4.6: 3D-Invasionsassay

Wissenschaftler haben 3D-Modelle entwickelt, um Zellinvasions- und Migrationsprozesse genauer zu untersuchen. Während die meisten traditionellen Zellkultursysteme 2D sind, existieren Zellen in unserem Gewebe innerhalb eines 3D-Netzwerks von Molekülen, das als extrazelluläre Matrix oder EZM bekannt ist. Während viele der mechanistischen Prozesse, die für die Zellmotilität in 2D und 3D erforderlich sind, ähnlich sind, stellen Faktoren wie die verringerte Steifigkeit der EZM im Vergleich zu plastischen Oberflächen, die Hinzufügung einer dritten Dimension für die Migration und die physikalische Behinderung der Bewegung durch das Netz langer Polymere in der EZM im Vergleich zur zweidimensionalen Migration unterschiedliche Herausforderungen für die Zelle dar.

In diesem Video wird kurz die grundlegende Funktion und Struktur der EZM sowie die Mechanismen vorgestellt, durch die Zellen modulieren und durch sie wandern. Als nächstes besprechen wir ein allgemeines Protokoll zur Untersuchung der Invasion von Endothelzellen. Abschließend werden wir verschiedene Anwendungen von 3D-Matrizen zur Untersuchung verschiedener biologischer Fragestellungen hervorheben.

Beginnen wir damit, die Zusammensetzung der EZM zu untersuchen und wie Zellen mit ihr interagieren.

Die EZM erfüllt viele Funktionen, wie z. B. die Unterstützung von Zellen, die Erleichterung der interzellulären Kommunikation und die Trennung von Geweben. Die Zusammensetzung der EZM variiert zwischen verschiedenen Geweben und hat unterschiedliche biologische Eigenschaften, kann jedoch in zwei große Typen eingeteilt werden. Die Basalmembran dient der Verankerung und Trennung von Geweben, während die interstitielle Matrix die Zellen innerhalb eines Gewebes umgibt und stützt. Die interstitielle Matrix besteht hauptsächlich aus dem fibrösen Protein Kollagen, umfasst aber auch Elastin und Fibronektin.

Damit Zellen durch die EZM wandern können, müssen mehrere biologische Prozesse ablaufen. Die erste ist die Zell-Matrix-Adhäsion, an der Transmembranproteine, die Integrine, beteiligt sind. Diese verbinden die EZM mit dem internen Gerüst der Zelle, dem sogenannten Zytoskelett.

Ein weiterer Prozess ist die strukturelle Umlagerung des Zellskeletts. Dies führt zur Bildung von spezialisierten Strukturen, die als Invadopodien bezeichnet werden und bei denen es sich um Vorsprünge der Zelle in die umgebende Matrix handelt. Der letzte Schritt ist die ECM-Modulation. Dabei handelt es sich in der Regel um abbauende Moleküle, die als Matrix-Metalloproteasen oder MMPs bekannt sind, die sich in den Invadopodien ansammeln und die umgebende EZM abbauen, was die Zellinvasion erleichtert. 3D-Matrix-Invasions-Assays ermöglichen es Wissenschaftlern, diesen komplexen Prozess zu visualisieren und zu untersuchen.

Nachdem Sie nun mit der EZM und ihrer Interaktion mit Zellen vertraut sind, gehen wir ein Protokoll zur Untersuchung der EZM-Invasion durch Endothelzellen zur Bildung von Tubuli durch. Durch die Kultivierung von Endothelzellen in einer 3D-Umgebung kann man den biologischen Prozess des Blutgefäßwachstums simulieren, der auch als Angiogenese bekannt ist und sowohl während der normalen Entwicklung als auch bei Krebs wichtig ist.

Zuerst werden Endothelzellen kultiviert und eine Einzelzellsuspension hergestellt, indem die Zellen mit Proteasen wie Trypsin behandelt und durch einen Netzfilter geleitet werden, um Zellklumpen aufzubrechen. Die 3D-Matrix, die üblicherweise aus Kollagen, Fibrin, Laminin oder komplexeren Kombinationen dieser Komponenten besteht und entweder im Labor hergestellt oder bei kommerziellen Händlern bestellt werden kann, wird dann auf Eis aufgetaut. Da die meisten ECM-Präparate bei höheren Temperaturen polymerisieren, ist es hilfreich, auch andere Geräte und Reagenzien kalt zu halten. Die Zellsuspension wird mit der aufgetauten Matrixlösung gemischt, um die Zellen einzubetten, und diese Mischung wird in einen Zellkulturinkubator gegeben, wo die höhere Temperatur die Polymerisation der Matrix bewirkt.

Sobald die zellhaltige Matrix ausgehärtet ist, wird das Kulturmedium mit angiogenen Faktoren in die Matrixschale gegeben. Mit Hilfe einer Zeitraffer-Mikroskopie-Software können dann einzelne Zellen verfolgt werden, um ihre Wanderung durch die Matrix zu beobachten. Die resultierenden Bilder werden analysiert, und die Zellpositionen werden verwendet, um die Bewegungsrichtung und -entfernung in Mikrometern zu berechnen. Diese Werte können dann aufgetragen werden, um die lokomotorische Aktivität - die durchschnittliche Migrationsrate der Zellen - zu bestimmen. Schließlich wird die Bildung von Röhrennetzwerken mithilfe von Visualisierungssoftware beobachtet und analysiert, um Merkmale wie Knoten, Röhren und Schleifen zu identifizieren.

Lassen Sie uns nun einige Anwendungen von 3D-Matrizen in bestimmten Experimenten untersuchen.

Die Zellmigration wird durch eine aktive Modulation des zellulären Zytoskeletts vermittelt. In diesem Experiment wurden Kollagenmatrizen hergestellt und mit einem Färbemittel gemischt, der rot fluoreszierendes Protein enthielt, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Einzelne Zellsphäroide, bei denen es sich um frei schwebende Zellcluster handelt, wurden isoliert und in die Kollagenmatrix eingebettet. Nach der Inkubation wurden die eingebetteten Zellen auf spezifische Bestandteile des Zytoskeletts gefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die Forscher beobachteten Komponenten des Zytoskeletts und deren Veränderungen, während Zellen durch die EZM wanderten.

Die Wissenschaftler können auch untersuchen, wie sich die Eigenschaften der EZM auf die Migration auswirken. Mit Hilfe eines konzentrischen Gelsystems, bei dem die Zellen in eine innere Gelmatrix eingebettet sind, die von äußeren Matrizen unterschiedlicher Konzentrationen umgeben ist, können Wissenschaftler Zellen mithilfe der Zeitraffermikroskopie verfolgen, um ihre Wanderung vom inneren Gel zum ursprünglich zellfreien äußeren Gel zu untersuchen. Die Forscher beobachteten, dass die größere Steifigkeit von Gelen mit höherer Konzentration zu einer Zunahme sowohl der Zellverschiebung als auch der Gesamtdistanz der Zellmigration führte.

Schließlich können Matrixinvasionsassays an einem lebenden Tier durchgeführt werden, um die Angiogenese in einem organspezifischen Kontext zu untersuchen. Hier wurden Fibringele hergestellt, die aufgrund ihrer biologischen Abbaubarkeit häufig im Tissue Engineering verwendet werden, gefolgt von der Implantation in die Lunge von Mäusen, wo die Gele durch einen "Klebstoff" an Ort und Stelle gehalten wurden. Hergestellt aus dem Protein Fibrinogen. Die Zellmigration und die Bildung neuer Blutgefäße wurden für die folgenden 7 bis 30 Tage zugelassen, danach wurden die Lungen und Fibringele entnommen, fixiert und geschnitten. Die Bildgebung dieser Schnitte zeigte die Bildung von Blutgefäßen und Alveolen in den implantierten Gelen, was den Forschern einen Einblick in diesen entscheidenden Aspekt der Lungenentwicklung in ihrer In-vivo-Umgebung gab.

Sie haben sich gerade das Video von JoVE über Assays zur Invasion extrazellulärer Matrix angesehen. In diesem Video wurde die Zusammensetzung der EZM und die Art und Weise, wie Zellen durch sie wandern, diskutiert, ein einfaches Protokoll zur Untersuchung der Migration von Endothelzellen durch eine 3D-Matrix vorgestellt und mehrere zelluläre Prozesse hervorgehoben, die derzeit im Zusammenhang mit Zell-EZM-Interaktionen untersucht werden. Da die endogene Zellmigration im 3D-Raum stattfindet, lassen sich diese biologischen Bedingungen am besten durch 3D-Kulturtechniken simulieren. Verbesserungen in der Matrixzusammensetzung werden es den Wissenschaftlern weiterhin ermöglichen, die zelluläre Migration im Labor genauer zu replizieren und zu untersuchen. Wie immer vielen Dank fürs Zuschauen!