Name: Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Erfahren Sie die chip-basierte 3D-Zellkultur in perfundierten Mikro-Bioreaktoren zur Kultivierung von bis zu 10 Millionen Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über das Zellkulturumfeld für biotechnologische Anwendungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir möchten Mechthild Herschbach und Anke Dech für hervorragende technische Unterstützung danken.

Dieses Papier beschreibt die Verwendung eines Chip-basierte Plattform (Abb. 1) für die dreidimensionale Kultivierung von Zelllinien sowie primäre Zellen. Da viele Zellen exprimieren organotypischen Funktionen nur in einer 3D-Umgebung zu tun, haben wir ein Polymer-Chip, ein Gerüst, auf die die Zellen können in alle Raumrichtungen haften bietet entwickelt, und das kann in einem Bioreaktor Gehäuse für die Steuerung der Strömung montiert werden , Sauerstoffspannung etc. Je nach Versuchsanordnung kann die Oberfläche des Polymers durch verschiedene Techniken, zB UV-Bestrahlung, PECVD, γ-Pfropfen oder konventionelle Nasschemie geändert werden. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="564_Figure-01.png" width="546" height="386" /> Abbildung 01 1. De-Be-und Hydrophilierung des Chips Vor Gebrauch muss der Chip entlüftet und hydrophilisiert werden. Dafür ist ein Alkohol-Serie durchgeführt. Isopropanol-Lösungen, bestehend aus 100%, 70%, 50%, 30% Isopropanol in DMPC-behandeltem Wasser hergestellt werden und der Chip ist in jeder Konzentration getaucht, beginnend mit dem 100%-Lösung für bis zu 30s. Der letzte Schritt der Serie besteht aus reinem Dimethyl pyrocarbonat (DMPC)-behandeltem Wasser. Von diesem Punkt an ist es wichtig, dass der Chip nass. 2. Collagen I Beschichtung Nach dem Alkohol-Serie ist der Chip in der Regel mit einer Kollagen-I-Lösung von Rattenschwanz beschichtet. Von der Kollagen-Stammlösung von 2 mg / ml in 0,2% Essigsäure ein Aliquot entsprechend 30 ug Kollagen-Protein ist mit DMPC-behandeltem Wasser auf ein Endvolumen von 150 ul verdünnt. Dies führt zu einer Kollagen-Beschichtung von der Chip-Oberfläche mit einer Dichte von 10 ug Kollagen I pro cm 2 Fläche. 3. Inokulation von hepatozellulären Karzinom-Zellen Hepatozellulären Karzinom-Zellen der Linie HepG2 sind trypsiniert und gezählt. Für kurzfristige Versuche (1 bis 6 Tage) 5 * 10 6 Zellen sind in jedem Chip und die entsprechende Steuerung 6 cm Gewebekultur-Petrischalen ausgesät. Um inoculte sind die Chip-5 * 10 6 Zellen in 150 ul Kulturmedium resuspendiert und auf der mikrostrukturierten Fläche des Chips (Abb. 2). Danach wird es in einem Inkubator für 2-3 Stunden platziert. Während dieser Inkubationszeit der Zellen Sediment in der Mikro-Behälter und haften an der Kollagen I-beschichteten Gerüst. <img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="564_Figure-02.png" width="300" height="225" /> Abbildung 2 4. Einsetzen des Chips in den Bioreaktor Gehäuse Nach der Inkubationszeit wird der Chip aus dem Brutschrank entnommen und montiert in den Bioreaktor Gehäuse. Für diese, unter der Sterilbank wird die vormontierte Bioreaktor aus der sterilen Verpackung entnommen und zerlegt zu einem gewissen Grad, dass für das Einsetzen des Chips ermöglicht. Der Chip wird vorsichtig mit einer sterilen Pinzette gehandhabt und in die Nut, dass die Dichtung, die Dichtungen der Chip und die Ergebnisse in der Erzeugung von einer oberen und unteren Kompartiment in dem Bioreaktor enthält. Dann wird der Bioreaktor wieder zusammengebaut übertragen in den Inkubator, wo sie mit der Pumpe verbunden ist, die Gasversorgung und die Sauerstoff-Analysator. 5. Befüllen der Anlage Sobald der Bioreaktor auf das Medium Reservoir verbunden ist, Förderpumpe und Gas den geschlossenen Kreislauf mit Medium gefüllt. Dies wird durch die Positionierung der 3-Wege-Anschlüsse in einer Weise, dass Superfusion, die als die Strömung des Mediums über die Oberseite des Chips definiert ist, erreicht wird getan. Dies führt zu einer Entlastung der eingeschlossenen Luft aus dem Bioreaktor Kreislauf, ohne die Zellen aus dem Schafott. Nachdem das System ist komplett mit Medium gefüllt ist, sind die 3-Wege-Anschlüsse in einer Weise, dass die Perfusion, die als die Strömung von unten den Chip durch das Gewebe definiert ist, erreicht wird eingeschaltet. In der Perfusion Konfiguration ist die Strömung in die Zelle die Bedürfnisse, die für Hepatozyten liegt typischerweise im Bereich von 60 bis 500 ml / min eingestellt. 6. Stichprobenverfahren Während des Experiments Medium Proben gezogen werden können. Dazu werden Spritzen in die sterile Anschlüsse auf der Oberseite des Mediums Reservoir verbunden. Nach der Probenahme werden die Ports mit 70% Isopropanol sterilisiert. 7. Isolierung von intakten Zellen aus dem Chip für nachgelagerte Anwendungen Am Ende des Experiments sind die Bioreaktoren aus der Gasversorgung und die Rollerpumpe getrennt, übertragen auf die saubere Werkbank und zerlegt, wie oben beschrieben. Mit einer sterilen Pinzette wird der Chip aus dem Bioreaktor Gehäuse entfernt, platziertin einen 3,5 cm Petrischale mit PBS gespült. Anschließend wird der Chip mit Trypsin / EDTA (0,25% / 0,53 mm) für 5-15 min im Brutschrank inkubiert, um die Zellen aus der mikrostrukturierten Bereich zu lösen. Die gesammelten Zellsuspension für 5 min bei 600 g zentrifugiert Die Zellen können dann für die konventionelle Downstream-Anwendungen, zB Gesamt-RNA oder Protein Isolierung verwendet werden. Routinemäßig isolieren wir Gesamt-RNA (PARIS-Kit, Ambion Inc., Austin, Texas, USA) für die Microarray-Analyse und real-time RT-PCR. Die Proteinexpression wird nach immunhistochemischer Färbung der Zellen im Inneren des Chips mit einem Laser-Scanning-Mikroskop analysiert, kann aber auch anderweitig ausgewertet werden, zB mittels Durchflusszytometrie.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in aktiv durchströmten micro Bioreaktoren entwickelt. Die Chips können aus biologisch nicht abbaubaren sowie biologisch abbaubare Polymere, die durch Mikro-Spritzguss, Heißprägen sowie Mikro Warmformtechniken 3 hergestellt werden. Je nach Versuchsanordnung kann die Oberfläche des Polymers durch UV-Bestrahlung 4 modifiziert werden. Hepatocyte Zelllinien sowie primäre Rattenhepatozyten erfolgreich in diese Geräte angebaut werden, wie ...

<table><tbody><tr><td>Zellen</td><td>Sonstiges</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen I aus Rattenschwanz</td><td>Reagenz</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>PARIS-Kit</td><td>Reagenz</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cytokeratin 18</td><td>Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>Primärantikörper, Maus monoklonal, verwendet 1:100 in PBS</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>Primärantikörper, Maus monoklonal, verwendet 1:50 in PBS.</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Albumin</td><td>Reagenz</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>Primärantikörper, Ziege anti-menschliches Albumin, verwendet 1:200 in PBS</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-Maus-IgG1</td><td>Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Sekundärantikörper, mit Alexa Fluor 488 konjugiert, verwendet 1:100 in PBS + 0.5 % BSA</td></tr><tr><td>Cy3-Anti-Ziegen-IgG</td><td>Reagenz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure Esel anti-Ziege IgG-Antikörper, verwendet 1:700 in PBS + 0.5 % BSA</td></tr></tbody></table>

chip-basierte dreidimensionale zellkultur in perfundierten micro-bioreaktoren

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Wir haben eine Chip-basierte Zellkultur-System für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen entwickelt. Der Chip ist in der Regel von nicht-biologisch abbaubaren Polymeren, zB Polycarbonat oder Polymethylmethacrylat durch Mikro-Spritzgießen, Mikro Heißprägen oder Mikro-Tiefziehen hergestellt. Aber kann es auch aus biologisch abbaubaren Polymeren hergestellt werden. Seine Abmessungen sind 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (HxBxT). Die wichtigsten Merkmale der verwendeten Chips werden entweder ein Raster von bis bis 1156 Kubik Mikro-Containern (cf-Chip) jedes von der Größe 120-300 x 300 x 300 μ (HxBxT) oder runde Vertiefungen mit einem Durchmesser von 300 μ und einer Tiefe von 300 μ (r-Chip). Das Gerüst kann Haus 10 Mio. Zellen in einer dreidimensionalen Konfiguration. Für eine optimale Nährstoff-und Gasversorgung, ist der Chip in einem Bioreaktor Gehäuse eingesetzt. Der Bioreaktor ist Teil eines geschlossenen Kreislauf steril, dass in der einfachsten Konfiguration, zusätzlich von einer Walze Pumpe und ein Medium-Reservoir mit einer Gasversorgung besteht. Der Bioreaktor kann in Perfusion, Superfusion, oder sogar ein Mischbetrieb gefahren werden. Wir haben erfolgreich Zelllinien sowie primäre Zellen über einen Zeitraum von mehreren Wochen kultiviert. Für Ratten primären Leberzellen konnten wir einen Erhalt der organotypischen Funktionen für mehr als 2 Wochen zeigen. Für hepatozellulären Karzinom-Zelllinien konnten wir zeigen die Induktion von Leber-spezifische Gene nicht oder nur geringfügig in Standard-Monolayer-Kultur zum Ausdruck gebracht. Das System könnte auch nützlich sein, wie eine Stammzelle Anbausystem seit der ersten Differenzierung Experimente mit Stammzell-Linien waren viel versprechend.

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Wir haben ein chipbasiertes Zellkultursystem für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen entwickelt. Der Chip wird typischerweise aus ... hergestellt.

Hallo, ich bin Eric Gottwald und Wissenschaftler am Institut für Biologische Grenzflächen des Ware-Instituts für Technologie. Heute möchte ich Ihnen unser chipbasiertes perfundiertes Mikro-Bioaktiv-System vorstellen. Bevor wir den Chip in Zellkultur-Anwendungen verwenden können, müssen wir das Polymer hydrolysieren und den mikrostrukturierten Bereich entfetten.Dies wird erreicht, indem der Chip einfach in verschiedene Konzentrationen von Isopropanol getaucht wird, beginnend mit 100 %. Der Chip wird jeweils nur wenige Sekunden in jede Konzentration eingetaucht, wobei der letzte Schritt lediglich Wasser ist. Anschließend wird der Chip getrocknet und muss abschließend mit einer Kollagenlösung beschichtet werden, um die Anheftung der Zellen an das Polymer zu erleichtern. Dies erfolgt, indem einige Tropfen einer Kollagenlösung auf den mikrostrukturierten Bereich aufgetragen werden. In diesem Zustand wird der Chip über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.Nach der Übernacht-Inkubation mit der Kollagen-Eins-Lösung wird die Lösung entfernt und der Chip mit steriler PBS gewaschen. Anschließend wird auch die PBS entfernt, und der Chip ist nun bereit für die Inokulation der Zellen. Nun werde

chip-based-three-dimensional-cell-culture-perfused-micro

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In der Vergangenheit haben viele in-vitro-Kultur-Systeme - vor allem Monolayerkulturen - oft den Nachteil erlitten, dass differenzierte primären Zellen eine relativ kurze Lebensdauer hatten und während der Kultur de-differenziert. Als Folge davon wurden die meisten ihrer organ-spezifischen Funktionen verloren schnell. So, um bessere Bedingungen für diese Zellen in vitro zu vervielfältigen, haben Änderungen und Anpassungen zu herkömmlichen Monolayerkulturen worden.

Interview: Bioreaktoren und Aufgetaucht-Modified 3D-Gerüste für Stammzellforschung

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Kokultivierung von Primärzellen, Gewebemodellen und Stanzbiopsien in einem mikrofluidischen Multiorgan-Chip für bis zu 28 Tage. Humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen, Leberaggregate und Hautbiopsien wurden erfolgreich in einem gemeinsamen Medienkreislauf kombiniert.

Die Multi-Organ Chip - Ein Mikrofluidik-Plattform für langfristige Multi-Gewebe Cokultur

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Dieses Protokoll zeigt Methoden, um eine erweiterte In-vitro-Kultur von patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) zu ermöglichen. Ein Schritt verbessert die Gesamtlebensfähigkeit von mehrzelligen Clusterkulturen in 3D-Hydrogelen durch die einfache Entfernung nicht lebensfähiger Einzelzellen. Ein sekundärer Schritt veranschaulicht Best Practices für PDX-Kultur in einer durchsetzten mikrofluidischen Plattform.

Verbesserte Lebensfähigkeit für Ex vivo 3D Hydrogelkulturen von patientenabgeleiteten Xenografts in einer perfused Microfluidic Platform

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Dieses Papier stellt eine Methode zum Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen, mehrkanaligen Perfusionszellkultursystems zur Messung der Dynamik der Sekretions- und Absorptionsraten von gelösten Stoffen in zellulären Prozessen vor. Das System kann Zellen auch dynamischen Reizprofilen aussetzen.

Multi-Stream-Perfusionsbioreaktor integriert mit Auslassfraktionierung für dynamische Zellkultur

Dieses Protokoll stellt den Aufbau und Betrieb eines neu entwickelten, 3D-gedruckten Bioreaktors für die ex vivo Kultur von Blutgefäßen in Perfusion vor. Das System ist so konzipiert, dass es leicht von anderen Benutzern übernommen werden kann, praktisch, erschwinglich und an verschiedene experimentelle Anwendungen wie grundlegende biologische und pharmakologische Studien anpassbar ist.

Ex Vivo Perfusionskultur großer Blutgefäße in einem 3D-gedruckten Bioreaktor

Unser detailliertes Protokoll beschreibt die Erstellung und Verwendung des fortschrittlichen Darm-on-Chip-Modells, das die menschliche Darmschleimhaut mit 3D-Strukturen und verschiedenen Zelltypen simuliert und eine eingehende Analyse von Immunantworten und zellulären Funktionen als Reaktion auf mikrobielle Besiedlung ermöglicht.

Immunkompetentes Darm-on-Chip-Modell zur Analyse der Immunantworten der Darmschleimhaut

Hier stellen wir Protokolle vor, die Anweisungen für die Implementierung von 3D-Zellkulturen unter Verwendung von Kollagen- und Kollagen-Agarose-Matrizen in einem mikrophysiologischen System enthalten. Diese Protokolle unterstützen die Co-Kultur von Sphäroiden mit Nierentubuli und Nierenzellkarzinom, simulieren In-vivo-Bedingungen und ermöglichen eine fortschrittliche Untersuchung von Wechselwirkungen mit Nierenkrebszellen.

Mikrofluidische Co-Kultur von gesunder Niere und Tumorepithel zur Modellierung des Fortschreitens von Nierenkrebs

Erfahren Sie die chip-basierte 3D-Zellkultur in perfundierten Mikro-Bioreaktoren zur Kultivierung von bis zu 10 Millionen Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle über das Zellkulturumfeld für biotechnologische Anwendungen.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Weitere Videos entdecken