Überlappende Peptid-Bibliothek zuordnen Qa-1 Epitope in einem Protein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Qa-1-Epitope in Proteinen zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunregulation und Immuntherapie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass kartierte Peptide dafür bekannt sind, Qa-1-restriktive CD8-T-Zellen zu stimulieren, und das Verfahren einfach durchzuführen ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf therapeutische Designs für immunvermittelte Krankheiten wie Multiple Sklerose. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Qa-1-vermittelte Immunregulation bei Tieren geben kann, kann sie auch auf die HLA-E-vermittelte Immunregulation beim Menschen angewendet werden. Um das Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie eine Bibliothek von 15-mer-Peptiden, in der sich benachbarte Peptide in 11 Aminosäuren überlappen.

Gewinnen und rekonstituieren Sie die Peptide unter sterilen Bedingungen. Kombinieren Sie für jedes Peptid fünf Milligramm des Peptids mit 100 Mikrolitern Dimethylsulfoxid. Kombinieren Sie 10 Mikroliter jeder Peptidbrühe in einem sauberen 1-Milliliter-Kryoröhrchen, um die OLP-Poolbrühe vorzubereiten.

Laden Sie dann 20 Mikroliter jedes Peptidstocks in eine 96-Well-Platte mit V-Boden und verdünnen Sie jeden Stamm mit 80 Mikrolitern sterilem Wasser. Lagern Sie sowohl die restlichen 50 Milligramm pro Milliliter Peptidvorräte als auch die Platte mit 10 Milligramm pro Milliliter Peptidvorräten bei 20 Grad Celsius. Als nächstes geben Sie 10 Mikroliter der OLP-Pool-Stammlösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das zwei Milliliter bestrahlte dendritische Zellen in serumfreiem Medium enthält, und verdünnen Sie so das DMSO um das Zweihundertfache.

Lagern Sie den restlichen OLP-Poolbestand bei 20 Grad Celsius. Inkubieren Sie die DCs mit dem OLP-Pool drei Stunden lang bei Raumtemperatur. Schütteln Sie die Zellen alle 15 Minuten vorsichtig mit der Hand.

Verwenden Sie während der Inkubation ein Kit, um CD8+T-Zellen aus einer entnommenen Mausmilz oder Lymphknoten zu reinigen. Bereiten Sie fünf Milliliter einer Lösung mit 10 Millionen T-Zellen pro Milliliter serumfreiem Medium mit 50 Einheiten pro Milliliter Interleukin 2 und 100 Einheiten pro Milliliter Interleukin 7 vor. Die gereinigten CD8-T-Zellen sollten frei von Kügelchen oder unberührt sein.

Geben Sie 0,5 Milliliter der T-Zell-Lösung in jede der 10 Vertiefungen einer 48-Well-Platte. Sobald die Inkubation der OLP-Pool-gepulsten DC-Lösung abgeschlossen ist, fügen Sie 10 Milliliter serumfreies Medium zu den DCs hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 300-facher G-Temperatur.

Rekonstituieren Sie dann die Zellen in fünf Millilitern serumfreiem Medium. Geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension in jede der 10 Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid.

Entfernen Sie dann 400 Mikroliter des Nährmediums aus jeder Vertiefung. Geben Sie 500 Mikroliter frisches serumfreies Medium mit je 100 Einheiten IL-2 und IL-7 pro Milliliter in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen für weitere zwei bis drei Tage, bevor Sie die im OLP-Pool geprimten Zellen erneut stimulieren.

Vor der Restimulation Peritonealmakrophagen der Maus entnehmen und bestrahlen. Passen Sie die Makrophagenkonzentration auf fünf Millionen Zellen pro Milliliter serumfreiem Medium an. Kombinieren Sie 10 Mikroliter des OLP-Poolbestands mit zwei Millilitern der bestrahlten Peritonealmakrophagen, um eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5 Vol.-% zu erhalten.

Ergänzen Sie diese Lösung mit 100 Einheiten pro Milliliter des murinen Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors. Füllen Sie eine 48-Well-Platte mit 200 Mikrolitern der OLP-Pool-Makrophagenlösung in jede Well. Inkubieren Sie die Platte vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie dann jede Mulde vorsichtig mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem RPMI-0-Medium. Die Makrophagenlösung enthält viele Kügelchen. Bevor die mit dem OLP-Pool geprimten CD8-T-Zellen hinzugefügt werden, sollte die Platte unter einem Mikroskop überprüft werden, um sicherzustellen, dass alle Wells frei von Kügelchen sind.

Sammeln und poolen Sie als Nächstes die mit dem OLP-Pool geprimten CD8+T-Zellen, die für die Restimulation bereit sind. Passen Sie die T-Zell-Konzentration auf eine Million Zellen pro Milliliter in einem serumfreien Medium an, das 25 Einheiten IL-2 pro Milliliter und 50 Einheiten pro Milliliter IL-7 enthält. Geben Sie einen Milliliter der gepoolten T-Zell-Lösung in jede Vertiefung, die OLP-Pool-gepulste Makrophagen enthält.

Kultivieren Sie die Zellen vier Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie dann etwa 400 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung. In jede Vertiefung werden 500 Mikroliter frisches serumfreies Medium gegeben, das je 100 Einheiten IL-2 und IL-7 pro Milliliter enthält.

Setzen Sie die Inkubation unter den gleichen Bedingungen fort. Nach drei bis vier Tagen untersuchen Sie die restimulierten Zellen mit einem Interferon-gamma-Enzym-gekoppelten Immunospot-Assay auf eine OLP-Pool-spezifische Qa-1-eingeschränkte Antwort. Aktualisieren Sie das CD8+T-Zell-Medium alle drei bis vier Tage, während Sie auf die Ergebnisse warten.

Führen Sie einen ELISPOT-Assay mit den verdünnten Peptidstämmen durch, um zu bestimmen, welche Peptide die OLP-Pool-spezifische Qa-1-eingeschränkte Interferon-Gamma-Sekretion produzieren. Zuletzt wird eine verkürzte Peptidserie mit ELISPOT ausgewertet, um das optimale Qa-1-Epitop zu identifizieren. Ein Interferon-gamma-ELISPOT-Assay zeigte einen signifikanten Anstieg der spotbildenden Zellen, wenn CD8+T-Zellen, die durch die gepoolte MOG-überlappende Peptidbibliothek stimuliert wurden, mit C1R kombiniert wurden.

Qa-1b-Zellen. Dies deutete darauf hin, dass die T-Zellen auf die Qa-1-bindenden Peptide reagierten und dass die MOG_pool ein oder mehrere Qa-1-bindende Epitope enthielten. Ein weiterer Assay wurde durchgeführt, um die einzelnen Peptide im Pool zu screenen.

Drei Peptide zeigten Reaktionen, die mindestens dreimal so groß waren wie die Reaktion in Gegenwart von C1R. Qa-1b-Zellen ohne Peptide. Von diesen wurde das Peptid mit der größten Reaktion für die weitere Bewertung ausgewählt.

Eine Bibliothek von verkürzten Peptiden, die auf dem interessierenden 15-mer-Peptid basieren, wurde ausgewertet, um das optimale Qa-1-Epitop zu identifizieren. Das Epitop wäre idealerweise acht bis 10 mer, wobei neun mer bevorzugt werden. Darüber hinaus würde das optimale Epitop eine ähnliche oder eine stärkere Interferon-Gamma-Reaktion als das 15-mer-Peptid zeigen.

Das neun mer N-terminale verkürzte Peptid erfüllte diese Kriterien am besten und ist damit das optimale Qa-1-Epitop. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunregulation, neue Qa-1-Epitope für die Untersuchung der Immunregulation in anderen Geweben, wie z. B. der Bauchspeicheldrüse, zu entdecken. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Strahlung äußerst gefährlich sein kann.

Forschende sollten sich strikt an die institutionellen Richtlinien halten und angemessen ausgebildet sein.