Name: Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung von HSV-1-DNA aus infizierten Zellen für die Proteomanalyse viraler Genom-assoziierter Proteine. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Faktoren bei Herpesvirus-Infektionen.

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Wir bestätigen Hannah Fox für Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NIH R01AI030612 zu gewähren.

1. Zellkultur, Virusinfektion und EdC Beschriftung ( Abbildung 1) das folgende Protokoll schließt die Arbeit mit Viren. Entnehmen Sie bitte Ihrer Institution &#39; s Bio-Sicherheit Protokolle für sichere Handhabung von Viren und anderen biologischen Arbeitsstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board von der University of Pittsburgh genehmigt.
<ol><li>Trypsinize eine konfluierende 150 cm 2 Gewebekultur Flasche MRC-5 Zellen und übertragen Sie die Zellen auf einer 600 cm 2 Gewebekultur Teller mit 100 mL DMEM plus 10 % FBS. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2 für 3-4 Tage, confluency und stationäre Phase zu erreichen. Ein konfluierende 600 cm 2 Teller enthält ~ 7 x 10 7 Zellen. Bereiten Sie 1 Platte für jede Kondition und 1 Platte für jede entsprechende Negativkontrolle. 
	Hinweis: Zellen die stationäre Phase um hemmen zelluläre DNA-Replikation, um sicherzustellen, dass nur vDNA ist beschriftet und in den nachfolgenden Schritten gereinigt erreichen müssen. 
	Hinweis: Jede Probe erfordert ein kostenloses unmarkiertem Negativkontrolle vorbereitet, mit dem gleichen Infektionsbedingungen und Zeitpunkt ohne Zusatz von EdC. 
	Hinweis: A verkleinerte Version von diesem Experiment sollte durchgeführt werden parallel zum Testen für die Kennzeichnung der zellulären DNA durch Bildgebung mit vergleichbaren Zellwachstum, Infektion, EdC, die Bedingungen, zu beschriften und Zeitpunkten (siehe Schritt2).</li>
	<li>Verdünnen, 7 x 10 8 PFU HSV-1 in 7 mL kalte Tris-Buffered Kochsalzlösung (TBS). Entfernen Sie Wachstumsmedium und Lagern bei 37 ° C. Zu infizieren, MRC-5 Zellen 7 mL verdünnten Virus hinzu und rock für 1 h bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach Adsorption Inokulum zu, spülen Sie mit 50 mL Raumtemperatur TBS und ersetzen Sie die ursprüngliche Wachstumsmedium. Inkubation bei 37 ° C in Anwesenheit von 5 % CO 2. Dieser Schritt sollte für jede Versuchsbedingung und negativ-Kontrolle durchgeführt werden. 
	Hinweis: Erhöhte EdC Kennzeichnung lässt sich mit HSV-1 Mutanten defekt für die Expression der viralen dUTPase (UL50-gen) bzw. Uracil Glycosylase (UL2 gen). HSV-1 dUTPase hat geringe Substratspezifität und die Aktivierung von mehreren Nukleosid-Analoga 25 , 27 verringern kann.</li>
	<li>Label viraler Genome mit EdC. Folgen Sie den Anweisungen um eingehende Genome (1.3.1), Replikation Genome (1.3.2.) oder virale Replikation Gabeln (1.3.3.) zu beschriften. 
	Hinweis: Nur Schritt 1.3.1 und 1.3.2 1.3.3 sollte erfolgen, je nachdem, ob eingehende Genome, replizierte Genomen oder Replikation Gabeln in den nachfolgenden Schritten bzw. analysiert werden. 
	Hinweis: EdU oder f-Ara-EdU kann für EdC ersetzt werden. Die Toxizität von Nukleosid-Analoga sollten überwacht und minimiert werden.
	<ol><li>Verwendung prelabeled Bestände, Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen und fahren mit Schritt2 oder 3 innerhalb von 4 Stunden buchen (Hpi) Infektion untersuchen Langzeittransaktionen vDNA ( Abbildung 1A). 
		Hinweis: Bereiten Sie Aktien mit der zuvor beschriebenen Protokoll 25 prelabeled Virus. Virus Bestände müssen durchlaufen eine G-25 Spalte entfernen Rückstände EdC.</li>
		<li>Label replizierende vDNA durch Zugabe von 5-25 µM EdC, Zellkulturmedium infizierter Zellen für 2-4 h ( Abbildung 1 b). Bevor Sie hinzufügen, verdünnen EdC in 1 mL Wachstumsmedium.</li>
		<li>, Virale Replikation Gabeln, nach Beginn der vDNA Replikation zu kennzeichnen (&#8805; 4 Hpi), Puls-Label replizieren vDNA mit 5-25 µM EdC für 5-20 min. Um zu jagen, 3 X mit Chase 25-100 µM 2´deoxycytidine-haltigem Medium spülen (DeoxyC) und inkubieren Sie in Anwesenheit von Chase Medium für eine zusätzliche 20-40 min ( Abbildung 1). 
		Hinweis: Puls und Chase Medium sollte auf 37 ° C und 5 % CO 2 vor Gebrauch equilibriert. 
		Hinweis: Für Puls-Chase-Experimente ist es wichtig, die Zeitspanne zu berücksichtigen braucht es für Nukleoside, geben die Zelle und phosphoryliert werden, bevor sie in die Replikation von DNA integriert werden können. Dies muss empirisch ermittelt werden. 
		Hinweis: Um die Auflösung der Puls Chase Experimente zu ermitteln, berechnen Sie die virale Replikation Rate unter den experimentellen Bedingungen verwendet. Dies kann durch quantitative PCR viral Genome bestimmt werden, in einem einzigen Schritt Wachstum Zeit Kurs 26. 
		Hinweis: Für imaging-viraler Genome gehen Sie zu Schritt2 und für die Reinigung von viralen Genomen fahren Sie mit Schritt 3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bildgebung des EdC gekennzeichnet DNA ( Abbildung 2A) Hinweis: Es empfiehlt sich, führen Sie Bildgebung im Tandem mit der virale Genom-Reinigung-Methode um sicherzustellen, dass zelluläre DNA in Experimenten nicht beschriftet ist. Bildgebung kann auch verwendet werden, die Natur der beschrifteten vDNA visualisieren und Proteomics Daten validiert. Beispiele für zelluläre und virale DNA Färbung Muster sind in Abbildung 3.
<ol><li>Infektionen durchzuführen und EdC Kennzeichnung wie in Schritt 1 außer angegeben Bedingungen auf Deckgläsern in eine 12-Well-Zellkultur-Schale mit 1 mL Wachstumsmedium verkleinert.</li>
	<li>Fix Zellen mit 1 mL 3,7 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 15 min bei RT Nach der Fixierung, Zellen spülen 2 X mit 1 mL 3 % BSA in PBS. 
	Achtung: Paraformaldehyd kann ernsthafte oder dauerhafte Schäden verursachen. Sicherheitsvorkehrungen zu folgen. 
	Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Deckgläsern können bis zu 3 Tage bei 4 ° C in der zweiten Wäsche gelagert werden.</li>
	<li>Permeabilize Zellen mit 1 mL Permeabilisierung Puffer [siehe Tabelle der Materialien] für 20 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Spülen mit 1 mL 3 % BSA und dann Block mit 1 mL 3 % BSA mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur während Schaukeln.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der Klick Reaktion cocktail [siehe Tabelle der Materialien] auf Deckgläsern kovalent Alexa Fluor 488 konjugieren Azid, EdC gekennzeichnet DNA. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Fleck zelluläre DNA mit 1 mL einer 1:2,000 Verdünnung von Hoechst mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur beim Schaukeln. Aspirieren und spülen Sie zweimal mit 1 mL PBS.</li>
	Indirekte Immunfluoreszenz <li>Fleck mit primären und sekundären Antikörper nach Standard Protokolle 25. 
	Hinweis: Markierte vDNA colocalizes mit ICP8, ICP4 oder UL42 und mit der Bezeichnung zelluläre DNA mit Hoechst-Fleck colocalizes.</li>
	<li>Montieren Deckgläsern auf Folien und image-Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop. 
	Hinweis: Dias können bei 4 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Reinigung des vDNA und verbundenen Proteine Hinweis: verschiedene Aspekte dieses Protokolls wurden angepasst von Leung Et Al. 22 Hinweis: alle Puffer und Reagenzien sollten auf dem Eis vor Gebrauch gekühlt werden und alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Kerne ernten. 
	Hinweis: Vor der Isolation der Kerne, kann Formaldehyd an Crosslink Proteine, DNA verwendet werden. Strengere waschen Bedingungen können dann während der DNA-Reinigung auf Streptavidin beschichteten Perlen verwendet werden. Für crOsslinking und waschen Bedingungen siehe Sirbu Et al. 21. <ol><li>ersetzen Wachstumsmedium mit 20 mL Extraktionspuffer Kerne (NEB) und inkubieren Sie für 20 min bei 4 ° C mit gelegentlichen Schaukeln. Kerne werden im Mikroskop sichtbar werden.</li>
		<li>Kerne von der Platte mit einem Schaber Zelle zu kratzen und auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C zu pellet-Kerne, den Überstand verwerfen. 
		Hinweis: Trypan Blaufärbung verwendet werden, kann um die Isolierung von Kernen von Zellen prüfen.</li>
		<li>Sanft das nukleare Pellet in 10 mL PBS, Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr zu verdrängen und pellet durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS. 
		Hinweis: Kerne können eingefroren werden und das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden. Dazu sanft Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 500 µL Einfrieren zu puffern und inkubieren Sie das Rohr im Eisbad Ethanol/trocken. Speichern Sie gefrorene Kerne bei-80 ° C. Vor Gebrauch Kerne bei Raumtemperatur auftauen, schnelle Übertragung von Eis, fügen Sie 10 mL PBS, Rock sanft zu mischen, durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° C, pellet und PBS vollständig zu entfernen. Einfrieren von Kernen ertragsreduzierten führen kann.</li>
	</ol></li> <li>Kovalent conjugate Biotin-Azid, EdC beschriftet vDNA.
	<ol><li>Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 10 mL Klick Reaktion [siehe Tabelle der Materialien] durch Mischen sanft auf und ab pipettieren 5 Mal mit einer 10 mL pipettieren. 
		Hinweis: Es ist wichtig, dass die Reagenzien in der Klick-Reaktion-Mix enthalten in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden.</li>
		<li>Für 1h bei 4 ° c drehen Während der Drehung vorzubereiten und chill Puffer B1, B2 und B3 [siehe Tabelle Material].</li>
		<li>Pellet Kerne durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen klicken Sie auf Reaktion Mischung und waschen das Pellet durch sanft resuspending in 10 mL PBS und Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c</li>
		<li>Aufschwemmen sanft die nukleare Pellet in 1 mL PBS und den Transfer zu einem 1,5 mL Microfuge Schlauch mit einem großkalibrigen Pipettenspitze. Pellet-Kernen durch Zentrifugation für 10 min bei 2.500 x g bei 4 ° c vollständig entfernen PBS und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und gefrorene Kerne können bei-80 ° c Einfrieren Auftauen hilft bei nachfolgenden Lyse gelagert werden, so ist es empfehlenswert, dass Kerne flash eingefroren werden, auch wenn am selben Tag auf Schritt 3.3 ausgehend.</li>
	</ol></li> <li>Lyse Kerne und DNA-fragment.
	<ol><li>Kerne auf Eis auftauen und Aufschwemmen in 500 µL Puffer B1 durch Pipettieren rauf und runter. Inkubation auf Eis für 45 min.</li>
		<li>Sonicate Proben 6 Mal für 30 s bei 40 % Amplitude mittels 3 mm Microtip Sonde. Legen Sie Proben auf Eis für 30 s zwischen den Pulsen. Nach Beschallung, Proben erscheinen sollte, klar, nicht bewölkt. 
		Hinweis: Für individuelle Ultraschallgeräte sollte Beschallung Bedingungen optimiert werden. Eine ausführliche Anleitung zur Optimierung der Beschallung Bedingungen beziehen sich auf Leung Et al. 22.</li> <li>pellet-Zellenrückstand durch Zentrifugieren bei 14.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Die Pellets sollten deutlich verkleinern. Den Überstand durch 100 µM Zelle Sieb filtern und behalten die Durchströmung.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL Puffer B2, die gefilterte überstand. 900 µL dieses Beispiels wird im Schritt 3.4.2 verwendet werden.</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jede Bedingung für die DNA-Isolierung (50 µL oder 1/20 Volumen) und fügen Sie 50 µL 2 x SDS-Bicarb Lösung [siehe Tabelle der Materialien]. Fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Nehmen eine aliquote jeder Bedingung für Eingabe Protein (50 µL oder Volume 1/20) und 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer hinzufügen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° c Verwendung in Schritt 3.5.6.</li>
	</ol></li> <li>Bind biotinylierte DNA zu Streptavidin beschichteten Perlen.
	<ol><li>Bereiten Streptavidin T1 magnetische Beads von 300 µL der Wulst Gülle auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen. Bereiten Sie eine Tube Perlen pro Probe. Wash Perlen 3 X mit 1 mL Puffer B2 durch Vortexen, Aufschwemmen, anwenden ein Magneten um die Perlen zu trennen und Absaugen der Waschpuffer. 
		Hinweis: Optimiert verbindliche Bedingungen führen zu maximaler Ertrag und minimaler Hintergrund verbindlich. Es wurde experimentell festgestellt, dass Streptavidin T1 magnetische Beads eine deutlich höhere Bindungskapazität als Agarose Korne, sowie andere Streptavidin-Perlen und haben weniger Hintergrund verbindlich als Streptavidin C1 Perlen ( Abbildung 4A ).</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL Probe aus Schritt 3.3.4. die gewaschenen Perlen und drehen über Nacht bei 4 ° c 
		Hinweis: Verwenden Sie nicht Wirbel Perlen einmal Probe hinzugefügt wird. 
		Hinweis: Wenn erhebliche Mengen von DNA oder Protein in die unbeschriftete Negativkontrolle isoliert sind, dieser Schritt reduziert werden von Übernachtungen bis 4 h, Hintergrund Bindung zu reduzieren.</li>
	</ol></li> <li>Waschen Perlen und vDNA und damit verbundenen Proteine eluieren. 
	Hinweis: Es wird empfohlen, Filter-Tips für die verbleibenden Schritte zu verwenden.
	<ol><li>Ort-Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, entfernen überstand, Aufschwemmen sanft in 1 mL Puffer B2, drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5.1 dreimal.</li>
		<li>Die Proben in einem magnetischen Microfuge Rohr Rack, überstand zu entfernen, sanft in 1 mL Puffer B3, Aufschwemmen und drehen bei 4 ° C für 5 min.</li>
		<li>Transfer 100 µL Perle Mischung (1/10 th Volumen), eine neue Röhre für gebundene DNA-Isolierung. Gelten diese Röhre für den Magneten, überstand zu entfernen, Perlen in 100 µL 1 x SDS-Bicarb Lösung Aufschwemmen und fahren Sie mit der DNA-Isolierung Protokoll (Schritt 3,6).</li>
		<li>Gelten die Röhrchen mit den restlichen 900 µL Perle Mischung aus Schritt 3.5.3. an den Magnet entfernen überstand und Aufschwemmen Perlen in 50 µL 2 x Laemmli Probenpuffer auf Protein- und DNA-Protein-komplexe eluieren.</li>
		<li>Kochen Proben bei 95 ° C für 15 min, Wirbel, schnell in der Microfuge spin, und Magnet. Eluat zu übertragen, um eine neue Röhre, Flash-Einfrieren und bei-80 ° c 
		Hinweis: Verwendung Kappe Schlösser um sicherzustellen, dass die Rohre nicht pop öffnen während des Kochens. 
		Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und Proben können für mehrere Wochen bei-80 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Analysieren Proteinproben Coomassie blaue Färbung, westliche Beflecken oder Massenspektrometrie von Standardverfahren 25. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5 gezeigt. 
		Hinweis: Um festzustellen, ob Proteinausbeute für Massenspektrometrie ausreicht, 7,5 µL jeder Probe dient zur Analyse von Coomassie blaue Färbung und 7,5 µL für das westliche Beflecken eines repräsentativen viralen Genoms verbundenen Protein (ICP4, ICP8 oder UL42). Das gleiche Volumen von Lysaten von Schritt 3.3.6. Neben Steuern für Eingabe Protein-Ebene ausgeführt werden. Die restlichen Probe (35 µL) wird dann analysiert, durch Masse Spektrometrie wie zuvor beschrieben 25.</li>
	</ol></li> <li>DNA-Isolierung <ol><li>inkubieren Sie die Proben aus Schritte 3.3.5. und 3.5.4. bei 65 ° C für 4-16 h. entfernen probieren von magnetischen Beads, wenn nötig.</li>
		<li>Proben mit 150 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (PCI) zu extrahieren und die wässrige Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.</li>
		<li>Extrahieren den verbleibenden PCI mit 100 µL Tris-EDTA (TE) und einen neuen Schlauch der wässrigen Phase hinzu.</li>
		<li>Extrahieren Proben mit 200 µL Chloroform: Isoamyl Alkohol (24:1).</li>
		<li>Reinigen die wässrige Phase mit dem PCR-Reinigung-Kit nach Angaben des Herstellers &#39; s Protokoll. 
		Hinweis: Die pH-Indikator im Puffer PB schaltet lila, wenn die Probe hinzugefügt. Fügen Sie 10 & #181; L 3M NaOAc pH 5,0 bis den pH-Wert der Probe zu verringern.</li>
		<li>Bestimmen, DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. 
		Hinweis: Dieses Protokoll liefert in der Regel 100-400 ng Wulst-gebundene DNA. Keine DNA sollte erkannt werden, in das Eluat die negativ-Kontrolle in der EdC war nicht in Schritt 1.3 hinzugefügt.</li>
		<li>DNA kann gespeichert werden, in einer niedrigen DNA-Bindung Rohr bei 4 oder -20 ° C und eignet sich für Real-Time PCR oder Hochdurchsatz-Sequenzierung Analyse.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll umfasst mehrere Schritte, die wenn nicht sorgfältig befolgt deutlich reduzierten Proteinausbeute oder Kontamination mit zellulären DNA führen können. Es ist wichtig, dass stationäre Zellen für alle Experimente verwendet werden, um sicherzustellen, dass zelluläre DNA nicht beschriftet und gereinigt ist. Dies kann durch das Fehlen der zellulären DNA-Polymerasen in der Protein-Probe bestätigt werden, weil HSV-1 nicht zelluläre DNA-Polymerase für die Genom-Synthese nutzen. Während EdC Kennzeichnung und Kerne...

Viren haben eine begrenzte Kapazität zur Durchführung von wesentlichen Funktionen und hängt daher Host Faktoren, kritische Aspekte einer Infektion wie virale Genexpression, Replikation, Reparatur, Rekombination und Transport zu erleichtern. Die Aktivitäten dieser Host Faktoren werden oft durch Viral kodierten Proteine ergänzt. Darüber hinaus müssen Viren Erkennung und Störungen durch zelluläre Reaktionen auf virale Infektion vermeiden. Virus-Wirt Interaktionen bestimmen daher das Ergebnis einer Infektion. Von größter Bedeutung ist das Verständnis wie Viren verändern die zelluläre Umgebung anpassen der zelluläre Maschinerie um virale Prozesse zu vereinfachen. Von besonderes Interesse ist die Ermittlung viraler Genome während des ansteckenden Zyklus welche Faktoren und Prozesse einwirken.
Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) ist eine doppelte DNA-Virus gestrandet, die einen wesentlichen Teil der menschlichen Bevölkerung infiziert. Innerhalb der ersten Stunde der Infektion tritt das virale Genom den Zellkern, wo erfolgt eine geordnete Kaskade der viralen Genexpression in Abstimmung mit der viralen DNA (vDNA) Replikation1. Im Zellkern Genome epigenetische Regulierung unterliegen, Reparatur und Rekombination zu unterziehen und in Capsids, verpackt sind, so dass die ersten Nachkommen Virionen innerhalb von weniger als sechs Stunden produziert werden. Die umfassende Auswertung des Virusgenoms verbundenen Proteine im Laufe der Infektion bilden die Grundlage um die molekularen Details der Prozesse zu untersuchen, die auf virale Genom, und bieten einen Einblick in die viralen und zellulären Faktoren engagieren sich in verschiedenen Stadien der Infektion.
Bisherige Methoden zur Untersuchung von Host Faktoren bei der Virusinfektion sind Affinitätsreinigung von viralen Proteinen für die Analyse der damit verbundenen zellulären Proteinen2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. diese Tests wurden für die Identifizierung von zellulären Faktoren maßgeblich Host antivirale Reaktionen sowie virale Chromatin Modifikation, Genexpression, und DNA zu reparieren. Allerdings ist es schwierig, festzustellen, ob Interaktionen richten sich nach der Vereinigung mit vDNA und Proteomics nur Einblick in die Interaktionen, die in Abhängigkeit von den spezifischen viralen Faktor auftreten. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde verwendet, um ermitteln, wo bestimmte virale und zelluläre Proteine binden an viralen Genomen10,11,12,13,14 , 15 und Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (FISH) kombiniert mit Immunocytochemistry ermöglichte die Visualisierung von zellulären Faktoren, die mit vDNA16,17,18, colocalize 19 , 20. diese Assays für die räumliche und zeitliche Analyse zu ermöglichen. Einschränkungen enthalten jedoch die Notwendigkeit hochspezifische Antikörper, begrenzte Empfindlichkeit und die Notwendigkeit einer vorherigen Einblick in Virus-Wirt-Interaktionen. Daher entwickelten wir eine Methode basiert auf iPOND (Isolierung von Proteinen auf die entstehenden DNA)21 und AniPOND (beschleunigte native iPOND)22 selektiv beschriften und reinigen vDNA aus infizierten Zellen für die unvoreingenommene Identifizierung des viralen Genoms damit verbundenen Proteine durch Massenspektrometrie. iPOND hat für die Untersuchung der zellulären Replikation Gabel Dynamik beigetragen.
Für die selektive Reinigung von viraler Genome von infizierten Zellen repliziert vDNA Ethynyl geändert Nukleoside, 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Ethynyl-Winkel2-Deoxycytidine (EdC) (Abbildung 1), gefolgt von kovalenten trägt Konjugation, Biotin-Azid über Klicken Sie Chemie, Einzelschritt Reinigung des viralen Genomen und damit verbundenen Proteine auf Streptavidin beschichteten Perlen (Abb. 2 b) zu erleichtern. Wichtig ist, sind Infektionen in stationären Zellen durchgeführt die nicht in der zellulären DNA-Replikation tätig sind, ermöglichen spezifische Kennzeichnung des vDNA. Des weiteren HSV-1 Infektion verursacht Zellzyklus Festnahme und hemmt zelluläre DNA-Replikation23,24. Virus können prelabeled vor der Infektion für die Analyse von Proteinen verbunden mit eingehenden viraler Genome (Abbildung 1A) oder beschriftet während der DNA-Replikation für die Analyse von Proteinen, die neugebildete vDNA (Abbildung 1 b) zugeordnet werden 25. Darüber hinaus Puls Chase Analyse verwendet werden, zu untersuchen, die Art der Proteine virale Replikation Gabeln (Abbildung 1)26zugeordnet. Darüber hinaus kann Ethynyl geändert vDNA kovalent an ein Fluorophor für räumliche Untersuchung von Proteindynamik (Abb. 2A und Abbildung 3) konjugiert werden. Bildgebung ermöglicht die direkte Visualisierung des vDNA ist ein kostenloses Ansatz für die Validierung des vDNA-Protein-Interaktionen und lässt sich anpassen, virale Genome während Infektion zu verfolgen. Wir erwarten, dass diese Ansätze weiter geändert werden, könnten um jeden Aspekt der herpesviral Infektion, einschließlich Latenz und Reaktivierung, zu studieren und andere DNA-Viren zu studieren. Darüber hinaus könnte Etikettierung mit 5-Ethynyl Uridin (EU) für die Analyse der viralen RNA-Genome ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>MRC-5-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Substituiert mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 12 mM&nbsp; (für das Wachstum in Kolben) oder 30 mM (für das Wachstum in Schalen) Natrium-Bicarbinat</td></tr><tr><td>600 cm2 Gewebekulturschale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricin</td></tr><tr><td>HSV-1 Stamm</td><td></td><td></td><td>Aktien mit Titern größer als 1x109 PFU/mL funktionieren am besten</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp; Säule (PD-10 Entsalzungssäule)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&akut;-Ethinyl-2&akut;-Desoxycytidin (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>In DMSO auflösen, um 40 mM Stamm herzustellen, aliquotiert und bei -20 μg lagern; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&acute;-Desoxycytidin (desoxyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td> In <td>Wasser auflösen, um 40 mM Stamm herzustellen, aliquotieren und bei -20 μg lagern; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclear Extraction Buffer (NEB)</td><td></td><td></td><td>Frisch zubereiten (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Saccharose, 0,5% Igepal)</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Bellco Glas</td><td>7731-22000</td><td>Vor Gebrauch Autoklav</td></tr><tr><td>Trypanblaue Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (vor Gebrauch in sterilem Wasser auf 1x verdünnen)</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>100 mM Vorrat vorbereiten und bei 4 μg lagern; C für bis zu 1 Monat</td></tr><tr><td>(+) Natrium-L-Ascorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>100 mM Vorrat frisch vorbereiten und bis zur Verwendung auf Eis lagern</td></tr><tr><td>Biotinazid</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>10 mM Vorrat in DMSO, aliquot und bei -20 & deg; C für bis zu 1 Jahr&nbsp;</td></tr><tr><td>Klicken Sie auf Reaktionsmischung</td><td></td><td></td><td>Bereiten Sie sich unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge hinzufügen (10 mL: 8,8 mL, 1x PBS, 200 mL, 100 mM CuSO4, 25 mL, 10 mM Biotinazid, 1 mL 100 mM Natriumascorbat)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>In 1 mL Wasser auflösen, um eine 50-fache Brühe herzustellen, kann bei 4 & deg gelagert werden; C für bis zu 1 Woche, oder fügen Sie direkt 1 Tablette zu 50 ml</td></tr><tr><td>Puffer hinzu Gefrierpuffer</td><td></td><td></td><td>Frisch zubereiten (7 mL 100% Glycerin, 3 mL NEB, 200 &mu; L 50x Proteaseinhibitor)</td></tr><tr><td>Puffer B1</td><td></td><td></td><td>Frisch zubereiten (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x Proteaseinhibitor)</td></tr><tr><td>Puffer B2</td><td></td><td></td><td>Frisch zubereiten (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x Proteaseinhibitor)</td></tr><tr><td>Puffer B3</td><td></td><td></td><td>Frisch zubereiten (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x Proteaseinhibitor)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer ausgestattet mit einer 3 mm Mikrospitzensonde</td><td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Probenpuffer</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie 400 mg SDS, 2 mL 100% Glycerin, 1,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) und 10 mg Bromphenolblau in 8 mL Wasser. Lagern bei 4&nbsp; &deg; C für bis zu 6 Monate. Vor Gebrauch 1 M DTT bis zu einer Endkonzentration von 200 mM zugeben.</td></tr><tr><td>Kappenverschlüsse für 1,5-ml-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standard Western Blotting Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOVEX Kolloidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>Autoklav vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td>Vor Gebrauch in 1x PBS auf 3,7 % verdünnen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>3 % in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permeabilisierungspuffer (0,5 % Triton-X 100)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,5 % Triton-X 100 in 1x PBS</td></tr> <tr><td>zubereitenClick-Reaction Cocktail - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10337</td><td>Vorbereiten gemäß dem Protokoll des Herstellers</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Zubereiten 10 mg/ml in Wasser, gelagert bei 4 & deg; C für bis zu 1 Jahr</td></tr><tr><td>Maus Anti-ICP8 Primärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:200 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Maus Anti-UL42 Primärantikörper (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:200 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus 594-konjugierten Sekundärantikörper</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:500 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-Mount</td><td>Thermo Fisher Scientific 9990402</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-Bicarb Lösung</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol</td><td></td><td></td><td>25:24:1 mind. 1 Tag vor Gebrauch, bei 4 & Grad lagern; C im Dunkeln</td></tr><tr><td>Chloroform:Isoamylalkohol</td><td></td><td></td><td>Mindestens 1 Tag vor Gebrauch 24:1 mischen, bei Raumtemperatur dunkel lagern</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8,0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (vor Gebrauch auf 1x verdünnen)</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M Natriumacetat pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2,0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay-Röhrchen</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit Bildgebungssoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge für 1,5-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge für 15- und 50-ml-Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zelle Kultur-Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizblöcke</td><td></td><td></td><td>65 &deg; C und 95 &deg; C</td></tr></tbody></table>

reinigung der viralen dna für die identifizierung von assoziierten viralen und zellulären proteinen

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Das Ziel dieses Protokolls ist um zu isolieren, Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) DNA aus infizierten Zellen für die Identifizierung von verbundenen viralen und zelluläre Proteinen durch Massenspektrometrie. Obwohl die Proteine, die Interaktion mit viraler Genome Hauptrollen in den Ausgang der Infektion spielen, war eine umfassende Analyse des Virusgenoms verbundenen Proteine nicht früher möglich. Hier zeigen wir eine Methode, die die direkte Reinigung von HSV-1 Genomen von infizierten Zellen ermöglicht. Virale DNA Replikation wird selektiv mit NUK gekennzeichnet, die eine Alkinen funktionelle Gruppe enthalten. Beschrifteten DNA wird ausdrücklich und unwiderruflich beschriftet über die kovalente Befestigung der Biotin-Azid über ein Kupfer (I)-Azid-Alkinen Cycloaddition oder Klick Reaktion katalysiert. Biotin-markierten DNA wird auf Streptavidin beschichteten Perlen gereinigt und damit verbundenen Proteine sind eluiert und durch Massenspektrometrie identifiziert. Diese Methode ermöglicht die selektive Ausrichtung und Isolierung von HSV-1-Replikation Gabeln oder ganzer Genome von komplexen biologischen Umgebungen. Darüber hinaus ermöglicht die Anpassung dieses Ansatzes zur Untersuchung der verschiedenen Aspekte der herpesviral Infektion, sowie die Prüfung der Genome von anderen DNA-Viren.

Die Verwendung von Klick-Chemie zur Reinigung von DNA aus Zellen wurde zuerst durch die iPOND Methode21erreicht. IPOND soll zellulären Replikation Gabeln für die Identifizierung von assoziierten Proteinen zu reinigen. Wir haben diese Technik, um speziell vDNA-Protein-Interaktionen während der Infektion studieren angepasst. Manipulation des Ansatzes für die virale Genome mit EdC (Abbildung 1), kombiniert mit synchronisierten Infektionen...

Das Ziel dieses Protokolls ist speziell markieren und virale DNA aus infizierten Zellen für die Charakterisierung des Virusgenoms verbundenen Proteine selektiv zu isolieren.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Aufreinigung der DNA des Herpes-simplex-Virus Typ 1 aus infizierten Zellen für die proteomische Analyse von viralen Genom-assoziierten Proteinen. Diese Methode liefert wichtige Einblicke in die Beteiligung zellulärer Faktoren und Herpesvirusinfektionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie so angepasst werden kann, dass sie verschiedene Populationen viraler DNA direkt von infizierten Zellen aufreinigt, was die Analyse mehrerer Aspekte der Infektion ermöglicht.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Kultivierung von fünf MRC-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie dann HSV-1 in kalter, trisgepufferter Kochsalzlösung oder TBS. Für die folgenden Schritte ist es wichtig, das Gebläse und die Gewebekulturhaube auszuschalten, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.Verwenden Sie eine Pipette, um das Wachstumsmedium von den MRC 5-Zellen in eine sterile Flasche zu übertragen, um es nach der Infektion wieder in die Zellen zu geben. Infizieren Sie die Zellen, indem Sie den Zellen sieben Milliliter verdünntes Virus hinzufügen. Schütteln Sie die Zellen alle 10 Minuten für eine Stunde bei Raumtemperatur.Nach der R

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Genom der Influenza A-Virus besteht aus acht separaten Komplexen von RNA und Proteinen, genannt virale Ribonukleoproteinkomplexe (vRNPs). Dieses Papier beschreibt die Glycerin Gradientenreinigung und Transmissionselektronenmikroskopie Visualisierung von Influenza-A-vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

Wir beschreiben den Prozess der Isolierung hochreiner Herpesvirus Nukleokapsid DNA aus infizierten Zellen. Die endgültige DNA aus der Lösung erfasst ist von hoher Konzentration und Reinheit und ist damit ideal für Hochdurchsatz-Sequenzierung, high fidelity PCR-Reaktionen, und Transfektionen neue virale Rekombinanten produzieren geeignet.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Einzel-Virus Genomics (SVG) ist eine Methode zur Isolierung und verstärken die Genome einzelner virons. Virussuspensionen einer gemischten Anordnung sortiert werden mittels Durchflusszytometrie auf einen Objektträger mit diskreten Vertiefungen, Agarose, wodurch die Erfassung des Virions und Verringerung Genom Scherung während der Weiterverarbeitung. Amplifikation des gesamten Genoms erfolgt über mehrere Displacement Amplification (MDA), was genomische Material, das für die Sequenzierung...

Isolation und Genomanalyse Einzel Virionen mit &#39;Single Virus Genomics&#39;

Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Quelle: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Reinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viraler und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Infektion von Mammalian-Zellen in der stationären Phase mit HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), gefolgt von der Replikation des viralen Genoms unter Verwendung der Wirt- und Virusreplikationsmaschinerie. Ein synthetisches Nukleosidanalogon wird in die neu synthetisierte virale DNA eingebaut, um replizierende Genome zu markieren,...

Markierung replizierender HSV-1-Genome mit einem Nukleosidanalogon

Quelle: Dembowski, J. A., et al. Aufreinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viral bedingter und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Isolierung von Protein–virale DNA-Komplexen aus Zellkernen mithilfe der Click-Chemie und der Reinigung mit magnetischen Bäden. Das Protokoll umfasst die Markierung viraler Genome mit alkinmodifizierten Nukleotiden, die Biotinylierung über eine Click-Reaktion und die Bindung an mit Streptavidin beschichtete...

Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

Quelle: Gao, Y., et al. Erzeugung und Assemblierung virus-spezifischer Nukleokapside des Respiratorischen Synzytial-Virus. J. Vis. Exp. (2021)Das Video zeigt die In-vitro-Assemblierung virus-spezifischer Nukleokapside aus einem gereinigten, RNA-freien Nukleoprotein-Phosphoprotein-Komplex, deren Aufreinigung mittels Größenausschlusschromatographie und die Validierung von vollständiger viralen RNA innerhalb der assemblierten Partikel.

In-vitro-Rekonstitution und Reinigung von viralen nukleokapsidähnlichen Partikeln

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Erfahren Sie die Reinigung von HSV-1-DNA aus infizierten Zellen für die Proteomanalyse viraler Genom-assoziierter Proteine. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Faktoren bei Herpesvirus-Infektionen.

Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

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