Name: Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Erfahren Sie die zentrifugale Elutriation zur Isolierung akuter lymphoblastischer Leukämie-Zellen in verschiedene Zellzyklusphasen. Diese physikalische Methode ermöglicht die Untersuchung phasenabhängiger Wirkungen von Krebstherapeutika.

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Diese Arbeit wurde von NIH CA109821 (, TCC) unterstützt. Wir danken Beckman Coulter für die großzügige Bereitstellung von Mitteln zur Deckung der Veröffentlichungskosten und für technische Unterstützung bei der Einrichtung und Bedienung des Sammelnetzwerk Systems. Wir danken Dr. Fred Falkenburg für die Bereitstellung von ursprünglichen primären aller Kulturen.

Hinweis: dieses Protokoll wurde optimiert für primäre B-ALL die reichen im Durchmesser von ca. 8 µm (G1-Phase) bis 13 µm (G2/M-Phase) Zellen. Somit können die spezifische Zentrifuge Geschwindigkeiten und Pumpe Flussraten nicht auf Zellen mit verschiedenen Größenbereiche anwendbar. Allerdings können entsprechende Sammelnetzwerk Parameter unter Verwendung der Sedimentation Rate Gleichung geschätzt werden. Zellen sind wie beschrieben 16 auf eine optimale Dichte von 1-3 x 10 6 Zellen/mL in einem definierten serumfreien Medium kultiviert. Mit Ausnahme der Sammlung von Brüchen, bei 4 ° C mit Eis gekühlt Röhren durchgeführt wird, werden alle Schritte durchgeführt, bei Raumtemperatur und die Zentrifuge gesetzt bei 20 ° C mit maximal 24 ° c
 1. Vorbereitung der Sammelnetzwerk Puffer und Materialien <ol><li>zur Verklumpung der Zellen zu verringern, bereiten Sie einen Sammelnetzwerk Puffer von Hank &#39; s mit Phenol rot ergänzt mit 2 % fötalen Rinderserum (Kochsalzlösung (HBSS) ausgeglichen FBS), zum Schutz der Zellen vor mechanischer Belastung während der Sammelnetzwerk Prozess und 1,6 g/L 2-Naphthol-6,8-Disulfonic Säure Dipotassium Salz (NDA), das macht die Zelle außen negativ geladen und reduziert die Verklumpung.
	<ol><li>Eine 50 mL konische Rohr 1,6 g der NDA hinzufügen.</li>
		<li>35 mL HBSS aus eine 1 L Flasche, die 50 mL konische Röhrchen mit NDA unter sterilen Bedingungen hinzufügen. Das Rohr zu schwenken, bis die NDA aufgelöst hat.</li>
		<li>Mit einem 0,2 µm-Filter, die gelöste NDA in eine neue sterile 50 mL konische Rohr übertragen. Fügen Sie dann die NDA zu den verbleibenden 1 L HBSS.</li>
		<li>Schließlich 21 mL FBS hinzufügen HBSS, eine Endkonzentration von 2 % (V/V) zu erhalten. 
		Hinweis: Die Sammelnetzwerk Puffer kann vorbereitet und bei 4 ° C gelagert werden, bis zum Ablaufdatum auf der HBSS oder bis gibt es eine große Veränderung in der pH-Wert durch eine Gelbfärbung der Indikatorfarbstoff.</li>
	</ol></li> <li>Label 50 mL konische Rohre für die Sammlung der Fraktionen, so dass gibt es Röhren mit der Bezeichnung 1 und 2 (W1 und W2), Brüche 1-20 (F1 - F20) zu waschen und zu stoppen.
	<ol><li>Pre-chill diese Rohre auf dem Eis vor der Erhebung Brüche.</li>
	</ol></li></ol> 2. Montage des Systems Elutriation <ol><li>zuerst installieren die Strobe-Versammlung in der Zentrifuge, so, dass das Netzkabel aus der Kammer durch den Hafen auf der linken Seite zugeführt wird. Sicherstellen Sie, dass die Strobe-Blitzlampe an der Vorderseite der Kammer, ist so es mit Sichtfenster Line-up wird geschlossenem Zentrifuge.
	<ol><li>Die Versammlung im Ort zu sichern, indem Sie zuerst anziehen 2 Kreuzschlitz Schrauben in die zwei Löcher am oberen Rand jeder Bügel und dann durch Anziehen der Rändelschrauben am unteren Rand jeder Bügel.</li>
		<li>Stecken Sie das Netzkabel in die Strobe-Netzanschluss auf der Rückseite der Zentrifuge.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes absetzen den Rotor direkt auf der Zentrifuge Antrieb Nabe und sichern Sie mit einem T-Griff Inbusschlüssel. 
	Hinweis: Wenn die Zentrifuge nicht Sammelnetzwerk Zwecken nicht erforderlich ist, die Strobe-Versammlung und der Rotor können gehalten werden in der Zentrifuge zwischen Läufen.</li>
	<li>Sobald der Rotor gesichert ist, legen Sie die Quick-Release-Baugruppe mit der Sammelnetzwerk Kammer, Gegengewicht, Dichtungs-Baugruppe und Montageplatte in den Rotor drehen.
	<ol><li>Drücken Sie gleichmäßig mit einer Hand am Sammelnetzwerk und andererseits an das Gegengewicht bis der Bolzen in den Rotor in die Löcher auf der Montageplatte einrasten.</li>
		<li>Schließen Sie abschließend das verankern Kabel indem die Pin auf der einen Seite des Kabels in das Loch in der rotierenden Dichtungs-Baugruppe und Sicherung der Türspion auf der anderen Seite des Kabels mit einem Kreuzschlitz Schrauben (erwähnt in 2.1.1) an der Halterung an der linken Seite die Kammer f.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes montieren die Flow-System mit einem drehzahlgeregelten Pumpe und Schlauch zu Pumpe Puffer in der Sammelnetzwerk Kammer und Puffer zu sammeln, wie es aus der Sammelnetzwerk Kammer fließt.
	<ol><li>Einsatz der Größe 16 Eingang Schlauch aus der drehzahlgeregelten Pumpe über den Anschluss an die Spitze der Zentrifuge Kammer, links so dass es in die Kammer eintritt.</li>
		<li>Legen eine passende auf das freie Ende der Eingabe Schlauch und Armatur in der Eingabe Loch an der Seite der rotierenden Dichtungs-Baugruppe einfügen.</li>
		Legen Sie die Größe 16 Ausgang Schlauch durch den Hafen und hängen Sie es an das Übertragungsrohr an der Spitze des rotierenden <li>Dichtung Montage. 
		Hinweis: Die Flow-System kann auch montiert zwischen Sammelnetzwerk Läufe bleiben.</li>
	</ol></li> <li>Zu guter Letzt Einschalten die Zentrifuge und die Spezifikationen für das Experiment.
	<ol><li>Änderung der Rotor ID.</li>
		<li>Wenn die Zentrifuge ein Zeitaufwand erfordert, festgelegt für 2 h, was mehr als ausreichend, um eine Sammelnetzwerk laufen zu vervollständigen ist.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur auf 20 ° C mit einer max. Temp von 24 ° c</li>
		<li>Legen Sie die Beschleunigung für Max und die Verzögerung für langsam.</li>
		<li>Schließlich stellen Sie die Geschwindigkeit bis 867 X g.</li>
	</ol></li></ol> 3. Grundierung der Sammelnetzwerk System <ol><li>zuerst um das Sammelnetzwerk System zu sterilisieren, legen die Reservoir-Schlauch in einer 500 mL Kunststoff-Flasche mit 5 % Bleichmittel und den Ausgang Schlauch in eine leere 1 L-Kunststoff-Abfall-Flasche.
	<ol><li>Schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie die Geschwindigkeit auf 25 mL/min und ermöglichen das 5 % Bleichmittel zu ganzen Weg durch das Sammelnetzwerk System fließen, bis es aus dem Ausgabe-Rohr in die Abfallflasche gepumpt wird.</li>
		<li>Die Zentrifuge einschalten und warten sie, um die maximale Geschwindigkeit (867 X g) bezeichnet, um Luftblasen und Gegendruck freizusetzen.</li>
		<li>Stoppen die Zentrifuge. Wenn der Rotor nicht rotiert mehr, den Deckel öffnen und inspizieren die Kammer für alle undichten Stellen.</li>
		<li>Gibt es keine Lecks, lassen Sie das Bleichmittel-Lösung fließen durch das System für mindestens 5 min.</li>
	</ol></li> <li>Als nächstes das Spülsystem mit autoklaviert Wasser als Bleichmittel zu Bildung von Ausscheidungen aus dem Puffer Sammelnetzwerk, die kann zur Verklumpung der Zellen führen führen kann, sowie Schäden an den Zellen verursachen.
	<ol><li>Ort der Reservoir-Schlauch in eine 1 L Flasche autoklaviert Wasser und lassen Sie es für mindestens 10 Minuten durch Spülen</li>
	</ol></li> <li>Nach dem Spülen mit Wasser, Sammelnetzwerk Puffer in das System einführen. Verwenden Sie eine 150 mL Glasflasche autoklaviert erstelle ich ein Reservoir für die Sammelnetzwerk Puffer und Zellen wurde.
	<ol><li>Die Flasche 100 mL Sammelnetzwerk Puffer hinzu und verschieben Sie das Reservoir Schlauch zur Glasflasche, so dass die Röhren an der Unterseite.</li>
		<li>Die Zentrifuge starten und lassen Sie den Puffer durch das System zu spülen, das Wasser fließen.</li>
		<li>Sobald die Vorratsflasche fast leer ist und das Wasser wird vollständig aus dem System heraus gespült, bewegen die Ausgabe Schläuche aus der Abfallflasche zum Stausee, dass der Puffer durch das System wiederverwertet wird.</li>
	</ol></li> <li>Schließlich das Sichtfenster so einstellen, dass die aktuelle Geschwindigkeit die Sammelnetzwerk Kammer eingesehen werden kann.
	<ol><li>Presse die Strobe Lampe / aus-Taste an der Außenseite der Zentrifuge so dass die Lampe einschaltet. Drehen Sie die Sammelnetzwerk kNob auch auf der Außenseite der Zentrifuge ganz nach links.</li>
		<li>Während langsam durch das Sichtfenster auf der Suche Drehen der Regler nach rechts, bis die Sammelnetzwerk Kammer in Sicht und das Blitzlicht kommt rechtzeitig mit der Drehung des Rotors ist. 
		Hinweis: Das Sammelnetzwerk System kann gelassen werden in diesem Zustand bis die Zellen desinfiziert werden.</li>
	</ol></li></ol> 4. Vorbereitung der die Zellprobe <ol><li>Anzahl Zellen und aliquoten 300 bis 400 Millionen im Wachstumsmedium in mehreren 50 mL konische Röhrchen. Spin-down der Zellen bei 1210 X g für 3 min.</li>
	<li>Aspirat aus Wachstum Medien und Aufschwemmen Zellen in 25 mL Sammelnetzwerk Puffer durch sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Verringerung des Zell-Verklumpung, Pass Zellen zweimal durch eine 25 gauge Nadel.
	<ol><li>Mit einer 10 mL Spritze zeichnen die Zellen und dann 25 Gauge-Nadel befestigen und die Zellen durch auf der Innenseite Wand einer sterilen 50 mL konische Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle 25 mL die Nadel durchlaufen haben.</li>
		<li>Erhalten eine neue Nadel und Spritze und wiederholen Sie den Vorgang oben einmal. 
		Achtung: Spritze Nadeln sollten in Sharps Container platziert werden. 
		Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen durch die Nadel geschoben, sind unmittelbar vor der Einführung in das Sammelnetzwerk System um Zelle Verklumpung auf ein Minimum.</li>
	</ol></li></ol> 5. Einführung der Zellprobe in das Elutriation System und Sammlung der Fraktionen <ol><li>Einführung in das Sammelnetzwerk System durch Gießen die Zellprobe in dem Behälter mit den restlichen Sammelnetzwerk Puffer recycling durch die Zellprobe .
	<ol><li>Lassen Sie die Zellen in das System eingeben und erreichen Gleichgewicht innerhalb der Kammer Sammelnetzwerk. 
		Hinweis: Dieser Vorgang dauert ca. 5 min. und Fortschritt kann durch die Beobachtung der Zellen beim Eintritt in der Kammers über das Sichtfenster verfolgt werden. Um sicherzustellen, dass alle Zellen in der Kammer, nimm einen Tropfen des Elutionsmittels, legen Sie auf einen Objektträger und unter dem Mikroskop betrachten. Wenn die Probe frei von intakten Zellen, dies bestätigt ihre Aufbewahrung in der Kammer.</li>
	</ol></li> <li>Fraktionen sammeln, sobald alle Zellen in die Kammer getreten und es eine deutliche Grenze an der breitesten Stelle der Kammer gibt, in dem die Zellen im Gleichgewicht sind.
	<ol><li>Beginnen indem das Ausgabe-Rohr auf die 50 mL konische Röhrchen beschriftet W1. Sammeln Sie 50 mL Sammelnetzwerk Puffer für dieser Bruch, achten Sie darauf, halten ein Auge auf den Vorratsbehälter und mit Sammelnetzwerk Puffer bei Bedarf auffüllen. 
		Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle Zellen in das System eingegeben haben, können Sie der Behälter fast leer werden vor dem Nachfüllen des Stausees zum ersten Mal. Nach dem ersten Nachfüllen werden nicht nötig zu warten, bis der Behälter fast leer zu. Auch nicht immer erlauben den Tank leer werden, da diese Bläschen und Gegendruck im System anlegen wird.</li>
		<li>Sobald 50 mL für W1 gesammelt worden, gleichzeitig ändern Sie die Geschwindigkeit auf 821 X g und bewegen das Ausgabe-Rohr mit dem konischen Rohr beschriftet W2 und sammeln Sie mehr im selben Tempo 50 mL.</li>
		<li>Weiter Änderung der Geschwindigkeit und Brüche zu sammeln, wie in Tabelle 1 angegeben. Stellen Sie sicher, es gibt Medien in das Reservoir tank und behalten Sie stets die konischen Rohren auf Eis. Schließlich stellen Sie das Sichtfenster durch langsames Drehen der Regler nach rechts, da die Geschwindigkeit abnimmt.</li>
		<li>Einmal alle 20 Fraktionen gesammelt worden, die Zentrifuge zu stoppen und sammeln Sie 50 mL in der konischen Röhre mit der Aufschrift STOP.</li>
	</ol></li></ol> 6. Spülen der Elutriation System <ol><li>, nachdem die Zentrifuge das System vollständig bündig aufgehört hat, indem man die Reservoir-Schlauch in der 1 L Wasserflasche autoklaviert und den Ausgang Schlauch zurück in die Abfallflasche.
	<ol><li>Die Pumpendrehzahl bis 50 mL/min drehen und lassen Sie das Wasser durch das System laufen lassen, bis dieses aufgebraucht ist.</li>
	</ol></li> <li>Schalten Sie die Pumpe den Eingangs- und Schlauch vom Schnellspanner Montage entfernen, und ziehen Sie den Stift aus der Verankerung Kabel.
	<ol><li>Schnellverschluss-Versammlung vom Rotor entfernen. 
		Hinweis: Je nachdem, was die Zentrifuge für verwendet, kann das Sammelnetzwerk-System nun so belassen werden. Andernfalls kann die ganze Versammlung in umgekehrter Reihenfolge abgebaut werden wie oben beschrieben. Die Sammelnetzwerk Kammer kann aus der Schnellspanner Montage entfernt und zwischen den Läufen mit einem Ultraschall Wasserbad gereinigt. Dies entfernt Schmutz und Verunreinigungen aus der Kammerwand die späteren Auflagen negativ beeinflussen kann.</li>
	</ol></li></ol> 7. Analyse der Fraktionen und Sammlung der G1 oder G2/M Pools.
 Hinweis: um die Wirksamkeit des Sammelnetzwerk zu demonstrieren, wird jede Fraktion für Zellzahl, Zelle Durchmesser und DNA-Gehalt analysiert und Pools sind Zellen in G1 oder G2/M Phasen für Immunoblot Analysen erstellt, wie in beschrieben Vertreter Ergebnisse. Dieses Protokoll Abschnitt wird beschrieben, wie Sie erstellen diese Pools und bereiten sie für Versuchszwecke.
<ol><li>Spin jede Fraktion bei 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Aspirat aus Sammelnetzwerk Puffer.</li>
	<li>Mähdrescher Fraktionen zusammen, um ein G1-Phase-Pool und einen G2/M-Phasen-Pool zu erhalten.
	<ol><li>Für G1 phase Pool, Brüche, die im Drehzahlbereich von 788 X g 661 X g (F1 - F5) gesammelt wurden insgesamt 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) und Übertragung auf eine 15 mL konische Rohr Aufschwemmen. Für die G2/M-Phasen-Pool Aufschwemmen Brüche die im Drehzahlbereich von 387 x g und 333 X g (F17 - F20) gesammelt wurden.</li>
		<li>Spin-down Zellen 2000 X g für 5 min bei 4 ° C und Absaugen von PBS.</li>
	</ol></li> <li>Zellen in 10 mL Wachstumsmedien Aufschwemmen und nehmen eine Zellzahl.</li>
	<li>Eine Aliquote aus jedem Pool für DNA analysiert werden Inhalte über Propidium Jodid Färbung nehmen und fließen durchflusszytometrischen Analyse 15. 
	Hinweis: Der Rest der einzelnen Pools kann für weitere Experimente verwendet werden.</li>
</ol>

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</ol>

Anisha Kothari liegt derzeit bei der Abteilung für Zell- und Molekularbiologie an der St. Jude Children Research Hospital.

Wir haben einer Methode für den Erhalt der primären alle Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit CCE beschrieben. Unter optimalen Bedingungen eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen könnte ohne weiteres eingeholt werden hervorragende Ausbeute und Zellen hochangereichertes in S-Phase können auch erhalten werden, wenn gewünscht. Die hier präsentierten Ergebnisse wurden mit eine eigenständige Kultur, ALL-2<sup class...

Kultivierte Zellen wachsen in der Regel asynchron und Einzelzellen sind in verschiedenen Phasen des Zellzyklus. Einige Organismen weisen natürlich synchronen Zelle Zyklen oder durch bestimmte physiologische Reize synchronisiert werden können. Zum Beispiel teilen Kerne in riesigen Plasmodien von Slime Mold Physarum Polycephalum in einem sehr synchron Mode1und Zellen der grünen Algen, die Desmodesmus Quadricauda synchronisiert werden kann, durch den Wechsel von hellen und dunklen Perioden2. Während solche Organismen einzigartige experimentelle Attribute bieten, modellieren sie unzureichend die Komplexität von Säugerzellen. Die Möglichkeit, künstlich Säugetier-Zellenbevölkerungen synchronisieren wurde zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Zellzyklus-Verordnung und die molekulare Basis der Zellzyklus Checkpoints voranzutreiben. Gängige Methoden gehören Serum Entbehrung, chemische Block- und Veröffentlichung oder Nutzung von physikalischen Eigenschaften3,4. Rücknahme von Serum führt oft Zellen geben Sie Ruhe, und die erneute Zugabe von Serum fördert Wiedereintritt der Zellzyklus in der G1-Phase5. Chemische Inhibitoren gehören Stoffe wie überschüssige Thymidin oder Hydroxyurea die Zellen an der G1/S-Grenze zu blockieren oder Mikrotubuli-Inhibitoren die Zellen in der M Phase3,4in der Regel zu verhaften. Ansätze, die physikalische Eigenschaften ausnutzen gehören mitotischen Shake-off die bereichern für mitotischen Zellen verwendet werden kann, da sie weniger Anhänger als Interphase Zellen6sind. Alle diese Techniken haben jedoch mögliche Nachteile. Zum Beispiel pflegen nicht alle Zelltypen Lebensfähigkeit in der Abwesenheit von Serum oder das Vorhandensein von chemischen Inhibitoren und die Ausbeute an Zellen nach mitotischen Shake-off ohne vorherige Synchronisation mit mitotischen Inhibitoren beschränkt.
Mit Ausnahme der frühen embryonalen Zelle Zyklen, wo Zellen nach und nach in der Größe zurückgehen, da sie7teilen, die meisten Zellen durch den Zyklus Wachstumsphasen zu unterziehen und größer geworden. Diese Eigenschaft wird in der Technik der Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE) ausgenutzt, die kann verwendet werden, um Zellen unterschiedlicher Größe zu trennen und somit im Zellzyklus phase8,9. Während der CCE, Zellen werden unter dem Einfluss der beiden gegensätzlichen Kräfte: Zentrifugalkraft, die die Zellen von der Drehachse antreibt, und Fluidgeschwindigkeit (Gegenstrom), die die Zellen in Richtung der Drehachse (Abbildung 1) antreibt. Zellen in der Sammelnetzwerk Kammer erreichen eine Gleichgewichtslage, wo diese Kräfte gleich sind. Die wichtigsten Faktoren diktiert die Gleichgewichtslage sind Zelle Durchmesser und Dichte. Als der Fluss der Pufferlösung erhöht und die Widerstandskraft der Gegenstrom überwiegt die Fliehkraft, ein neues Gleichgewicht entsteht, verursacht eine Änderung in der Position der Zellen im Inneren der Kammer. Alle Zellen sind die Kammer-Ausgang, was zu kleineren verlassen die Kammer zunächst, während die größeren Zellen innerhalb der Kammer bleiben, bis die Gegenstrom-Rate ausreichend erhöht wird, um die Ausfahrt zu fördern verschoben. Die Flucht der Sammelnetzwerk Kammer mit aufeinander folgenden Erhöhungen Gegenstrom Zellen können in bestimmten Fraktionen gesammelt und jede Fraktion enthält Zellen nacheinander Größen zu erhöhen. Statt Sammelnetzwerk mit inkrementellen Erhöhungen Gegenstrom, werden fortlaufende Rückgang der Zentrifugalkraft durch Zentrifugation Geschwindigkeit verringern das gleiche Ergebnis erreichen. Der Prozess der Sammelnetzwerk erfordert Optimierung je nach Zelltyp, Sammelnetzwerk Puffer eingesetzt und das spezifische Gerät verwendet. Die Rate der Sedimentation der Zellen unter diesen Bedingungen wird am besten durch Stokes Gesetz beschrieben: SV = [d2(ρp- ρm) / 18η] .ω2R, wo SV = Sedimentation Geschwindigkeit; d = Durchmesser des Teilchens; Ρp = Dichte des Teilchens; Ρm = Dichte des Puffers; Η = Viskosität des Puffers; Ω = Winkelgeschwindigkeit des Rotors; und R = radiale Position des Partikels. So, SV ist proportional zur Zelle Durchmesser und Dichte, und da Durchmesser auf die zweite Kraft angehoben, es leistet mehr als Dichte, die in der Regel konstant durch den Zellzyklus ist.
Ein wichtiger Vorteil der CCE ist, dass Zellen nicht einer rauen chemische Behandlung oder ernährungsphysiologischen Entbehrung unterliegen und hervorragende Ausbeute im wesentlichen unbeirrt zurückgewonnen werden. Voraussetzung ist, dass die fraglichen Zellen eine deutliche Zunahme der Durchmesser von mindestens 30 % zu unterziehen, wie sie den Zellzyklus durchqueren. Der größte Nachteil sind die Kosten der spezialisierten Zentrifuge, Rotor und Zubehör. Dennoch hat die Fähigkeit, Zellen in bestimmten Zellzyklus Phasen von CCE bereichert bereiten Zellzyklus Forschung in Organismen aus Hefe auf Säugerzellen9,10erheblich erleichtert. Darüber hinaus sind die jüngsten Fortschritte verwendet zur Trennung von Zellen von gesunden versus Krebsgewebe, die Trennung der verschiedenen Zelltypen in heterogenen Gemischen und zur Produktion von bestimmten Zelltypen für Immuntherapie9erweitert.
Unser Hauptinteresse ist für das Verständnis des Wirkmechanismus von Mikrotubuli targeting Agents (MTAs) wie Vinca Alkaloide und Taxane gewesen. Diese Medikamente wurden gedacht, um ausschließlich in Mitose, blockieren Spindel Mikrotubuli Funktion11,12, handeln, aber den letzten Beweis schlägt vor, dass sie auch Interphase Microtubules13,14Zielen können. Wir berichteten kürzlich, dass primäre akute lymphoblastische Leukämie (ALL) Zellen Tod entweder der G1-Phase unterziehen oder in der M phase, wenn mit Vincristin und anderen MTAs im Zellzyklus-abhängigen Weise15behandelt. Die Fähigkeit, alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen von CCE zu trennen war maßgeblich an dieser Schlussfolgerung. In diesem Artikel wir beschreiben die technischen Details und bieten praktische Tipps für die Anwendung des CCE zur Vorbereitung des primären alle Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen.

<table><tbody><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>1 L Flasche</td></tr><tr><td>Fetal Plus Rinderserum</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>500 mL Flasche</td></tr><tr><td>2-Napthol-6,8-Disulfonsäure Dikaliumsalz</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g Pulver</td></tr><tr><td>50 mL Konzialröhrchen</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/Karton</td></tr><tr><td>PES Membran 0,22 &Mikro; m Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250/Pack</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI m/ Elut. Nicht-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240 V</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>Zentrifuge, kompatibel mit dem Elutriationssystem</td></tr><tr><td>JE 5.0 Rotorsatz</td><td>Beckman Coulter</td><td>356900</td><td>Rotorsatz, der den Rotor, den Inbusschlüssel mit T-Griff, die Schnellspanngarnitur (ohne Elutriationskammer), das Verankerungskabel und die Blitzbaugruppe</td></tr><tr><td>enthält Kammer, Standard, 4 ml, "A"</td> <td>Beckman Coulter 356943</td><td></td><td>Standard-Schlämmkammer&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load Pumpenkopf</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Frequenzumrichter</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex BioPharm platinvernetzter Silikonpumpenschlauch, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1,5 Precision Glide Nadel</td><td>BD</td><td>305127</td><td>sterile Einwegnadeln</td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td>sterile Einmalspritzen</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>PI/RNase Färbepuffer</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>Propidiumiodid/RNase Färbepuffer</td></tr><tr><td>Cyclin B1 (GNS1) monoklonaler Maus-IgG-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>Cyclin D1 (DCS-6) monoklonaler Maus-IgG-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR monoklonaler Kaninchen-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) monoklonaler Kaninchen-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-HRP-Konjugat</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-HRP-Konjugat</td><td>BioRad</td><td>Tel.: 170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung der primäre akute lymphoblastische leukämie-zellen in verschiedenen zellzyklus phasen durch zentrifugale sammelnetzwerk

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Die Fähigkeit, Zellen zu synchronisieren ist zentraler Bedeutung für unser Verständnis des Zellzyklus Verordnung gewesen. Gemeinsame Techniken umfassen Serum Entbehrung; Chemikalien, die Zellen in verschiedene Zellzyklus Phasen zu verhaften; oder die Verwendung der mitotischen Shake-off die Einhaltung der reduzierten nutzt. Jedoch haben alle diese Nachteile. Zum Beispiel arbeitet Serum Hunger gut für normale Zellen aber weniger gut für Tumorzellen mit kompromittierten Zellzyklus Checkpoints aufgrund Onkogen-Aktivierung oder Tumor-Suppressor-Verlust. Ebenso können chemisch behandelte Zellpopulationen Hafen Medikamenten-induzierten Schäden und stressbedingten Veränderungen zeigen. Eine Technik, die diese Probleme umgeht ist Gegenstrom zentrifugale Sammelnetzwerk (CCE), wo Zellen ausgesetzt sind zwei gegensätzliche Kräfte, Fliehkraft und Fluidgeschwindigkeit, wodurch die Trennung der Zellen auf der Grundlage von Größe und Dichte. Da Zellen, die Förderung durch den Zyklus in der Regel vergrößern, einsetzbar CCE Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen. Hier wenden wir diese Technik auf primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen. Unter optimalen Bedingungen erhalten Sie eine im wesentlichen reine Bevölkerung der Zellen in der G1-Phase und eine hoch angereicherten Population von Zellen in der G2/M-Phasen hervorragende Ausbeute. Dieser Zellpopulationen eignen sich ideal für Studium Zellzyklus-abhängige Mechanismen der Wirkung von Krebsmedikamenten und für andere Anwendungen. Wir zeigen, wie Änderungen an der standard-Verfahren kann in suboptimalen Leistung führen und die Grenzen der Technik zu diskutieren. Die detaillierte Methodik vorgestellt sollte Anwendung und Erforschung der Technik auf andere Arten von Zellen erleichtern.

Primäre alle Zellen (3-4 x 108) gesammelt in zwei Fraktionen waschen und zwanzig Hauptfraktionen, wie im Protokoll beschrieben und zentrifugale Sammelnetzwerk ausgesetzt waren. Tabelle 1 zeigt repräsentative Daten wo die Gesamtzahl der Zellen in jeder Fraktion sowie die entsprechenden Rotordrehzahl vorgestellt werden. Alles in allem war die Ausbeute in der Regel über 80 %. Messung des Durchmessers der Zelle in einzelne Fraktionen bestätigt die Zelle Durchmesser erhöht sich mit ...

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen mittels Zentrifugalschlämmung in verschiedene Zellzyklusphasen zu isolieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Krebstherapeutika zu beantworten. Denn die Isolierung der Zellen in separate Phasen ermöglicht die Untersuchung der phasenabhängigen Wirkungen von Anti-Krebs-Wirkstoffen.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Trennung von Zellen in bestimmte Phasen anhand physikalischer Eigenschaften und nicht chemischer Störungen ermöglicht. Um das Experiment zu starten, installieren Sie die Blitzbaugruppe so in der Zentrifuge, dass das Netzkabel durch den Anschluss auf der linken Seite aus der Kammer geführt wird. Stellen Sie die Blitzlampe so ein, dass sie mit dem Sichtfenster ausgerichtet ist, wenn die Zentrifuge geschlossen ist.Befestigen Sie die Baugruppe, indem Sie zwei Kreuzschlitzschrauben oben an jeder Halterung festziehen. Und dann durch Anziehen der Rändelschrauben an der Unterseite der Halterung. Stecken Sie das Netzkabel in den Blitzanschluss an der Rückseite der Zentrifuge.Setzen Sie dann die Rotoren gerade auf die Nabe des Zentrifugenantriebs und befestigen Sie sie mit einem Inbusschlüssel mit T-Griff. Setzen Sie dann die Baugruppe, die die Abschlämmungskammer, das Gegengewicht, die rotierende Dichtungsbaugruppe und eine Montageplatte enthält, auf den Rotor. Drücken Sie gleichmäßig nach unten, indem Sie eine Hand auf die Schlämmkammer und die andere Hand auf das Gegengewicht legen, bis die Schrauben am Rotor einrasten.Setzen Sie den Stift, der sich an einem Ende des Kabels befindet, in das Loch in der rotierenden Dichtungsbaugruppe ein. Und befestigen Sie das Augenloch am anderen Ende mit einer der Kreuzschlitzschrauben, die an der Halterung befestigt sind, um das Verankerungsseil zu verbinden. Um das Durchflusssystem zusammenzubauen und den Puffer in die und aus der Schlämmkammer zu pumpen, schließen Sie einen Schlauch der Größe 16 an eine Pumpe mit variabler Drehzahl an.Führen Sie ein freies Ende dieses Schlauchs durch eine Öffnung oben links in der Zentrifugenkammer, so dass es in die Kammer eintritt. Befestigen Sie eine Armatur am freien Ende dieses Rohrs und setzen Sie die Armatur dann in das Eingangsloch der rotierenden Dichtungsbaugruppe ein. Führen Sie abschließend den Ausgangsschlauch durch einen Anschluss ein, um ihn am Transferrohr oben an der rotierenden Dichtungsbaugruppe zu befestigen.Sobald das Schlämmsystem zusammengebaut ist, sterilisieren Sie es, indem Sie das andere freie Ende des Eingangsschlauchs in eine 500-Milliliter-Flasche legen, die mit 5 % Bleiche gefüllt ist. Und legen Sie den Ausgangsschlauch in eine leere Ein-Liter-Abfallflasche. Schalten Sie als Nächstes die Pumpe ein und lassen Sie das Bleichmittel den ganzen Weg durch das Schlämmsystem fließen, bis es in die Abfallflasche gepumpt wird.Schalten Sie nun die Zentrifuge ein und lassen Sie sie auf die maximal angegebene Drehzahl kommen, um Blasen und Gegendruck abzulassen. Sobald die eingestellte Drehzahl erreicht ist, stoppen Sie die Zentrifuge. Nachdem der Rotor vollständig gestoppt wurde, öffnen Sie den Deckel und untersuchen Sie die Kammer auf Undichtigkeiten.Lassen Sie anschließend auf ähnliche Weise, wie zuvor beschrieben, steriles Wasser 10 Minuten lang durch das System laufen. Ersetzen Sie den Wasserbehälter nach dem Spülen mit Wasser durch eine sterile Glasflasche, die mit 100 Millilitern Schlämmpuffer gefüllt ist. Legen Sie den Eingangsschlauch so in diese Flasche, dass er sich ganz unten befindet.Starten Sie die Zentrifuge und lassen Sie den Puffer durch das System fließen. Nachdem die Reservoirflasche fast leer ist und das Wasser vollständig aus dem System gespült wurde, bewegen Sie den Ausgangsschlauch aus der Abfallflasche in den Behälter, damit der Puffer kontinuierlich durch das System recycelt wird. Schalten Sie zum Schluss die Blitzlampe ein und drehen Sie den Schlummknopf ganz nach links.Stellen Sie nun das Sichtfenster ein, indem Sie den Knopf langsam nach rechts drehen, so dass die Schlämmkammer deutlich zu sehen ist und das Blitzlicht mit der Drehzahl des Rotors synchronisiert ist. Bereiten Sie die Zellprobe vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die resuspendierten Zellen in die Reservoirflasche mit dem Recycling-Abschlämmungspuffer.Lassen Sie die Zellen in das System eindringen und erreichen Sie ein Gleichgewicht in der Schlämmungskammer. Um sicherzustellen, dass alle Zellen in der Kammer zurückgehalten werden, nehmen Sie einen Tropfen des Eluenten auf einen Objektträger und betrachten Sie ihn unter einem Mikroskop. Wenn die Probe keine intakten Zellen enthält, bestätigt dies die Retention in der Kammer.Sobald alle Zellen in die Kammer eingedrungen sind und eine deutliche Grenze an der weißesten Stelle der Kammer zu sehen ist, die Zellen und Gleichgewicht enthält, beginnen Sie mit dem Sammeln von Fraktionen. Bringen Sie den Ausgangsschlauch in ein vorgekühltes konisches 50-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung W1. Sammeln Sie 50 Milliliter Elutriationspuffer in diesem Röhrchen und lagern Sie es auf Eis. Verringern Sie kurz nach dem Sammeln der W1-Fraktion die Zentrifugendrehzahl auf 821 G. Bewegen Sie das Ausgangsröhrchen in das konische Röhrchen mit der Bezeichnung W2 und sammeln Sie bei dieser Geschwindigkeit weitere 50 Milliliter.Ändern Sie weiterhin die Geschwindigkeit und sammeln Sie Fraktionen. Stellen Sie sicher, dass sich Medium im Vorratsbehälter befindet, und lagern Sie die gesammelten Fraktionen immer auf Eis. Nachdem alle Fraktionen gesammelt wurden, stoppen Sie die Zentrifuge und sammeln Sie 50 Milliliter in einem konischen Röhrchen mit der Aufschrift Stopp.Pelletzellen, die in jeder der Fraktionen gesammelt werden, und zwar nach Bedarf unter Verwendung nachgelagerter Analysen, wie z. B. Durchflusszytometrie oder Western Blotting. Es wird ein Liniendiagramm dargestellt, das den durchschnittlichen Durchmesser der Zellen in aufeinanderfolgenden Elutriationsfraktionen anzeigt. Beachten Sie, dass je größer der Zelldurchmesser ist, desto höher ist die Bruchzahl, bei der sie eluiert.Die Ergebnisse der Sortieranalyse der fluoreszierenden aktivierten Zellen zeigen den DNA-Gehalt der Zellen in jeder der 20 Elutrinationsfraktionen. Frühe Fraktionen, F1 bis F5, enthalten fast ausschließlich Zellen mit 2N-DNA-Gehalt, die Zellen in der G1-Phase repräsentieren. Eine Mischung von Zellen in der G1- und S-Phase wurde in den intermediären Fraktionen F6 bis F9 beobachtet. Und Zellen mit 4N-DNA-Gehalt, die Zellen in G2 bis M repräsentieren, wurden ab F10 beobachtet.Hier sind die Western-Blot-Ergebnisse von der Untersuchung des Gehalts an zellzyklusbezogenen Proteinen in gepoolten Fraktionen von Zellen in der G1-Phase und der G2- bis M-Phase gezeigt. Der G2- bis M-Pool wies im Vergleich zum G1-Pool erwartungsgemäß höhere Konzentrationen von Phospho-Rb und Cyclin B One auf. Das Eins-Signal von Cyclin D war schwach, aber dennoch im G1-Pool nachweisbar und im G2-zu-M-Pool nicht nachweisbar.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und sicherzustellen, dass das Schlämmsystem richtig zusammengebaut ist und dass alle Materialien und Lösungen vorbereitet sind. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zellzyklusanalysen, Zellviabilitätsassays und Immunoblots durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie therapeutische Wirkstoffe in Abhängigkeit von der Zellzyklusphase wirken können.

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Research

Forschung

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Cancer Research

Krebsforschung

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Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

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