwa sechs Stunden nach der Transfektion entfernen Sie die Platte und aspirieren das Medium.

Fügen Sie 10 Milliliter frisches Nährmedium hinzu und geben Sie die Platte zurück in den Inkubator. Zu mehreren Zeitpunkten, 24, 48 und 72 Stunden nach der Transfektion, entnehmen Sie das Kulturmedium mit den lentiviralen Partikeln in separaten Röhrchen. Filtrieren Sie anschließend das geerntete Kulturmedium durch einen sterilen 0,45-Mikron-Filter, um Zelltrümmer zu entfernen.

Nach jeder Ernte durch frisches Kulturmedium ersetzen. Das Filtrat, das die lentiviralen Partikel enthält, kann sofort für die Transduktion verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Humane Mammakarzinomzellen MDA-MB-231 in einer 35-Millimeter-Kulturschale in normalem Nährmedium disponieren.

Inkubieren Sie diese Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag aspirieren Sie das Nährmedium von der Platte und fügen Sie einen Milliliter der lentiviralen Partikel zusammen mit einem Milliliter frischem Kulturmedium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator für ca. 16 Stunden.

Nachdem die Inkubation mit Viruspartikeln abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte, um das Medium abzusaugen. Fügen Sie dann zwei Milliliter frisches Medium hinzu und geben Sie es für 24 bis 72 Stunden zurück in den Inkubator. Überprüfen Sie die Expression von H2B-mCherry in diesen transduzierten Zellen mit einem Epifluoreszenzmikroskop.

Um die Synchronisationsexperimente zu starten, werden zunächst MDA-MB-231-Zellen, die H2B-mCherry exprimieren, mit einer Konfluenz von 50 bis 60 % in einer 24-Well-Platte plattiert. Inkubieren Sie die Kultur 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Kulturmedium durch 0,5 Milliliter Medium, das zwei Millimolare Thymidin enthält.

Lassen Sie die Platte 24 Stunden lang im Inkubator. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um sie von der Thymidin-Behandlung zu befreien. Lassen Sie die Zellen dann in 0,5 Millilitern normalem Nährmedium für fünf Stunden im Inkubator.

Um diese Zellen in der Mitose zu blockieren, fügen Sie dem Kulturmedium anschließend Nocodazol hinzu. Lassen Sie die Zellen 12 Stunden lang im Inkubator. Nachdem die Nocodazol-Behandlung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte heraus und schütteln Sie die Zellen mit einem Orbitalschüttler 45 Sekunden bis eine Minute lang, um mitotische Zellen freizusetzen.

Anschließend wird das Medium, das die extrahierten mitotischen Zellen enthält, in ein neues Zentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie dann 0,5 Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung. Wiederholen Sie danach das Schütteln und Entnehmen der Zellen noch zwei weitere Male.

Bündeln Sie das gesamte gesammelte Medium und zentrifugieren Sie es dann, um die mitotischen Zellen zu pelletieren. Nach dem Schleudern resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,25 Millilitern frischem Zellkulturmedium. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen.

Zu Beginn dieses Schritts 50 Milliliter 10x DMEM-Lösung vorbereiten und filtrieren. Bestimmen Sie als Nächstes die Volumina aller Komponenten, die zur Herstellung der 3D-Kollagenmatrix verwendet werden, wie im Textprotokoll angegeben. Kühle alle diese Komponenten auf Eis vor, um die Gelierung des Kollagens zu verlangsamen.

Geben Sie nun in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen die erforderliche Anzahl von Zellen in Medium, dann 10x DMEM, FBS, deionisiertes Wasser, Kollagen und schließlich Natriumhydroxid. Vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette mischen. Sobald die Lösung gut vermischt ist, gib 500 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung der 24-Well-Platte.

Stellen Sie die 24-Well-Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Platte heraus und geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes Nährmedium auf das Gel. Schalten Sie vor der Bildgebung die lebenden Zelleinheiten des Phasenkontrastmikroskops und des Konfokalmikroskops ein.

Um sich teilende Zellen einzufangen, legen Sie die 24-Well-Platte mit den in Kollagenmatrizen eingebetteten Zellen in die lebende Zelleinheit des Fluoreszenzmikroskops. Suchen Sie mit dem 10X-Objektiv die Unterseite der Platte und bewegen Sie sie dann nach oben, bis das Mikroskop etwa 500 Mikrometer von der Unterseite der Platte entfernt fokussiert. Verschieben Sie den Tisch, um Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu finden, und wählen Sie mehrere Positionen für die Bildgebung aus.

Richten Sie das Zeitrafferexperiment in Zwei-Minuten-Intervallen ein. Um als Nächstes das Kollagennetzwerk abzubilden, konfigurieren Sie das konfokale Mikroskop so, dass nur das reflektierte Licht des 488-Nanometer-Lasers erfasst wird. Platzieren Sie dann die Platte mit den Zellen in Kollagenmatrizen in die lebende Zelleinheit dieses Mikroskops.

Suchen Sie den unteren Rand der Platte und bewegen Sie dann die Objektivlinse nach oben, bis sie etwa 100 Mikrometer von der Unterseite der Platte entfernt scharfstellt. Verschieben Sie die Bühne, um Zellen zu finden, und wählen Sie mehrere Positionen für die Bildgebung aus. Richten Sie das Zeitrafferexperiment mit Fünf-Minuten-Intervallen ein.

sind Fluoreszenzbilder einer sich teilenden H2B-mCherry-exprimierenden MDA-MB-231-Zelle zu sehen, die in eine Kollagenmatrix eingebettet ist. Verschiedene Phasen der Mitose sind erwartungsgemäß leicht zu beobachten. Die Verteilung der Kollagenfasern in Weiß, die gleichzeitig mit der konfokalen Reflexionsmikroskopie sichtbar gemacht wird, verändert sich im Verlauf der Mitose nur sehr wenig.

Die zellsynchronisierte G2-M-Phase und die Einbettung in eine Kollagenmatrix schließen die Zellteilung in den ersten zwei Stunden ab, während sich die asynchronen Kontrollzellen nach dem Zufallsprinzip teilen. Die Quantifizierung der Verteilung von Kollagenfasern während der Interphase- und Mitosephase deutet darauf hin, dass die Matrixdeformation während der Zellteilung minimal und in Interphase-Zellen höher ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Tagen abgeschlossen werden, beginnend mit der Generierung der stabilen Zelllinie bis hin zur Analyse der Videozellenteilung in einer 3D-Matrix.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie hoffentlich ein gutes Verständnis dafür, wie man die Zellteilung von Säugetieren in 3D-Matrizen mit Hilfe von Live-Zell-Imaging synchronisiert und überwacht und wie man die Matrixverformung mit konfokaler Reflexionsmikroskopie und quantitativen bildgebenden Analysetechniken bestimmt.