4.2: Zellzyklus-Analyse

Der Zellzyklus bezieht sich auf die Gesamtheit der zellulären und biochemischen Prozesse, die innerhalb einer Zelle ablaufen und zu ihrer Teilung führen. Eine Zelle durchläuft verschiedene Stadien des Zyklus, und die Zeit, die benötigt wird, um diesen Prozess abzuschließen, ist für einen Zelltyp nahezu konstant. Jede Abweichung von dieser Dauer ist ein Hinweis auf eine abnormale Zellteilung. Daher wird die Zellzyklusanalyse zu einem sehr nützlichen Werkzeug für Biologen, die an der Untersuchung der Mechanismen der Zellteilung interessiert sind, was letztendlich bei der Behandlung von Patienten mit Krankheiten wie Krebs helfen wird, bei denen der Zellzyklus gestört ist.

In diesem Video wird das Prinzip und ein verallgemeinertes Protokoll der Zellzyklusanalyse diskutiert. Zum Schluss zeigen wir einige Anwendungen dieser häufig verwendeten Methode.

Lassen Sie uns lernen, was eine Zellzyklusanalyse ist und wie dieser Assay funktioniert.

Im Wesentlichen sagt uns die Zellzyklusanalyse einer gemischten Population, wie viele Zellen sich in jeder der verschiedenen Phasen befinden. Dies geschieht in der Regel durch die Auswertung des DNA-Gehalts der Zelle. Sie denken vielleicht: Warum DNA-Gehalt? Um dies zu verstehen, schauen wir uns kurz an, was mit der chromosomalen DNA passiert, wenn eine Zelle den Zyklus durchläuft.

Während der G1-Phase ändert sich der DNA-Gehalt in einer Zelle nicht. In der S-Phase findet die DNA-Replikation statt, und am Ende dieser Phase verdoppelt sich der DNA-Gehalt. In der G2-Phase überprüfen die Zellen, ob es keine Fehler bei der DNA-Duplikation gibt, und schließlich, am Ende des M-Stadiums, wird diese DNA gleichmäßig in zwei Tochterzellen aufgeteilt. Daher kann die Markierung der DNA einem Wissenschaftler helfen, das Zellzyklusstadium zu bestimmen.

Ein wichtiger Aspekt bei dieser Markierung ist die Wahl des DNA-Bindungsfarbstoffs. Bromodeoxyuridin oder BrdU ist ein Nukleinsäure-Analogon und ahmt strukturell Thymidin nach. Dies ermöglicht es, BrdU während der DNA-Replikation in den wachsenden Strang einzubauen. Daher markiert dieser Farbstoff nur Zellen in der S-Phase. Nach dem Einbau von BrdU werden die DNA-Stränge getrennt und BrdU mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachgewiesen.

Andere Verbindungen, wie Propidiumiodid oder PI, das von Natur aus fluoreszierend ist, interkalieren zwischen doppelsträngigen Nukleinsäuren und färben daher Zellen in allen Stadien. Die Menge der PI-Färbung ist jedoch proportional zur DNA-Menge.

Obwohl die Auswahl einer Färbung vom jeweiligen Experiment abhängt, verwenden Forscher häufig duale Färbeverfahren. Moleküle wie PI, die proportional an alle Zellen binden, können G1-Zellen leicht von Zellen der G2- oder M-Phase unterscheiden. Die Zellen der S-Phase befinden sich jedoch noch im Übergang. Daher erhöht die Zugabe von Molekülen wie BrdU, die nur Zellen der S-Phase markieren, die Spezifität der Detektion im Zellzyklusstadium. Schließlich werden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Zellen in verschiedenen Zellzyklusstadien zu zählen.

Nachdem Sie nun die Prinzipien hinter der Zellzyklusfärbung verstanden haben, lassen Sie uns ein Verfahren mit BrdU und PI besprechen.

Richten Sie Zellkulturschalen ein: eine für das Experiment und drei weitere als Kontrollen. Bei einer Konfluenz von etwa 60 % wird das in Kulturmedien gelöste BrdU zu den lebenden Zellen gegeben, gefolgt von der Inkubation. In diesem Stadium wird BrdU in die replizierende DNA eingebaut.

Nach der Inkubation werden die Zellen zentrifugiert und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Als nächstes werden die Zellen fixiert, indem die Zellsuspension tropfenweise zu eiskaltem 70%igem Ethanol hinzugefügt wird, während sie sanft vortexen. Dadurch wird die Zellteilung gestoppt und eine Verklumpung verhindert.

Fixierte Zellen werden erneut zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Dann wird eine konzentrierte Säurelösung, die ein Detergens, wie z. B. Triton-X, enthält, tropfenweise zu den Zellen gegeben. Das Detergens permeabilisiert die Zellen, um das Eindringen von membranundurchlässigen Verbindungen zu ermöglichen, und die Säure senkt den pH-Wert und denaturiert die DNA, wodurch BrdU freigelegt wird. Die Zellen werden dann zentrifugiert, der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in alkalischer Lösung resuspendiert, um den pH-Wert wiederherzustellen.

Schließlich werden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem BrdU-Antikörper inkubiert, der bei Raumtemperatur an ein Fluoreszenz-Tag konjugiert ist. Nach diesem Schritt sollten die Proben vor Licht geschützt werden, um Photobleaching zu vermeiden.

Bei der dualen Färbung werden die Zellen mit PI und RNase inkubiert. RNase ist notwendig, um RNA-RNA- oder RNA-DNA-Doppelstränge zu entfernen, die ebenfalls an PI binden und falsch positive Ergebnisse liefern können. Die Zellen werden dann durch ein Zellsieb geleitet, um eine Einzelzellsuspension herzustellen, die für die durchflusszytometrische Analyse erforderlich ist.

Nachdem Sie nun das Protokoll für die Färbung kennengelernt haben, sehen wir uns an, wie Sie die erhaltenen Daten analysieren.

Kurz gesagt, in der Durchflusszytometrie scheint ein Laserstrahl auf einen schmalen Strom von Einzelzellsuspension, und die Emission der Farbstoffe in jeder Zelle bei bestimmten Wellenlängen wird als einzelnes Ereignis in einem Streudiagramm detektiert.

Hier zeigt das Streudiagramm von PI-gefärbten Zellen zwei unterschiedliche Cluster, von denen einer fast doppelt so viel PI aufweist wie der andere. Nach der Optimierung des PI-Detektors erscheinen diese Sätze als zwei Peaks in einer Histogrammanalyse. Der Peak bei höherer PI-Intensität repräsentiert G2/M-Zellen und der bei niedrigerer Intensität repräsentiert G1-Zellen. Die Flächen unter diesen Peaks stellen die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Phasen dar.

In ähnlicher Weise können die BrdU-FITC-Ereignisse in einer Histogrammanalyse auf einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Dieses Diagramm zeigt, dass BrdU-positive Zellen deutlich heller sind als die ungefärbten Zellen, und da sich nur ein Bruchteil der Population in der S-Phase befindet, ist ein größerer Peak von ungefärbten BrdU-Zellen zu sehen.

Das Streudiagramm von Zellen, die mit BrdU und PI gefärbt wurden, kann mit PI auf der linearen X-Achse und BrdU auf der logarithmischen Y-Achse dargestellt werden, und dies zeigt ein Hufeisenmuster, das von G1, S nach G2 verläuft. Der Anteil der Zellen in den Gated Areas kann ermittelt und in einem Balkendiagramm dargestellt werden.

Nachdem wir nun das grundlegende Protokoll für die Zellzyklusanalyse durchlaufen haben, schauen wir uns an, wie es in verschiedenen Versuchsaufbauten eingesetzt werden kann.

A. Durch die Kombination von genetischen Manipulationen mit der Zellzyklusanalyse untersuchen Wissenschaftler die Rolle bestimmter Proteine bei der Progression des Zellzyklus. In dieser Studie exprimierten Wissenschaftler ein Protein namens p27 in embryonalen Fibroblasten der Maus. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Überexpression zu einer geringeren Anzahl von Zellen in der S-Phase führte, was darauf hindeutet, dass dieses Protein eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielt.

Mit Hilfe der Zellzyklusanalyse können Wissenschaftler die Progressionskinetik vergleichen. Hierbei wurde die Progressionskinetik zwischen zwei kolorektalen Karzinomzelllinien und einer Brustkrebszelllinie verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Brustkrebszellen im Vergleich zu den kolorektalen Zelllinien langsamer durch den Zellzyklus fortschritten, da der Anteil der Brustkrebszellen im G1 im Laufe der Zeit höher war.

Schließlich kann für die In-vivo-Zellzyklusanalyse BrdU in Nagetiere injiziert und die Zielzellpopulation für die Zellzyklusanalyse isoliert werden. In dieser Studie wurden hämatopoetische Stammzellen oder HSCs von BrdU-injizierten Mäusen für die durchflusszytometrische Analyse isoliert. Die gesammelten Daten zeigten die Verteilung der HSCs auf die verschiedenen Zellzyklusstadien, wobei die G1- und S-Phase vorherrschte.

Sie haben gerade das Video von JoVE über die Zellzyklusanalyse gesehen. Wir haben die Prinzipien hinter diesem Prozess überprüft, ein Schritt-für-Schritt-Protokoll erstellt und überprüft, wie diese Art der Analyse in verschiedenen experimentellen Umgebungen eingesetzt wird. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!