Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Metabolismus mehrerer Nährstoffquellen mit Hilfe von markierten Substraten quantitativ zu untersuchen. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, das Schicksal der verbrauchten Nährstoffe und den metabolischen Ursprung von Verbindungen, die von Hefen synthetisiert werden, zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des mikrobiellen Stoffwechsels zu beantworten, z. B. wie der gesamte Stoffwechsel in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen funktioniert.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Aufklärung und Quantifizierung des Proteins der Nährstoffverteilung aus mehreren Quellen ermöglicht. Diese Methode wurde verwendet, um den Stickstoffstoffwechsel von Hefen zu untersuchen, kann aber auch auf andere Stoffwechsel und Mikroorganismen angewendet werden. Der Schlüssel zum Erfolg dieses Experiments liegt in der Reproduzierbarkeit der Fermentationen.

Die Benutzer müssen besonders darauf achten, dass die Zellen im gleichen definierten physiologischen Stadium gesammelt werden. Das Verfahren wird von Christian Picou aus unserem technischen Team, Pauline Seguinot, einer Doktorandin aus dem Labor, und Stephanie Rollero, einer Postdoktorandin, demonstriert. Jedes für jede Stickstoffquelle vorbereitete synthetische Medium wird in einem Autoklaven in einem Ein-Liter-Kolben pasteurisiert, der einen magnetischen Rührstab enthält.

Lösen Sie die entsprechende Menge des markierten Moleküls auf, um die gewünschte Endkonzentration im Medium zu erreichen. Sterilisieren Sie das Medium mit einem Einweg-Vakuumfiltersystem. Verteilen Sie das Medium mit einem sterilen Messzylinder auf zwei vorsterilisierte Fermenter, die einen magnetischen Rührstab enthalten und mit Fermentationsschleusen ausgestattet sind, um das Eindringen von Sauerstoff zu verhindern, aber die Freisetzung von Kohlendioxid zu ermöglichen.

Nachdem Sie einen Cerevisiae-Stamm in YPD-Medium gezüchtet haben, entnehmen Sie ein Vorkultur-Aliquot unter laminarer Strömung und quantifizieren Sie die Zellpopulation mit einem elektronischen Partikelzähler, der mit einer 100-Mikrometer-Apertur ausgestattet ist. Nach dem Zentrifugieren der Vorkultur wird das Pellet in einem geeigneten Volumen sterilen Wassers suspendiert, um eine Endkonzentration von 2,5 mal 10 bis 9 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Beimpfen Sie dann jeden Fermenter mit einem Milliliter der Zellsuspension.

Bereiten Sie anschließend eine Gärplattform vor, indem Sie die Fermenter in die Stützführungen einbauen, die ordnungsgemäß auf den 21-stufigen Rührplatten platziert sind, und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 270 U/min ein. Um die Online-Überwachung jeder Fermentation zu starten, starten Sie die Robotersteuerungsanwendung, klicken Sie auf die Schaltfläche Assay starten und wählen Sie das durchzuführende Fermentationsvolumen aus. Um sicherzustellen, dass die angezeigte Oberfläche die Anzeige der Anzahl und der Position der Fermenter auf der Plattform ermöglicht, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Steckplatzposition und wählen Sie Deaktivieren, um die Überwachung der Leerpositionen zu deaktivieren.

Um die Berechnungssoftware zu initialisieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisierer und bestätigen Sie mit OK. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Start der Robotersteuerungsanwendung, um die Gewichtserfassung zu starten. Als nächstes zentrifugieren Sie zwei Sechs-Milliliter-Proben, die aus den Fermentern entnommen wurden, fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, geben Sie jeden gefrorenen Überstand in zwei Röhrchen und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.

Waschen Sie jedes Pellet zweimal mit fünf Millilitern destilliertem Wasser und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für die Messung der Isotopenanreicherung. Geben Sie 200 Mikroliter einer 25%igen Sulfosalicylsäurelösung, die 2,5 millimolare Norleucin als internen Standard enthält, zu 800 Mikrolitern Probe, um Moleküle mit hohem Molekulargewicht zu entfernen. Nach der Inkubation und Zentrifugation filtrieren Sie die Mischung durch eine 0,22 Mikrometer große Nitrozellulosemembran und geben Sie die Probe in ein Aminosäureanalysesystem.

Klicken Sie im Programm oder in der Software des Analysesystems auf die Schaltfläche Ausführen, um die flüssigchromatographischen Analysen mit dem Analysator zu starten, der mit einer Kationenaustauschsäule ausgestattet ist. Als nächstes bereiten Sie einen oxidierten Extrakt vor, indem Sie ein zuvor vorbereitetes markiertes Zellpellet in 200 Mikrolitern performiner Säure suspendieren. Nach vierstündiger Inkubation bei vier Grad Celsius stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 33,6 Milligramm Natriumsulfat hinzufügen.

Geben Sie 800 Mikroliter sechs normale Salzsäure zu dem oxidierten Extrakt und inkubieren Sie die Probe in einem hermatisch verschlossenen Glasröhrchen 16 Stunden lang bei 110 Grad Celsius in einem Ofen mit trockener Hitze. Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen ließen, fügen Sie 200 Mikroliter 2,5 millimolare Neuroleucins hinzu und entfernen Sie das Chlorwasserstoffgas mit einem Stickstoffstrom. Waschen Sie den getrockneten Extrakt zweimal mit 800 Mikrolitern destilliertem Wasser und dann mit 800 Mikrolitern Ethanol.

Fügen Sie dann dem Extrakt 800 Mikroliter 200-millimolaren Lithiumacetatpuffer hinzu. Bestimmen Sie die relativen Konzentrationen von Aminosäuren in Proteinen in der Probe mit der zuvor beschriebenen chromatographischen Methode. Hydrolysieren Sie ein markiertes Zellpellet, indem Sie 1,2 Milliliter sechsmolare Salzsäure hinzufügen und die Probe 16 Stunden lang bei 105 Grad Celsius in einem dicht verschlossenen Glasröhrchen in einem Ofen mit trockener Hitze inkubieren.

Nachdem Sie die Probe auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie 1,2 Milliliter destilliertes Wasser hinzu. Nach der Zentrifugation zur Entfernung der Zelltrümmer verteilen Sie den Überstand in sechs 400-Mikroliter-Fraktionen in offenen Glasröhrchen. Trocknen Sie die Fraktionen im trockenen Backofen bei 105 Grad Celsius für vier bis fünf Stunden, bis sie die Konsistenz von Sirup erreicht haben.

Während der Biomassehydrolyse trocknet man die Fraktion bis zur Konsistenz eines Sirups, indem man die Betriebssäure häufig kontrolliert. Für die ECF-Derivatisierung lösen Sie das abgekühlte getrocknete Hydrolysat in 200 Mikrolitern 20-Millimolar-Salzsäure und 133 Mikrolitern eines Ein- bis Vierfachgemisches aus Pyridin und Ethanol. Fügen Sie 50 Mikroliter Ethylchlorformiat hinzu, um die Aminosäuren zu derivatisieren.

Nachdem das Kohlendioxid freigesetzt wurde, überführen Sie das Gemisch in Zentrifugenröhrchen, die 500 Mikroliter Dichlormethan enthalten, um die derivatisierten Verbindungen zu extrahieren. Die Proben 10 Sekunden lang vortexen. Nach einer vierminütigen Zentrifugation bei 10.000 G wird die untere organische Phase jeder Probe mit einer Pasteur-Pipette entnommen und in ein GC-Autosampler-Fläschchen umgefüllt, das einen konischen Glaseinsatz enthält, so dass jede Probe direkt in das GCMS-Instrument injiziert werden kann.

Für das ECF-Verfahren werden HPLC-Derivatisierungsreagenzien verwendet. Wechseln Sie häufig die ECF-Reagenzien. Für die DMF-DMA-Derivatisierung lösen Sie das getrocknete Hydrolysat in 50 Mikrolitern Methanol und 200 Mikrolitern Acetonitril.

Fügen Sie 300 Mikroliter DMF-DMA hinzu und wirbeln Sie die Probe vortex. Übertragen Sie dann die Probe in ein GC-Autosampler-Fläschchen, das einen konischen Glaseinsatz enthält. Für die BSTFA-Derivatisierung suspendieren Sie das Hydrolysat in 200 Mikrolitern Acetonitril.

Geben Sie 200 Mikroliter BSTFA in die Probe und verschließen Sie das Glasröhrchen hermatisch. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 135 Grad Celsius wird der abgekühlte Extrakt direkt in ein GC-Autosampler-Fläschchen überführt, das einen konischen Glaseinsatz enthält. Analysieren Sie nun die Proben mit einem Gaschromatographen, der mit einem Autosampler-Injektor ausgestattet und an ein Massenspektrometer gekoppelt ist.

Klicken Sie im Menü der Computersoftware auf Instrument. Klicken Sie auf der Registerkarte Sequenz auf die Beispielprotokolltabelle bearbeiten, um eine Beispielliste zu erstellen, und klicken Sie auf Ausführen und Sequenz ausführen, um die Injektionen zu starten. Nachdem die Analysen abgeschlossen sind, zeichnen Sie für jede Aminosäure einen Cluster von Intensitäten auf, der ihren unterschiedlichen Massenisotopomeren entspricht.

Geben Sie 10 Mikroliter der entsprechenden deuterierten internen Standards zu fünf Millilitern Überstand in einem 15-Milliliter-Glasröhrchen. Fügen Sie einen Milliliter Dichlormethan hinzu, verschließen Sie das Röhrchen fest und schütteln Sie die Probe auf einer Wippplattform 20 Minuten lang. Nach der Zentrifugation wird die untere organische Phase in einem 15-Milliliter-Glasröhrchen gesammelt.

Nach Wiederholung der Dichlormethan-Extraktion den organischen Extrakt über 500 Milligramm wasserfreies Natriumsulfat trocknen und die flüssige Phase mit einer Pasteur-Pipette auffangen. Konzentrieren Sie den Extrakt unter Stickstofffluss um den Faktor vier. Übertragen Sie dann die konzentrierte Probe in ein GC-Autosampler-Fläschchen.

Für die GCMS-Quantifizierung injizieren Sie zwei Mikroliter Probe mit einem Split-Verhältnis von 10 zu eins und trennen Sie die extrahierten flüchtigen Moleküle unter Verwendung des entsprechenden Ofentemperaturprofils. Geben Sie mithilfe der Tabellenkalkulationen im Textprotokoll die Rohdatenwerte ein, die der Konzentration der extrazellulären Aminosäuren, dem Trockengewicht der Zellen, dem Proteingehalt der Zellen, der Konzentration flüchtiger Moleküle und der Isotopenanreicherung von proteinogenen Aminosäuren und flüchtigen Molekülen entsprechen. Ein schematisches Diagramm des Arbeitsablaufs zur Untersuchung des Managements der verschiedenen Stickstoffquellen, die während der Weingärung gefunden werden, durch Hefe ist hier dargestellt.

Für verschiedene Probenahmepunkte zeigen die biologischen Parameter eine hohe Reproduzierbarkeit unter den Fermenationen. Hier wird ein Überblick über die Umverteilung von Stickstoff aus den Quellen im Traubensaft zu allen proteinogenen Aminosäuren gezeigt. In Kombination mit der Bestimmung der Massenbilanzen lieferte die Messung der Isotopenanreicherung proteinogener Aminosäuren die erste Quantifizierung des Beitrags von stickstoffbasiertem Arginin, Glutamin, Ammonium und anderen Quellen zu den Amingruppen jeder dieser Verbindungen.

Ein Vergleich zwischen der Menge der verbrauchten Aminosäure, die direkt in die Biomasse zurückgeführt wird, wird hier dargestellt. Die Aufteilung der konsumierten aliphatischen Aminosäuren, Leucin und Valin im metabolischen Netzwerk in Hefe ist hier dargestellt. Mehr als 96% des konsumierten Valins und Leucins werden in ihren Umwandlungsprodukten zurückgewonnen.

Überraschenderweise wird ein erheblicher Teil von Valin und Leucin katabolisiert, obwohl ein erhebliches Ungleichgewicht zwischen der Verfügbarkeit dieser Verbindungen im Medium und ihrem Gehalt in der Biomasse besteht. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Tagen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, den Markierungsteil des Substrats entsprechend den wissenschaftlichen Fragestellungen sorgfältig auszuwählen.

Um eine gute biologische Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, führen Sie die Fermentation und die chromatographische Analyse in doppelter Ausführung durch. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie, um zu erforschen, wie sich der Stoffwechsel und die Physiologie von Mikroorganismen in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen ändern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Derivatisierungsreagenzien und Argininlösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann, daher sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten unter einem Abzug getroffen werden.