Reinigung der viralen DNA für die Identifizierung von assoziierten viralen und zellulären Proteinen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Aufreinigung der DNA des Herpes-simplex-Virus Typ 1 aus infizierten Zellen für die proteomische Analyse von viralen Genom-assoziierten Proteinen. Diese Methode liefert wichtige Einblicke in die Beteiligung zellulärer Faktoren und Herpesvirusinfektionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie so angepasst werden kann, dass sie verschiedene Populationen viraler DNA direkt von infizierten Zellen aufreinigt, was die Analyse mehrerer Aspekte der Infektion ermöglicht.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Kultivierung von fünf MRC-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verdünnen Sie dann HSV-1 in kalter, trisgepufferter Kochsalzlösung oder TBS. Für die folgenden Schritte ist es wichtig, das Gebläse und die Gewebekulturhaube auszuschalten, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.

Verwenden Sie eine Pipette, um das Wachstumsmedium von den MRC 5-Zellen in eine sterile Flasche zu übertragen, um es nach der Infektion wieder in die Zellen zu geben. Infizieren Sie die Zellen, indem Sie den Zellen sieben Milliliter verdünntes Virus hinzufügen. Schütteln Sie die Zellen alle 10 Minuten für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Nach der Resorption aspirieren Sie das Innokulum, spülen die Zellen mit 50 Millilitern TBS bei Raumtemperatur und ersetzen Sie das ursprüngliche Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in Gegenwart von 5 % Kohlendioxid. Nach Beginn der viralen DNA-Replikation, etwa vier Stunden nach der Infektion, markieren Sie die replizierende virale DNA.

Verdünnen Sie dazu EdC in einem Milliliter Wachstumsmedium und geben Sie es für zwei bis vier Stunden in das Zellkulturmedium infizierter Zellen. Um Kerne zu ernten, ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch 20 Milliliter Kernextraktionspuffer und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit gelegentlichem Schaukeln. Nach der Inkubation kratzen Sie die Kerne mit einem Zellschaber von der Platte ab und geben sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis.

10 Minuten bei 2.500 x g und vier Grad Celsius zentrifugieren, um die Zellkerne zu pelletieren. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Das Kernpellet wird vorsichtig in 10 Milliliter Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS gelöst und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Zentrifugieren Sie dann die Probe wie zuvor. Nachdem Sie das PBS vollständig entfernt haben, suspendieren Sie das Kernpellet wieder in 10 Millilitern Click-Reaktions-Mix, indem Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren. Drehen Sie die Probe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Kerne wie zuvor pelletieren.

Entfernen Sie die Schnellreaktionsmischung vollständig und waschen Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig wieder in 10 Milliliter PBS suspendieren und erneut zentrifugieren. Nun wird das Kernpellet vorsichtig wieder in einem Milliliter PBS suspendiert und die Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren das PBS vollständig und frieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff schockfrosten.

Zu diesem Zeitpunkt kann das Pellet bei 80 Grad Celsius gelagert oder der Vorgang fortgesetzt werden. Um die Zellkerne zu lysieren und die DNA zu fragmentieren, werden die aufgetauten Zellkerne in 500 Mikrolitern Puffer B1 durch Auf- und Abpipettieren wieder suspendiert. Inkubieren Sie die Suspension 45 Minuten lang auf Eis.

Dann beschallen Sie die Proben sechsmal für jeweils 30 Sekunden bei 40 % Amplitude mit einer Drei-Millimeter-Mikrospitzensonde. Legen Sie die Proben zwischen den Impulsen mindestens 30 Sekunden lang auf Eis. Nach der Beschallung sollten die Proben klar und nicht trüb erscheinen.

Pelletieren Sie die Zelltrümmer, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 14.000 x G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die Pelletgröße sollte erheblich abnehmen, den Überstand durch ein 100-Mikron-Zellsieb filtrieren und den Durchfluss beibehalten. Geben Sie dann 500 Mikroliter Puffer B2 in den gefilterten Überstand.

Um die biotinylierte DNA an Streptavidin-beschichtete Kügelchen zu binden, bereiten Sie die magnetischen Streptavidin-Kügelchen vor, indem Sie 300 Mikroliter Bead-Slurry in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bereiten Sie ein Röhrchen Kügelchen pro Probe vor. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Milliliter Puffer B2, indem Sie sie zum Re-Suspendieren vortexen, auf einen Magneten auftragen, um die Kügelchen zu trennen, und den Waschpuffer ansaugen.

Geben Sie dann 900 Mikroliter der Probe zu den gewaschenen Kügelchen. Der Rest der Probe wird für die Isolierung von DNA und Proteinen verwendet. Drehen Sie die Aufhängung über Nacht bei vier Grad Celsius.

Legen Sie die Proben am nächsten Tag in ein magnetisches Mikrofugenröhrchengestell und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig wieder in einem Milliliter Puffer B2, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius drehen. Entfernen Sie den Überstand wieder mit dem magnetischen Mikrofuge-Röhrchengestell.

Diesmal die Kügelchen vorsichtig wieder in einen Milliliter Puffer B3 einschichten und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius drehen. Nachdem Sie den Überstand mit dem Magneten aus der Bead-Mischung entfernt haben, suspendieren Sie die Beads in 50 Mikrolitern 2x Laemmli-Probenpuffer erneut, um DNA-Proteinkomplexe anzudeuten. Anschließend kochen Sie die Proben 15 Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Eine Mischung vortexen, bevor die Proben schnell in einer Mikrofuge gedreht werden. Geben Sie die Proben auf den Magneten und übertragen Sie das Kontingent in ein neues Röhrchen. Zum Schluss frieren Sie die Proben im Schockfrost ein und lagern sie bei 80 Grad Celsius.

Führen Sie die Proteinanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die EdC-Markierung wurde für null, 20, 40 oder 60 Minuten durchgeführt, gefolgt von der Aufreinigung der viralen DNA und der zugehörigen Proteine. Die eluierten Proteine wurden einer Coomassie-Blau-Färbung und einem Western-Blot mit dem Antikörper ICP4 und UL42 unterzogen, der spezifisch für virale DNA-Bindungsproteine ist.

Der Pfeil zeigt Streptavidin an, das während der Elution von den Kügelchen entfernt wurde und unter allen Bedingungen vorhanden ist. Proteine, die auf diese Weise isoliert werden, werden anschließend einer Massenspektrometrie unterzogen. Das Tortendiagramm zeigt die Anzahl der Proteine in jeder funktionellen Kategorie, die sechs Stunden nach der Infektion im Genom mit dem Herpes-simplex-Virustyp assoziiert waren.

Ein genauerer Blick auf die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen identifizierten Proteinen wurde mit Hilfe der Datenbank des String-Functional Protein Association Network durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen Unterkomplexe von Proteinen, die im selben biologischen Prozess zusammenarbeiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale DNA aus infizierten Zellen für die proteomische Untersuchung von viralen Genom-assoziierten Proteinen aufgereinigt werden kann.

Diese Technik kann in drei bis vier Tagen abgeschlossen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um eine DNAse- oder Proteasekontamination der Proben zu verhindern. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um die Art der EdC-markierten viralen DNA zu überprüfen.

Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der Herpesvirologie den Weg geebnet, um die Funktionen von Wirtsproteinen und Virusinfektionen zu erforschen.