Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Knorpel und Haut Analoga wurden Bioprinted mit einem Nanocellulose-Alginat-basierten Bioink. Die Bioinks wurden vor dem Druck über einen einzigen Schritt passive Mischeinheit cellularized. Die Konstrukte wurden demonstriert werden gleichmäßig cellularized, haben hohe Rentabilität und günstige Marker der Differenzierung aufweisen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die schnelle und reproduzierbare Präzellularisierung von Biotinten für Bioprinting-Anwendungen zu erleichtern und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Diese Methode kann dazu beitragen, die Reproduzierbarkeit beim Mischen einer Zellsuspension mit einer Biotinte zu rationalisieren und zu verbessern, um den Druck lebensfähiger Zellen sicherzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir nicht mehr in der Lage sind, durch das Mischen von Zellen mit einer Biotinte in einem geschlossenen System mit minimaler Handhabung und dem Risiko von Probenverlusten

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Gefahr einer unsachgemäßen Vermischung besteht, wenn die Montage falsch durchgeführt wird. Besorge dir zunächst zwei Spritzen. Eine Spritze ist für die Zellsuspension, die andere Spritze für die Biotinte.

Das in dieser Studie verwendete Mischungsverhältnis beträgt 10 zu eins. Verwenden Sie daher eine 12-Milliliter-Spritze und eine Ein-Milliliter-Spritze, wie es die 10-zu-Eins-Mischeinheit erfordert. Besorgen Sie sich außerdem eine sterile passive Mischeinheit, die über einen Luer-Lock-Anschluss und einen sterilen Luer-Lock-Konnektor zwischen Frau und Frau mit Doppelspritzen gekoppelt werden kann.

Holen Sie sich eine Dosiereinheit, die ein Volumen aus zwei sterilen Spritzen gleichzeitig mit einer kontrollierten Geschwindigkeit extrudieren kann. Besorgen Sie sich schließlich eine sterile Patrone, in die Sie die Biotinte und die Zellsuspension direkt einmischen können. In diesem Protokoll wird eine Bio-Tinte auf Nanocellulose-Alginat-Basis verwendet, die durch Zugabe einer Calciumchloridlösung nach dem Druck vernetzt wird.

Um die Zellen vorzubereiten, lösen Sie sie mit einer 0,5%igen Trypsin-EDTA-Lösung. In diesem Protokoll werden humane Fibroblasten verwendet. Zählen Sie dann die Gesamtzahl der Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.

Bestimmen Sie, welche Zelldichte im endgültigen gedruckten Konstrukt gewünscht ist. Berechnen Sie die Konzentration der geernteten Zellen, die verdünnt werden müssen, um diese angestrebte endgültige Zelldichte zu erreichen. In diesem Protokoll wurde eine endgültige Zelldichte von fünf Millionen Zellen pro Milliliter verwendet.

Übertragen Sie die Zellsuspension in die Zellsuspensionsspritze. Übertragen Sie die Biotinte ebenfalls auf die andere Spritze. Ziehen Sie anschließend den Kolben der Bioink-Spritze zurück und führen Sie die Spritze in die Dosiereinheit ein.

Stellen Sie sicher, dass mindestens die Hälfte des Volumens in den Rückziehspritzen sterile Luft aus der Biosicherheitswerkbank ist. Es ist wichtig, dass die Positionen der Spritzenkolben während des Einführens in die Abgabeeinheit beibehalten werden. Positionieren Sie das Gerät senkrecht mit dem Luer-Lock-Anschluss nach oben.

Ziehen Sie dann den Kolben der Zellspritze auf eine ähnliche Länge wie die Bioink-Spritze zurück und setzen Sie ihn in die Dosiereinheit ein. Stellen Sie sicher, dass es nicht zu einem versehentlichen Austritt der Zellsuspension oder der Biotinte kommt, indem Sie sicherstellen, dass die Mischeinheit gleichmäßig an den beiden Spritzen befestigt ist. Vor dem Mischen noch einmal überprüfen.

Befestigen Sie beide Spritzen an der Mischeinheit, indem Sie die Luer-Lock-Anschlüsse drehen. Entlüften Sie dann das Mischsystem, indem Sie auf die Dosiereinheit drücken, um die Luft in der Spritze zu extrudieren. Stoppen Sie das Priming, bevor die Lösung den Luer-Lock erreicht.

Befestigen Sie die Füllkartusche nach dem Ansaugen über den Luer-Lock-Anschluss am Ende der Mischeinheit. Stellen Sie sicher, dass sich der Kolben in der Füllkartusche vor dem Anbringen unten befindet. Drücken Sie die Dosiereinheit langsam zusammen, um die Biotinte und die Zellsuspension in die Patrone zu mischen.

Schieben Sie den Kolben in der Füllkartusche mit einer sterilen Pipettenspitze nach unten, um nach dem Mischen mit der Bioink-Zellenmischung in Kontakt zu kommen. Halten Sie die Dosiereinheit komprimiert, um sicherzustellen, dass die Zell-Biotintenmischung nicht wieder in die Mischeinheit extrudiert wird. Verschließen Sie die Patrone und klopfen Sie vorsichtig auf die Arbeitsfläche, um Luftblasen nach oben zu bewegen.

Zu diesem Zeitpunkt ist die Zell-Biotintenmischung bereit für den Druck. In diesem Protokoll wurde eine quadratische Struktur mit den Abmessungen 4,8 x 4,8 x 0,9 Kubikmillimeter als Stereolithographie-Datei exportiert. Eine G-Code-Datei der Gitterstruktur wurde mit den Einstellungen des Textprotokolls generiert.

Isolierung und Kryokonservierung von primären humanen nasalen Chondrozyten (HNCs) von Patienten gemäß dem referenzierten Protokoll. Tauen Sie kryokonservierte HNCs auf und expandieren Sie einmal in einer Monolayer-Kultur mit Standard-Kulturmedium bei 37 Grad Celsius. Trennen Sie die Zellen bei 80 % bis 90 % Konfluenz mit einer 0,5 %igen Trypsin-EDTA-Lösung und zählen Sie mit einem Trypanblau-Ausschlussprotokoll.

Alle Experimente wurden mit HNCs an der zweiten Passage durchgeführt. Wir suspendieren die HNCs bei 100 Millionen Zellen pro Milliliter in 300 Mikrolitern Kulturmedium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin und 50 Mikrogramm pro Milliliter Ascorbinsäure als Vorbereitung auf das Mischen mit der Biotinte. Mischen Sie die HNC-Zellsuspension in eine Biotinte auf Nanocellulose-Alginat-Basis, indem Sie dem passiven Mischeinheitenprotokoll bei einem Verhältnis von 10 zu eins Biotinte zu Zellsuspension folgen, um eine endgültige Zellkonzentration von neun Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Stellen Sie sicher, dass der Bioprinter durch UV-Strahlung sterilisiert wird, und wischen Sie ihn mit 70% Ethanol ab. Bewahren Sie die Sterilität, indem Sie den Bioprinter in den Laminar-Flow-Schrank stellen. Befestigen Sie dann sterile Druckdüsen an den Patronen mit den Bioink-Zellen-Suspensionsmischungen und setzen Sie sie in den Biodrucker ein.

Nach der Kalibrierung des Bioprinters wird der Bioprint der gitterstrukturierten, zellbeladenen Konstrukte mit der konischen 25-Gauge-Düse bei einem Druck von 25 Kilopascal durchgeführt. Bioprint von zellfreien Konstrukten als Kontrolle. Vernetzen Sie die Konstrukte, indem Sie eine ionische Lösung von 100 Millimetern oder Calciumchlorid hinzufügen.

Spülen Sie die Konstrukte nach fünf Minuten ab. Inkubieren Sie dann die Konstrukte in einem Nährmedium unter Standardkulturbedingungen, wobei das Medium jeden zweiten oder dritten Tag gewechselt wird. Entnahme von Proben für die histologische Analyse in der zweiten und vierten Woche.

Färben Sie die Proben für die Glykosaminoglykan- oder GAG-Produktion mit einem Alzianblau-Farbstoff. Hier ist die Zellviabilität 24 Stunden nach dem Mischen mit der passiven Mischeinheit oder einer manuellen Mischtechnik dargestellt. Die passive Mischeinheit zeigte eine bessere Viabilität, da das Ausmaß der Durchmischung erhöht wurde.

Dies ist wichtig, da bei der Herstellung großer Chargen von präzellularisierten Biotinten längere Mischzeiten erforderlich sein können. Die Zellviabilität an Tag 14 und Tag 28 der Kultur ist hier dargestellt. Eine gute Zellviabilität wird visualisiert und zeigt ein langfristiges Zellüberleben, wenn diese Technik angewendet wird.

Glykosaminoglykane werden in biogedruckten Knorpelkonstrukten, die mit Alcianblau gefärbt wurden, an den Tagen Null, 14 und 28 visualisiert. Diese Bilder zeigen die Bildung von Neoknorpel innerhalb dieser biogedruckten Konstrukte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein passives Mischsystem zur Zellularisierung von Biotinten verwenden können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Bioprintings, Biotinten mit einer schonenden Mischtechnik schnell und gleichmäßig zu zellularisieren.