Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls für den Echtzeit-Quaking-induzierten Konversionsassay ist es, einen sensitiven Nachweis von Prionen der chronischen Auszehrungskrankheit in Stuhlproben von Hirschartigen zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der CWD-Forschung zu beantworten, z. B. wann infizierte CWD-Prionen des Gebärmutterhalses im Kot vorhanden sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie spezifisch und empfindlich ist und einen hohen Durchsatz von Proben ermöglicht.

Ginny Cheng, eine Labortechnikerin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Um diesen Vorgang zu starten, geben Sie ein Gramm Fäkalien in ein Röhrchen mit 10 Millilitern Kotextraktpuffer. Homogenisieren Sie die Kotpellets mit einem Dissoziator mit einem voreingestellten Programm für Proteine eine Minute lang bei Raumtemperatur.

Wiederholen Sie dies zwei- bis dreimal, bis die Stuhlproben vollständig homogenisiert sind. Verwenden Sie dann Parafilm, um die Röhrchen zu verschließen, und legen Sie sie für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur auf eine Schaukelplattform oder einen Drehschüttler. Danach bei 18.000 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugieren.

Sammeln Sie die Überstände und aliquotieren Sie sie in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um mit der Natriumphosphowolframsäure-Fällungsmethode zu beginnen, fügen Sie 250 Mikroliter Sarkosyl zu einem Milliliter fäkalem Proteinextrakt hinzu.

Verschließen Sie die Tube mit Parafilm. Stellen Sie das Röhrchen in einen Thermomischer und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 1.400 U/min. Danach wird eine Stammlösung mit 10 % Natriumphosphowolframsäure und 170 Millimolar Magnesiumchlorid zugegeben, so dass die Endkonzentration an Natriumphosphotungssäure in den Proben 3 % beträgt. Geben Sie die Proben in den thermischen Mischer und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 400 U/min.

Als nächstes zentrifugieren Sie bei 15.800 g für 30 Minuten bei 14 Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände und waschen Sie die Pellets, indem Sie sie in Waschpuffer resuspendieren. Dann zentrifugieren Sie bei 15.800 g für 15 Minuten bei 14 Grad Celsius.

Entfernen Sie vorsichtig die Überstände und resuspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern RT-QuIC-Verdünnungspuffer. Lagern Sie die behandelten Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die Durchführung des RT-QuIC-Assays bereit sind. Zu Beginn fügen Sie 0,032 Gramm Thioflavin T zu 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser hinzu, um eine frische 10 Millimolare Thioflavin-T-Stammlösung herzustellen.

Als nächstes wird die Stammlösung mit doppelt destilliertem Wasser um eins bis 10 verdünnt, was zu einer Endkonzentration von einem Millimolar Thioflavin T führt. Filtrieren Sie mit einer Spritze, die mit einem 0,2-Mikrometer-Acro-Scheibenfilter ausgestattet ist, die einmillimolare Thioflavin-T-Lösung. Tauen Sie dann das rekombinanteste Prionenproteinsubstrat auf. Laden Sie jeweils 500 Mikroliter rekombinantes Prionproteinsubstrat in 100 Kilo Dalton-Ausschlussfilter-Mikroröhrchen.

Bei 14.000 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie danach das eluierte Substrat in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen. Bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern.

Tauen Sie anschließend den gelagerten RT-QuIC-Verdünnungspuffer auf. Das Saatgut verdünnen und die Stammlösungen und das RT-QuIC-Reaktionsgemisch wie im Textprotokoll beschrieben vorbereiten. Mischen Sie das Reaktionsgemisch mit einer Pipette mit einer Filterspitze, indem Sie es auf und ab pipettieren.

Gießen Sie die Mischung in ein 50-Milliliter-Entsorgungs-Pipettierreservoir. Laden Sie mit einer Mehrkanalpipette 98 Mikroliter RT-QuIC-Reaktionsgemisch in jede Vertiefung einer optischen 96-Well-Bodenplatte. Zu jeder Reaktion fügen Sie zwei Mikroliter entweder unverdünnten oder 10-fach seriell verdünnten fäkalen Proteinextrakt hinzu.

Verwenden Sie dann Dichtungsband, um die Platte zu versiegeln. Inkubieren Sie in einem Plattenlesegerät bei 42 Grad Celsius für 25 Stunden mit wiederholten Zyklen von einer Minute doppeltem Orbitalschütteln bei 700 U/min und einer Minute Ruhezeit während der gesamten Inkubation. Definieren Sie in der Zwischenzeit die Einstellungen für die Fluoreszenzmessung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Nehmen Sie die Platte nach 25 Stunden aus dem Tellerlesegerät. Drehen Sie die Platte drei Minuten lang bei 3.000 g herunter, um eine mögliche Kontamination zwischen den Vertiefungen zu vermeiden. Entfernen Sie anschließend die Dichtung von der Platte.

Bereiten Sie eine neue Platte vor, indem Sie 90 Mikroliter RT-QuIC-Reaktionsgemisch hinzufügen, das frisches Substrat und frischen Thioflatin-T-Fluoreszenzfarbstoff enthält. Übertragen Sie 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung der ersten Platte auf die neu vorbereitete 96-Well-Platte. Verwenden Sie Dichtungsband, um die neue Platte abzudichten.

Nachdem Sie die Einstellungen für die Fluoreszenzmessung festgelegt haben, setzen Sie den Assay für weitere 50 Stunden fort. Lesen und dokumentieren Sie das Thioflavin-T-Fluoreszenzsignal für jede Vertiefung alle 15 Minuten. Sammeln und plotten Sie dann die Daten, wie im Textprotokoll beschrieben.

In dieser Studie wird Kotmaterial von nicht infizierten Elchen oder Maultierhirschen in Kotextraktpuffer homogenisiert, um eine endgültige Probenkonzentration von 10 % zu erhalten. Einige Homogenate werden dann verarbeitet und durch Natriumphosphowolframsäurefällung 10-fach konzentriert. Während in gereinigten Proben eine Verringerung der spontanen Umwandlungen zu beobachten ist, zeigten alle Proben in CWD-positiven Stuhlproben niedrige Fluoreszenzsignale. Um die Amplifikation von Prionen zu verbessern und die Empfindlichkeit der Detektion zu erhöhen, ist ein Substrataustauschschritt integriert.

Proben, die im Rahmen des RT-QuIC-Protokolls einem Substratwechsel unterzogen wurden, zeigen eine Erhöhung der Sensitivität und Spezifität des Nachweises, wobei 14 der 18 Proben positiv waren und keine der negativen Kontrollen als falsch positiv registriert wurde. Sobald die Fäkalextrakte hergestellt und die PRP/SCRP-Konzentration gemeistert sind, können sie in etwa vier Stunden durchgeführt werden, und der RT-QuIC-Assay kann in etwa 1/1-2 Stunden eingerichtet werden, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Substrat zu filtern, aber nicht niemals zu wirbeln.

Im Anschluss an den Eingriff können weitere Methoden wie Western Blotting verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie resistent Proteasen die resultierenden Produkte sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Wissenschaftler auf dem Gebiet der Prionenforschung, das Vorhandensein von Prionen in lebenden Tieren durch die Untersuchung von Kotproben zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie PRP/SCRP aus Stuhlextrakten hergestellt und konzentriert wird und wie Sie einen modifizierten RT-QuIC-Assay durchführen, um einen empfindlichen und spezifischen Prionennachweis zu erhalten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Prionen äußerst gefährlich sein kann und dass es wichtig ist, während der Durchführung des Eingriffs geeignete PSA zu tragen und unter einer Biosicherheitswerkbank zu arbeiten.