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Zellzyklus-Analyse

Cell Cycle Analysis

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Cell Biology

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JoVE Science Education Cell Biology

Cell Cycle Analysis

4.1: An Introduction to Cell Division

4.3: Live Cell Imaging of Mitosis

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09:32 min

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April 30, 2023

Overview

Zellzyklus bezieht sich auf den Satz von Ereignissen, durch die eine Zelle wächst, sein Genom repliziert und schließlich teilt sich in zwei Tochterzellen durch den Prozess der Mitose. Weil die Menge an DNA in einer Zelle charakteristische Veränderungen während des Zyklus Techniken bekannt zeigt als Zellzyklus Analyse verwendet werden kann, in sind, einer Bevölkerung der Zellen entsprechend der verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu trennen, basierend auf ihren unterschiedlichen DNA-Gehalt.

Dieses Video deckt die Prinzipien hinter Zellzyklus Analyse über DNA-Färbung. Wir prüfen eine generalisierte Protokoll für die Durchführung dieser Färbung mit Bromodeoxyuridine (BrdU, eine analoge Thymidin, die neu synthetisierten DNA-Stränge eingebaut ist) und Propidium Jodid (PI, ein DNA-Farbstoff, der alle DNA Flecken), gefolgt von der Analyse der gefärbten Zellen mit Durchflusszytometrie. Während der Durchflusszytometrie einen einzigen Zellsuspension Fluoreszent markierten Zellen wird ein Instrument mit einem Laserstrahl durchlaufen und die Fluoreszenz jeder Zelle wird gelesen. Wir dann diskutieren, wie man Daten vom Fluss durchflusszytometrischen Streudiagrammen zu interpretieren und zu guter Letzt schauen Sie sich ein paar Anwendungen dieser Technik.

Procedure

Zellzyklus bezieht sich auf die zelluläre und biochemische Prozesse, die innerhalb einer Zelle führt zu seiner Division. Eine Zelle durchläuft verschiedene Phasen des Zyklus, und der Zeitaufwand für diesen Vorgang ist nahezu konstant für einen Zelltyp. Jede Abweichung von dieser Dauer ist bezeichnend für abnorme Zellteilung. Zellzyklus-Analyse wird daher ein sehr nützliches Werkzeug für Biologen, die Interesse an einem Studium Mechanismen der Zellteilung, die letztlich hilft bei der Behandlung von Patienten mit Krankheiten wie Krebs, in denen der Zellzyklus gestört ist.

Dieses Video wird das Prinzip und eine generalisierte Protokoll des Zellzyklus Analyse besprechen. Zu guter Letzt zeigen wir, dass einige Anwendungen dieser Methode häufig verwendet.

Lasst uns lernen welche Zellzyklus-Analyse ist, und wie dieser Test funktioniert.

Im Wesentlichen, Zellzyklus-Analyse einer gemischten Bevölkerung sagt uns, wie viele Zellen in den verschiedenen Phasen sind. Dies geschieht am häufigsten durch die Auswertung der Zelle DNA-Gehalt. Sie mögen denken: Warum DNA-Gehalt? Um dies zu verstehen, lassen Sie uns kurz wiederholen was passiert mit chromosomaler DNA einer Zelle im Laufe durch den Zyklus.

Während der Phase G1 DNA-Gehalt innerhalb einer Zelle nicht geändert. Durch die S-Phase DNA-Replikation erfolgt, und durch das Ende dieser Phase DNA Inhalt verdoppelt. In G2-Phase, die Zellen überprüft werden, dass keine Fehler in DNA-Vervielfältigung, und schließlich – am Ende des M Bühne – diese DNA bekommt gleich zwei Tochterzellen aufgeteilt. Daher hilft DNA Kennzeichnung ein Wissenschaftlers die Zellzyklus-Phase zu bestimmen.

Ein wichtiger Aspekt für diese Kennzeichnung ist die Wahl des DNA-bindenden Farbstoff. Bromodeoxyuridine oder BrdU, ist eine analoge Nukleinsäure und strukturell imitiert Thymidin. Dies ermöglicht BrdU in den wachsenden Strang während der DNA-Replikation zu integrieren. Daher kennzeichnet dieser Farbstoff Zellen in der S-Phase. BrdU-Aufnahme die DNA-Stränge getrennt und BrdU wird mit Hilfe von Eindringmittel tagged Antikörper erkannt.

Andere Verbindungen, wie z. B. Propidium Jodid oder PI, die von Natur aus fluoreszierendem, zwischen doppelte gestrandete Nukleinsäuren einzulagern, und daher Fleck Zellen in allen Phasen. Allerdings ist die Menge der PI Färbung proportional zur DNA-Menge.

Obwohl das Experiment griffbereit Auswahl des Fleckes abhängt, verwenden die Forscher oft dual befleckenden Verfahren. Moleküle wie PI, die proportional zu allen Zellen binden leicht kann zu unterscheiden von G2 G1 oder M-Phase-Zellen. S-Phase-Zellen sind jedoch noch im Übergang. Daher Zugabe von Molekülen wie BrdU, dass nur Label S Phase Zellen erhöhen die Spezifität des Zellzyklus Erkennung. Schließlich sind Zellen mittels Durchflusszytometrie aufzuzählenden Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen analysiert.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter Zellzyklus Färbung zu verstehen, sprechen wir über ein Verfahren mit BrdU und PI.

Zelle Kultur Gerichte einrichten: eine für das Experiment und eine zusätzliche drei als Kontrollen. Bei etwa 60 % confluency, BrdU in Kulturmedien aufgelöst wird hinzugefügt, um die lebenden Zellen, gefolgt von Inkubation. In diesem Stadium ist BrdU innerhalb der replizierende DNA eingebaut.

Nach Inkubation sind Zellen zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung oder PBS. Als nächstes werden Zellen durch Zugabe von Zellsuspension tropfenweise zu eiskalten 70 % Ethanol beim Aufschütteln sanft fixiert. Dies hört auf Zellteilung und verhindert verklumpen.

Fixe Zellen sind erneut zentrifugiert und Nukleinsäuretablette mit PBS-Puffer. Anschließend ist eine konzentrierte Säure-Lösung mit einem Reinigungsmittel, z. B. Triton-X, tropfenweise die Zellen hinzugefügt. Das Waschmittel permeabilizes der Zellen, um die Einreise von Membran-undurchlässige Verbindungen, und Säure sinkt der pH-Wert und DNA, Verfügbarmachen BrdU denaturiert. Zellen sind dann zentrifugiert, Überstand wird verworfen, und das Pellet ist Nukleinsäuretablette in alkalischer Lösung, pH wiederherzustellen.

Zu guter Letzt sind Zellen mit PBS gewaschen und mit einem BrdU Antikörper konjugiert auf einen fluoreszierenden Transponder bei Raumtemperatur inkubiert. Nach diesem Schritt sollten Proben von Licht zu vermeiden, Immunofluoreszenz geschützt werden.

Wenn dual Färbung, Zellen mit PI und RNase inkubiert werden. RNase ist notwendig, RNA-RNA oder RNA-DNA-Doppelstränge zu entfernen, die auch an PI binden und können falsch positive Ergebnisse erzielt. Zellen werden dann durch ein Sieb Zelle zu einzelnen Zellsuspension für notwendige durchflusszytometrischen Analyse übergeben.

Nun, da Sie das Protokoll für das Beflecken gelernt haben, betrachten wir die gewonnenen Daten zu analysieren.

Kurz, Flow Cytometry, die ein Laserstrahl auf einen schmalen Bach der einzelnen Zellsuspension und die Emission bei bestimmten Wellenlängen von Farbstoffen in jeder Zelle scheint als ein einzelnes Ereignis auf ein Streudiagramm erkannt wird.

Hier, befleckt das Streudiagramm von PI Zellen zeigen zwei verschiedene Cluster, mit fast die doppelte Menge an PI als die andere. Nach Optimierung der PI-Detektor erscheinen diese Sätze als zwei Gipfeln in einem Histogramm-Analyse. Der Peak bei intensiver PI stellt G2/M-Zellen und bei geringerer Intensität dar G1-Zellen. Diese Peakflächen repräsentieren die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Phasen.

Ebenso können der BrdU-FITC-Ereignisse in einem Histogramm-Analyse auf einer logarithmischen Skala angezeigt werden. Diese Darstellung zeigt, dass BrdU positive Zellen sind deutlich heller als die ungefärbten Zellen, und da nur ein Bruchteil der Bevölkerung sind in der S-Phase, eine größere Spitze BrdU ungefärbten Zellen gesehen werden kann.

Das Streudiagramm von Zellen befleckt mit BrdU und PI kann mit PI auf der linearen X-Achse und BrdU auf der logarithmischen Y-Achse angezeigt werden, und dies zeigt ein Hufeisen Muster gehen von G1, S, G2. Der Anteil der Zellen in den geschlossenen Bereichen kann ermittelt und auf ein Balkendiagramm angezeigt werden.

Nun, da wir das grundlegende Protokoll für Zellzyklus Analyse durchlaufen haben, schauen Sie wie sie in verschiedenen Versuchsaufbauten verwendet werden kann.

A. durch die Kombination von genetischen Manipulationen mit Zellzyklus Analyse, untersuchen die Wissenschaftler Rollen spezifischer Proteine in der Zelle Zyklus Progression. In dieser Studie überexprimiert Wissenschaftler ein Protein namens p27 in embryonalen Fibroblasten der Maus. Die Ergebnisse zeigen, dass Überexpression führte zu geringeren Zahl von Zellen in der S-Phase darauf hinweist, dass dieses Protein eine entscheidende Rolle im Zellzyklus-Verordnung spielt.

Mit Zellzyklus Analyse können Wissenschaftler Fortschreiten Kinetik vergleichen. Hier wurden Fortschreiten Kinetik zwischen zwei colorectal Krebs-Zell-Linien und eine Brust-Krebs-Zell-Linie verglichen. Ergebnisse zeigten, dass der Brustkrebs-Zellen durch Zelle Zyklus mit einer langsameren Rate im Vergleich zu den kolorektalen Zelllinien, angesichts der höheren Anteil an Brustkrebs-Zellen in der G1 im Laufe der Zeit fortgeschritten.

Zu guter Letzt für in Vivo Zellzyklus-Analyse BrdU kann bei Nagern injiziert werden und die Zielpopulation Zelle für Zelle Zyklus Analyse isoliert werden kann. In dieser Studie wurden Blutstammzellen oder HSCs BrdU injiziert Mäusen isoliert für durchflusszytometrischen Analyse. Erhobenen Daten offenbart die Verteilung von HSZ unter verschiedenen Zellzyklus Phasen mit Dominanz in G1 und S-Phase.

Sie haben nur Jupiters Video auf Zellzyklus Analyse angesehen. Wir haben überprüft die Prinzipien, die hinter diesem Prozess, detaillierte Schritt für Schritt Protokoll und überprüft, wie diese Art der Analyse in den verschiedenen experimentellen Einstellungen verwendet wird. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

Cell cycle refers to the set of cellular and biochemical processes occurring within a cell leading to its division. A cell passes through different stages of the cycle, and the time taken to complete this process is almost constant for a cell type. Any deviation from this duration is indicative of abnormal cell division. Therefore, cell cycle analysis becomes a very useful tool for biologists interested in studying mechanisms of cell division, which will ultimately help in treating patients with diseases like cancer, in which the cell cycle is disrupted.

This video will discuss the principle and a generalized protocol of cell cycle analysis. Lastly, we’ll show some applications of this commonly used method.

Let’s learn what cell cycle analysis is, and how this assay works.

Essentially, cell cycle analysis of a mixed population tells us how many cells are in each of the different phases. This is most commonly done by evaluating the cell’s DNA content. You may think: why DNA content? To understand this, let’s briefly review what happens to chromosomal DNA as a cell progresses through the cycle.

During the G1 phase, DNA content within a cell does not change. Through the S phase, DNA replication takes place, and by the end of this phase DNA content is doubled. In G2 phase, the cells check that there are no errors in DNA duplication, and finally—at the end of M stage—this DNA gets equally divided into two daughter cells. Therefore, labeling DNA can help a scientist determine the cell cycle stage.

One important consideration for this labeling is the choice of DNA binding dye. Bromodeoxyuridine, or BrdU, is a nucleic acid analog and structurally mimics thymidine. This allows BrdU to incorporate into the growing strand during DNA replication. Therefore, this dye labels cells in S phase only. Following BrdU incorporation, the DNA strands are separated, and BrdU is detected with the help of fluorescently tagged antibodies.

Other compounds, such as propidium iodide or PI, which is inherently fluorescent, intercalate between double stranded nucleic acids, and therefore stain cells at all stages. However, the amount of PI staining is proportional to the DNA amount.

Although selection of a stain depends on the experiment at hand, researchers often use dual staining procedures. Molecules like PI that proportionally bind to all cells can easily differentiate G1 cells from G2 or M phase cells. However, S phase cells are still in transition. Therefore, addition of molecules like BrdU that only label S phase cells increase the specificity of cell cycle stage detection. Finally, cells are analyzed using flow cytometry to enumerate cells in different cell cycle stages.

Now that you understand the principles behind cell cycle staining, let’s discuss a procedure using BrdU and PI.

Set up cell culture dishes: one for the experiment, and an additional three as controls. At about 60% confluency, BrdU dissolved in culture media is added to the live cells, followed by incubation. At this stage, BrdU is incorporated within the replicating DNA.

Following incubation, cells are centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline, or PBS. Next, cells are fixed by adding cell suspension dropwise to ice-cold 70% ethanol while vortexing gently. This ceases cell division and prevents clumping.

Fixed cells are again centrifuged and resuspended in PBS. Then, a concentrated acid solution containing a detergent, such as Triton-X, is added to the cells dropwise. The detergent permeabilizes the cells to permit entry of membrane-impermeable compounds, and acid decreases the pH and denatures DNA, exposing BrdU. Cells are then centrifuged, supernatant is discarded, and the pellet is resuspended in alkaline solution to restore pH.

Lastly, cells are washed with PBS and incubated with a BrdU antibody conjugated to a fluorescent tag at room temperature. After this step, samples should be protected from light to avoid photobleaching.

When dual staining, cells are incubated with PI and RNase. RNase is necessary to remove RNA-RNA or RNA-DNA double strands, which also bind to PI and can yield false positive results. Cells are then passed through a cell strainer to make single cell suspension, which is necessary for flow cytometric analysis.

Now that you’ve learned the protocol for staining, let’s review how to analyze the data obtained.

Briefly, in flow cytometry a laser beam shines on a narrow stream of single cell suspension, and the emission at particular wavelengths from the dyes in each cell is detected as a single event on a scatter plot.

Here, the scatter plot of PI stained cells show two distinct clusters, one with almost twice the amount of PI than the other. Following optimization of the PI detector, these sets appear as two peaks in a histogram analysis. The peak at greater PI intensity represents G2/M cells, and the one at lower intensity represents G1 cells. Areas under these peaks represent the number of cells in the corresponding phases.

Similarly, the BrdU-FITC events can be displayed in a histogram analysis on a logarithmic scale. This plot shows that BrdU positive cells are distinctly brighter than the unstained cells, and since only a fraction of population are in the S phase, a larger peak of BrdU unstained cells can be seen.

The scatter plot of cells stained with BrdU and PI can be displayed with PI on the linear X-axis and BrdU on the logarithmic Y-axis, and this shows a horseshoe pattern going from G1, S, to G2. The proportion of cells in the gated areas can be determined and displayed on a bar graph.

Now that we’ve gone through the basic protocol for cell cycle analysis, let’s look at how it can be used in various experimental setups.

A. By combining genetic manipulations with cell cycle analysis, scientists study roles of specific proteins in cell cycle progression. In this study, scientists overexpressed a protein called p27 in mouse embryonic fibroblasts. The results demonstrate that overexpression led to lower numbers of cells in the S phase, indicating that this protein plays a critical role in cell cycle regulation.

Using cell cycle analysis, scientists can compare progression kinetics. Here, progression kinetics between two colorectal cancer cell lines and a breast cancer cell line were compared. Results demonstrated that the breast cancer cells progressed through cell cycle at a slower rate compared to the colorectal cell lines, given the higher percentage of breast cancer cells in the G1 over time.

Lastly, for in vivo cell cycle analysis, BrdU can be injected in rodents and the target cell population can be isolated for cell cycle analysis. In this study, hematopoietic stem cells or HSCs of BrdU-injected mice were isolated for flow cytometric analysis. Data collected revealed the distribution of HSCs amongst different cell cycle stages with predominance in G1 and S phase.

You’ve just watched JoVE’s video on cell cycle analysis. We’ve reviewed the principles behind this process, detailed a step-by-step protocol, and reviewed how this type of analysis is used in various experimental settings. As always, thanks for watching!

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