Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen mittels Zentrifugalschlämmung in verschiedene Zellzyklusphasen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Krebstherapeutika zu beantworten. Denn die Isolierung der Zellen in separate Phasen ermöglicht die Untersuchung der phasenabhängigen Wirkungen von Anti-Krebs-Wirkstoffen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Trennung von Zellen in bestimmte Phasen anhand physikalischer Eigenschaften und nicht chemischer Störungen ermöglicht. Um das Experiment zu starten, installieren Sie die Blitzbaugruppe so in der Zentrifuge, dass das Netzkabel durch den Anschluss auf der linken Seite aus der Kammer geführt wird. Stellen Sie die Blitzlampe so ein, dass sie mit dem Sichtfenster ausgerichtet ist, wenn die Zentrifuge geschlossen ist.

Befestigen Sie die Baugruppe, indem Sie zwei Kreuzschlitzschrauben oben an jeder Halterung festziehen. Und dann durch Anziehen der Rändelschrauben an der Unterseite der Halterung. Stecken Sie das Netzkabel in den Blitzanschluss an der Rückseite der Zentrifuge.

Setzen Sie dann die Rotoren gerade auf die Nabe des Zentrifugenantriebs und befestigen Sie sie mit einem Inbusschlüssel mit T-Griff. Setzen Sie dann die Baugruppe, die die Abschlämmungskammer, das Gegengewicht, die rotierende Dichtungsbaugruppe und eine Montageplatte enthält, auf den Rotor. Drücken Sie gleichmäßig nach unten, indem Sie eine Hand auf die Schlämmkammer und die andere Hand auf das Gegengewicht legen, bis die Schrauben am Rotor einrasten.

Setzen Sie den Stift, der sich an einem Ende des Kabels befindet, in das Loch in der rotierenden Dichtungsbaugruppe ein. Und befestigen Sie das Augenloch am anderen Ende mit einer der Kreuzschlitzschrauben, die an der Halterung befestigt sind, um das Verankerungsseil zu verbinden. Um das Durchflusssystem zusammenzubauen und den Puffer in die und aus der Schlämmkammer zu pumpen, schließen Sie einen Schlauch der Größe 16 an eine Pumpe mit variabler Drehzahl an.

Führen Sie ein freies Ende dieses Schlauchs durch eine Öffnung oben links in der Zentrifugenkammer, so dass es in die Kammer eintritt. Befestigen Sie eine Armatur am freien Ende dieses Rohrs und setzen Sie die Armatur dann in das Eingangsloch der rotierenden Dichtungsbaugruppe ein. Führen Sie abschließend den Ausgangsschlauch durch einen Anschluss ein, um ihn am Transferrohr oben an der rotierenden Dichtungsbaugruppe zu befestigen.

Sobald das Schlämmsystem zusammengebaut ist, sterilisieren Sie es, indem Sie das andere freie Ende des Eingangsschlauchs in eine 500-Milliliter-Flasche legen, die mit 5 % Bleiche gefüllt ist. Und legen Sie den Ausgangsschlauch in eine leere Ein-Liter-Abfallflasche. Schalten Sie als Nächstes die Pumpe ein und lassen Sie das Bleichmittel den ganzen Weg durch das Schlämmsystem fließen, bis es in die Abfallflasche gepumpt wird.

Schalten Sie nun die Zentrifuge ein und lassen Sie sie auf die maximal angegebene Drehzahl kommen, um Blasen und Gegendruck abzulassen. Sobald die eingestellte Drehzahl erreicht ist, stoppen Sie die Zentrifuge. Nachdem der Rotor vollständig gestoppt wurde, öffnen Sie den Deckel und untersuchen Sie die Kammer auf Undichtigkeiten.

Lassen Sie anschließend auf ähnliche Weise, wie zuvor beschrieben, steriles Wasser 10 Minuten lang durch das System laufen. Ersetzen Sie den Wasserbehälter nach dem Spülen mit Wasser durch eine sterile Glasflasche, die mit 100 Millilitern Schlämmpuffer gefüllt ist. Legen Sie den Eingangsschlauch so in diese Flasche, dass er sich ganz unten befindet.

Starten Sie die Zentrifuge und lassen Sie den Puffer durch das System fließen. Nachdem die Reservoirflasche fast leer ist und das Wasser vollständig aus dem System gespült wurde, bewegen Sie den Ausgangsschlauch aus der Abfallflasche in den Behälter, damit der Puffer kontinuierlich durch das System recycelt wird. Schalten Sie zum Schluss die Blitzlampe ein und drehen Sie den Schlummknopf ganz nach links.

Stellen Sie nun das Sichtfenster ein, indem Sie den Knopf langsam nach rechts drehen, so dass die Schlämmkammer deutlich zu sehen ist und das Blitzlicht mit der Drehzahl des Rotors synchronisiert ist. Bereiten Sie die Zellprobe vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die resuspendierten Zellen in die Reservoirflasche mit dem Recycling-Abschlämmungspuffer.

Lassen Sie die Zellen in das System eindringen und erreichen Sie ein Gleichgewicht in der Schlämmungskammer. Um sicherzustellen, dass alle Zellen in der Kammer zurückgehalten werden, nehmen Sie einen Tropfen des Eluenten auf einen Objektträger und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop. Wenn die Probe keine intakten Zellen enthält, bestätigt dies die Retention in der Kammer.

Sobald alle Zellen in die Kammer eingedrungen sind und eine deutliche Grenze an der weißesten Stelle der Kammer zu sehen ist, die Zellen und Gleichgewicht enthält, beginnen Sie mit dem Sammeln von Fraktionen. Bringen Sie den Ausgangsschlauch in ein vorgekühltes konisches 50-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung W1. Sammeln Sie 50 Milliliter Elutriationspuffer in diesem Röhrchen und lagern Sie es auf Eis. Verringern Sie kurz nach dem Sammeln der W1-Fraktion die Zentrifugendrehzahl auf 821 G. Bewegen Sie das Ausgangsröhrchen in das konische Röhrchen mit der Bezeichnung W2 und sammeln Sie bei dieser Geschwindigkeit weitere 50 Milliliter

Ändern Sie weiterhin die Geschwindigkeit und sammeln Sie Fraktionen. Stellen Sie sicher, dass sich Medium im Vorratsbehälter befindet, und lagern Sie die gesammelten Fraktionen immer auf Eis. Nachdem alle Fraktionen gesammelt wurden, stoppen Sie die Zentrifuge und sammeln Sie 50 Milliliter in einem konischen Röhrchen mit der Aufschrift Stopp.

Pelletzellen, die in jeder der Fraktionen gesammelt werden, und zwar nach Bedarf unter Verwendung nachgelagerter Analysen, wie z. B. Durchflusszytometrie oder Western Blotting. Es wird ein Liniendiagramm dargestellt, das den durchschnittlichen Durchmesser der Zellen in aufeinanderfolgenden Elutriationsfraktionen anzeigt. Beachten Sie, dass je größer der Zelldurchmesser ist, desto höher ist die Bruchzahl, bei der sie eluiert.

Die Ergebnisse der Sortieranalyse der fluoreszierenden aktivierten Zellen zeigen den DNA-Gehalt der Zellen in jeder der 20 Elutrinationsfraktionen. Frühe Fraktionen, F1 bis F5, enthalten fast ausschließlich Zellen mit 2N-DNA-Gehalt, die Zellen in der G1-Phase repräsentieren. Eine Mischung von Zellen in der G1- und S-Phase wurde in den intermediären Fraktionen F6 bis F9 beobachtet. Und Zellen mit 4N-DNA-Gehalt, die Zellen in G2 bis M repräsentieren, wurden ab F10 beobachtet.

Hier sind die Western-Blot-Ergebnisse von der Untersuchung des Gehalts an zellzyklusbezogenen Proteinen in gepoolten Fraktionen von Zellen in der G1-Phase und der G2- bis M-Phase gezeigt. Der G2- bis M-Pool wies im Vergleich zum G1-Pool erwartungsgemäß höhere Konzentrationen von Phospho-Rb und Cyclin B One auf. Das Eins-Signal von Cyclin D war schwach, aber dennoch im G1-Pool nachweisbar und im G2-zu-M-Pool nicht nachweisbar.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sicherzustellen, dass das Schlämmsystem richtig zusammengebaut ist und dass alle Materialien und Lösungen vorbereitet sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzyklusanalysen, Zellviabilitätsassays und Immunoblots durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie therapeutische Wirkstoffe in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase wirken können.