Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Hallo, ich bin Eric Gottwald und ich bin Research Scientist am Institute for Biological Interfaces des Ware Institute of Technology. Und heute möchte ich Ihnen unser chipbasiertes perfundiertes mikrobioaktives System vorstellen. Bevor wir den Chip in Zellkulturanwendungen verwenden können, müssen wir das Polymer hydrolysieren und den mikrostrukturierten Bereich herabsetzen.

Dies wird erreicht, indem der Chip einfach in eine andere Konzentration von Isopropanol getaucht wird, beginnend mit 100%Ich tauche den Chip nur wenige Sekunden in jede Konzentration und der letzte Schritt ist nur Wasser. Danach wird der Chip getrocknet und schließlich müssen wir den Chip mit einem Kollagen beschichten, einer Lösung, um die Adhäsion der Zellen an das Polymer zu erleichtern. Dazu werden nur ein paar Tropfen eines Kollagens, eine Lösung, auf die mikrostrukturierte Fläche getropft, und in diesem Zustand wird der Chip über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.

Nach der Inkubation über Nacht mit der Kollagen-Eins-Lösung wird die Lösung entfernt und der Chip mit sterilem PBS gewaschen. Danach wird auch das PBS entfernt und der Chip ist nun bereit für die Inokulation der Zellen. Jetzt impfen wir das Zellschiff mit einer Suspension aus einzelnen Zellen, und dies geschieht, indem wir einfach 150 Mikroliter Zellsuspension auf den mikrostrukturierten Bereich geben. Nach der Abscheidung der Zellen wird der Chip drei Stunden lang bei 37 Grad in einem Inkubator inkubiert.

Nach der dreistündigen Inkubationszeit wird der Chip aus dem Inkubator entnommen und ist nun bereit für den Einsatz in den Ektor. Dazu wird der Ektor aus seiner sterilen Verpackung entnommen und die Sterilität durch Gammabestrahlung dieser transparenten Folie erreicht. Wir müssen also nur die Verpackung öffnen und den Ector entfernen.

Als nächstes werden wir den Deckel der Flasche in dieses Mediumreservoir einsetzen, damit wir das Bioreaktorgehäuse für das Einsetzen des Chips zerlegen können. Nachdem wir das Bioreaktorgehäuse geöffnet haben, können wir nun den Chip einsetzen, was erreicht wird, indem wir den Chip einfach in die Nut des Bioreaktorgehäuses legen und der Baktor kann nun wieder zusammengebaut werden. Was wir schließlich noch tun müssen, ist, dass wir Sterilfilter an das Mediumreservoir und einen sterilen Probenahmeanschluss anschließen müssen.

Für die Messung der tatsächlichen Sauerstoffspannung im geschlossenen Kreislauf werden wir zwei Sauerstoffsensoren einsetzen, indem wir sie einfach zwischen diesen beiden Anschlüssen montieren. Der Bactor ist nun bereit für die Befüllung mit Nährboden. Das Bactor-System ist nun bereit für die Befüllung mit Zellkulturmedium, und dies wird durch einfaches Verbinden des geschlossenen Kreislaufs mit der Rollenpumpe erreicht.

Auf diese Weise werden wir gleichzeitig die gesamte Bactor-Zirkulation herabsetzen. Wie Sie hier im Ector-Fenster sehen können, können Sie sehen, wie das Medium von unten nach oben kommt, sich hebt und hebt und den Baktor oben verlässt. Bevor wir das Bactor-System in den Inkubator einsetzen, kontrollieren wir die blasenfreie Befüllung des Kreislaufs.

Nun ist das System komplett mit Zellkulturmedium befüllt und wir können den Bioreaktor in den Inkubator überführen. Nun setzen wir den Birektor in die Inkubationskammer. Und dafür wird zunächst der Birektor mit der Rollenpumpe verbunden, wie Sie bereits kurz zuvor gesehen haben, und nun wird der Ektor aktiv von diesem Medium aus der Flasche durchblutet.

Und um die Sauerstoffkonzentration in der Umgebung aufrecht zu erhalten, schließen wir das Mediumreservoir an die Gasversorgung an. Und schließlich schließen wir zwei Sauerstoffsensoren an den Kreislauf an, um die Sauerstoffspannung im System online zu überwachen. Jetzt ist das Setup abgeschlossen und kann so lange ausgeführt werden, wie Sie das Experiment entworfen haben.

Eines der leistungsfähigsten Werkzeuge bei der Analyse der organotypischen Funktionen der Zellen in den MicroCon-Behältern ist das Laser-Scanning-Mikroskop, das Sie hier sehen können. Das Laser-Scanning-Mikroskop gibt uns die Möglichkeit, unzerstört in jeden einzelnen MicroCon-Behälter zu blicken. Und da die MicroCon-Behälter oder der Chip für konventionelle Immunfärbe-Immunfluoreszenzmethoden verwendet werden können, sind wir in der Lage, alle Arten von Markern und organotypischen Funktionen innerhalb der Mikrobehälter zu detektieren.

Wie Sie hier in der Animation dieses Chips sehen können, ist der Boden vollständig mit Zellen gefüllt, ebenso wie die MicroCon-Behälterwände. Wir haben viele Zellen, die ziemlich lebendig sind, und wir haben sehr, sehr wenige tote Zellen. Das nächste Bild zeigt Ihnen, dass wir alle Arten von organotypischen Funktionen im Inneren des MicroCon-Behälters erkennen können.

Wie zum Beispiel bei Hepatozyten, der Albuminproduktion oder dem E konnte man in den Zellen eine Expression hören, die man hier schön im Overlay sehen kann. Der Zellkern ist blau gefärbt. Das Eco hierin ist grün gefärbt, und das Albumin ist ausgedrückt oder rot gebeizt.

Und wie Sie hier schön sehen können, kommen alle organotypischen Funktionen, die Sie von Hepatozyten erwarten, in dieser Art von 3D-Kultur gut zum Ausdruck. Darüber hinaus haben wir uns einen anderen Hepatozytenmarker angesehen, und das war Cytokeratin 18, und dieses Bild zeigt Ihnen, dass Cytokeratin 18 auch in dieser Art von Kulturen gut exprimiert wird. Und das überzeugt Sie hoffentlich davon, dass diese Art von organotypischen Funktionen auch für andere organotypische Kulturen nützlich sein könnte.

Nach dem Ende des Biore-Experiments kann der Chip für die Isolierung aller Arten von zellulären Komponenten, wie zum Beispiel der Gesamt-RNA, verwendet werden. Wie Sie hier sehen können, zeigen wir Ihnen hier die Aufnahme von Gesamt-RNA, die aus dem Bioreaktorsystem isoliert wurde. Diese Gesamt-RNA kann dann für Downstream-Anwendungen wie z. B. die Realtime-PCR oder, wie Sie hier sehen können, für die Microarray-Analyse verwendet werden.

Darüber hinaus können intakte Zellen aus dem System isoliert und dann für die konventionelle Durchflusszytometrie-Analyse verwendet werden. Wie Sie hier sehen können, hoffe ich, dass wir Ihnen zeigen konnten, dass das System für alle Arten von Anwendungen nützlich sein könnte, bei denen organotypische Reaktionen erforderlich sind, und dass das System für all die Arten von Anwendungen nützlich sein könnte, die wir bisher nicht in Betracht gezogen haben, wie zum Beispiel Stammzellanwendungen.