Überexpression und Reinigung des Menschen Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Codon-optimierte humane cis-Prenyltransferase unter nicht denaturierenden Bedingungen zu überexprimieren und zu reinigen und ihre enzymatische Aktivität zu testen. Das Verfahren wird mit der eukaryotischen langkettigen cis-Prenyltransferase Dehydrodolichyldiphosphatsynthase (DHDDS) demonstriert. Diese Methode kann unser Verständnis der Isoprenoidsynthese verbessern und wichtige Einblicke in den pathophysiologischen Mechanismus der Retinitis pigmentosa im Zusammenhang mit Mutationen in DHDDS liefern.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach, kostengünstig und zeitsparend ist. Es kann auch für die Produktion anderer cis-Prenyltransferase-Proteine in großen Mengen verallgemeinert werden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Klonen einer Expression von humanem DHDDS, wie im Textprotokoll beschrieben.

Resuspendieren Sie die Zellen in Puffer A, einem Mikrogramm pro Milliliter DNase I und einer Proteaseinhibitor-Mischung. Homogenisieren Sie dann die resuspendierten Zellen mit einem Teflon-Homogenisator aus Glas. Zerstören Sie die Zellen mit einem Mikrofluidisierer oder einem gleichwertigen Wert bei 12.000 bis 15.000 psi.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 40.000 g für 45 Minuten bei vier Grad Celsius. Der Überstand, der die lösliche Fraktion enthält, wird zurückgewonnen. Laden Sie den Überstand auf eine fünf bis 10 Millimeter große kobaltimmobilisierte Metall-Affinitätschromatographiesäule mit 10 millimolarem Imidazol.

Nach dem Laden in ein schnelles Proteinflüssigkeitschromatographiegerät ist die Säule gründlich mit Puffer A in 10 millimolarem Imidazol zu waschen, um die unspezifische Proteinbindung zu reduzieren. Starten Sie das FPLC-Programm. Eluieren Sie die überexprimierten Proteine mit Puffer A, der mit 250 millimolaren Imidazol ergänzt ist.

Nach der Elution entfernen Sie das Imidazol mit 53 Millilitern einer präparativen Entsalzungssäule, die mit Puffer A äquilibriert ist. Fügen Sie dann den eluierten Proteinen Hexahistidin-markierte TEV-Protease hinzu, um ihre Hexahistidin-markierte Thioredoxin-DHDDS-Fusion zu entfernen. Inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius. Als nächstes laden Sie die gespaltenen Proteine auf eine kobaltimmobilisierte Metallaffinitätschromatographiesäule, die mit Puffer A und fünf Millimolar Imidazol angereichert ist.

Sammeln Sie den Durchfluss, um das gespaltene Hexahistidin-markierte Thioredoxin und die TEV-Protease zu entfernen. Konzentrieren Sie den Durchfluss auf drei bis vier Milliliter mit einem 30-Kilodalton-Zentrifugalfilter mit Molekulargewicht. Laden Sie dann das konzentrierte Protein zur endgültigen Aufreinigung auf eine Superdex 200-Ausschlusschromatographiesäule, die mit Puffer A äquilibriert ist.

Legen Sie die Proben in ein 96-Well-Rack in einem Fraktionssammler. Das Protein eluiert als Dimer. Wählen Sie relevante Fraktionen aus, indem Sie das Elutionsprofil mit einer Säulenkalibrierungskurve vergleichen.

Beurteilen Sie an dieser Stelle die Reinheit des Präparats mit SDS-PAGE. Bestimmen Sie schließlich die Proteinkonzentration, die für nachgelagerte Experimente erforderlich ist, und frieren Sie Aliquots von gereinigten konzentrierten Proteinen in flüssigem Stickstoff ein. Lagern Sie die Aliquots bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.

Um die Fähigkeit des Proteins zu gewährleisten, Gefrier-Tau-Zyklen zu überstehen, tauen Sie ein Aliquot der gefrorenen Proteine auf. Das Aliquot wird 10 Minuten lang bei 21.000 g zentrifugiert, um unlösliche Aggregate zu entfernen. Nach dem Zentrifugieren den Überstand auffangen.

Als nächstes laden Sie die Proteine auf eine Superdex 200 Analysesäule, die mit TNXB unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems voräquilibriert wurde. Überwachen Sie die Tryptophan-Fluoreszenz, um das Elutionsprofil des Proteins zu erkennen. Stellen Sie sicher, dass Sie über eine gültige Kalibrierkurve für die Molekulargewichtsbestimmung verfügen, die über die Hersteller der SEC-Säulen erhältlich ist.

Um die Aktivität des gereinigten Proteins sicherzustellen, mischen Sie zunächst fünf Mikromolare gereinigte DHDDS mit 10 Mikromolaren FPP und 50 Mikromolaren C14 IPP. Die Reaktion wird in Puffer A mit 0,5 millimolar Magnesiumchlorid bei 22 bis 30 Grad Celsius eingeleitet. 15 Mikroliter Proben werden nach null, zwei, vier und sechs Stunden nach sofortigem Abschrecken der Reaktion durch Zugabe von 15 Mikrolitern Puffer A, ergänzt mit 20 millimolar EDTA, aus der Reaktion entnommen

Fügen Sie dann einen Milliliter wassergesättigtes 1-Butanol hinzu und wirbeln Sie es gründlich ein, um die Reaktionsprodukte zu extrahieren. Hier kann das Protokoll gestoppt werden, und die Proben können für eine spätere Ablesung aufbewahrt werden. Fügen Sie als Nächstes den Szintillationscocktail zu den Proben hinzu.

Unter Verwendung eines Szintillationszählers werden Reaktionsprodukte in der Butanolphase quantifiziert, die C14 zusammen mit einer Radioaktivität von 15 Mikrolitern der Reaktion umfassen, was der Gesamtradioaktivität entspricht. Berechnen Sie schließlich die Netto-C14-IPP-Inkorporation zu jedem Zeitpunkt, indem Sie den Prozentsatz berechnen, der von den gesamten C14-IPP-Konzentrationen verwendet wird, und stellen Sie die Ergebnisse als Funktion der Zeit dar. Mit der Zeit wird mit einer Zunahme der Netto-Einbeziehung von C14-IPP gerechnet.

Die Proben, die bei jedem Reinigungsschritt gewonnen werden, sind hier dargestellt. Diese SDS-PAGE-Analyse zeigt die schrittweise Aufreinigung von DHDDS, was zu einem hochgereinigten Produkt führt. Dieses Chromatogramm stellt die Ergebnisse der analytischen Größenausschlusschromatographie des gereinigten Enzyms dar und zeigt, dass das Protein nur als Homodimer beobachtet wird.

Hier zeigt der Pfeil das Void-Volumen an. Ein repräsentativer zeitabhängiger Aktivitätsassay zeigt, dass der C14-IPP-Einbau über sechs Stunden deutlich ansteigt, was die Funktionsfähigkeit des gereinigten Enzyms bestätigt. Einmal gemeistert, kann diese einfache Zubereitung in zwei bis drei Tagen durchgeführt werden, was zu einem hochreinen und aktiven Enzym führt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane cis-Prenyltransferase aus E.coli überexprimiert und reinigt und ihre Aktivität zeitabhängig misst.