Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Hallo, ich bin Eric Gottwald und Wissenschaftler am Institut für Biologische Grenzflächen des Ware-Instituts für Technologie. Heute möchte ich Ihnen unser chipbasiertes perfundiertes Mikro-Bioaktiv-System vorstellen. Bevor wir den Chip in Zellkultur-Anwendungen verwenden können, müssen wir das Polymer hydrolysieren und den mikrostrukturierten Bereich entfetten.

Dies wird erreicht, indem der Chip einfach in verschiedene Konzentrationen von Isopropanol getaucht wird, beginnend mit 100 %. Der Chip wird jeweils nur wenige Sekunden in jede Konzentration eingetaucht, und der letzte Schritt erfolgt lediglich mit Wasser. Anschließend wird der Chip getrocknet und schließlich muss er mit einer Kollagenlösung beschichtet werden, um die Anheftung der Zellen an das Polymer zu erleichtern. Dies geschieht, indem einige Tropfen einer Kollagenlösung auf den mikrostrukturierten Bereich aufgetragen werden. In diesem Zustand wird der Chip über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Nach der Übernacht-Inkubation mit der Kollagen-Eins-Lösung wird die Lösung entfernt und der Chip mit steriler PBS gewaschen. Anschließend wird auch die PBS entfernt, und der Chip ist nun bereit für die Inokulation der Zellen. Nun werden wir den Zellchip mit einer Suspension einzelner Zellen beimpfen, indem einfach 150 Mikroliter Zellsuspension auf den mikrostrukturierten Bereich gegeben werden. Nach der Aufbringung der Zellen wird der Chip drei Stunden bei 37 Grad in einem Inkubator inkubiert.

Nach der dreistündigen Inkubationszeit wird der Chip aus dem Inkubator entnommen und ist nun bereit für die Einfügung in den Ektor. Dazu wird der Ektor aus seiner sterilen Verpackung entnommen, wobei die Sterilität durch Gamma-Bestrahlung dieser Transparenzfolie erreicht wird. Wir müssen also lediglich die Verpackung öffnen und den Ektor herausnehmen.

Als Nächstes werden wir die Öffnung der Flasche in dieses Medium-Reservoir einführen, um das Bioreaktorgehäuse demontieren zu können, um den Chip einzusetzen. Nachdem das Bioreaktorgehäuse geöffnet wurde, kann der Chip nun eingefügt werden, indem man ihn einfach in die Nut des Bioreaktorgehäuses legt; anschließend kann der Bioreaktor wieder zusammengebaut werden. Abschließend müssen wir zwei sterile Filter an das Medium-Reservoir sowie einen sterilen Probenahmeanschluss anschließen.

Zur Messung der tatsächlichen Sauerstoffspannung in der geschlossenen Zirkulationsschleife werden wir zwei Sauerstoffsensoren einfügen, indem wir sie einfach zwischen diese beiden Anschlüsse montieren. Der Bactor ist nun bereit, mit Kulturmedium befüllt zu werden. Das Bactor-System ist jetzt einsatzbereit, um mit Zellkulturmedium gefüllt zu werden, was erreicht wird, indem man die geschlossene Zirkulationsschleife einfach mit der Rollerpumpe verbindet.

Dadurch werden wir gleichzeitig den gesamten Bactor-Kreislauf reduzieren. Wie Sie hier im Ector-Fenster sehen können, steigt das Medium von unten kommend immer weiter an und verlässt den Bactor an der Oberseite. Bevor wir das Bactor-System in den Inkubator stellen, überprüfen wir die blasenfreie Befüllung der Zirkulationsschleife.

Jetzt ist das System vollständig mit Zellkulturmedium gefüllt, und wir können den Bioreaktor in den Inkubator überführen. Nun werden wir den Bioreaktor in die Inkubationskammer stellen. Dazu wird der Bioreaktor zunächst, wie Sie bereits kurz zuvor gesehen haben, an die Rollerpumpe angeschlossen, und nun wird der Bioreaktor kontinuierlich mit Medium aus der Flasche perfundiert.

Und um die Umgebungssauerstoffkonzentration aufrechtzuerhalten, verbinden wir das Mediumreservoir mit der Gasversorgung. Schließlich schließen wir zwei Sauerstoffsensoren an den Kreislauf an, um die Sauerstoffspannung im System kontinuierlich zu überwachen. Nun ist der Versuchsaufbau abgeschlossen und kann so lange laufen, wie es das Experiment vorsieht.

Eines der leistungsfähigsten Werkzeuge bei der Analyse der organotypischen Funktionen der Zellen innerhalb der MicroCon-Behälter ist das Laser-Scanning-Mikroskop, das Sie hier sehen. Das Laser-Scanning-Mikroskop ermöglicht es uns, in jeden einzelnen MicroCon-Behälter zerstörungsfrei hineinzublicken. Und da die MicroCon-Behälter oder der Chip für konventionelle Immunfärbungs- und Immunfluoreszenzmethoden verwendet werden können, sind wir in der Lage, alle Arten von Markern und organotypischen Funktionen innerhalb der Mikrobehälter nachzuweisen.

Wie Sie hier in der Animation dieses Chips sehen können, ist der Boden vollständig mit Zellen gefüllt, ebenso wie die Wände des MicroCon-Behälters. Wir verfügen über eine große Menge an Zellen, die sehr lebendig sind, und nur über sehr, sehr wenige tote Zellen. Das nächste Bild zeigt, dass wir alle Arten von organotypischen Funktionen innerhalb des MicroCon-Behälters nachweisen können.

Zum Beispiel bei Hepatozyten die Albumin-Produktion oder die Expression von E, die man in den Zellen erkennen kann, was hier gut in der Überlagerung sichtbar ist. Die Kerne sind blau angefärbt. Das Eko hier ist grün angefärbt, und das Albumin wird beziehungsweise ist rot angefärbt.

Und wie Sie hier schön sehen können, werden alle organotypischen Funktionen, die man von Hepatozyten erwartet, in dieser Art von 3D-Kultur gut exprimiert. Außerdem haben wir einen weiteren Hepatozyten-Marker untersucht, nämlich Cytokeratin 18, und dieses Bild zeigt, dass Cytokeratin 18 in solchen Kulturen ebenfalls gut exprimiert wird. Dies wird hoffentlich überzeugend belegen, dass diese Art von organotypischen Funktionen auch für andere organotypische Kulturen nützlich sein könnte.

Nach Beendigung des Biore-Experiments kann der Chip zur Isolierung aller Arten zellulärer Bestandteile verwendet werden, beispielsweise zur Gewinnung von Gesamt-RNA. Wie hier gezeigt, stellen wir Ihnen die aus dem Bioreaktorsystem isolierte Gesamt-RNA vor. Diese Gesamt-RNA kann anschließend für nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise Echtzeit-PCR oder, wie hier zu sehen, Mikroarray-Analysen.

Außerdem können intakte Zellen aus dem System isoliert und anschließend für die konventionelle Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden. Wie Sie hier sehen können, hoffe ich, dass wir Ihnen zeigen konnten, dass das System für alle möglichen Anwendungen nützlich sein könnte, bei denen organotypische Reaktionen erforderlich sind, und dass es möglicherweise auch für jene Anwendungen nützlich ist, die wir bisher noch nicht in Betracht gezogen haben, wie beispielsweise Anwendungen mit Stammzellen.