Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein Netzwerk von Molekülen, das einen strukturellen Rahmen für Zellen und Gewebe und hilft, die interzelluläre Kommunikation erleichtern. Dreidimensionale Zelle Kulturtechniken sind entwickelt worden, um dieser extrazellulären Umgebung für in-vitro- Studie genauer zu modellieren. Während viele Zellprozesse während der Migration durch 3D Matrizen ähnlich wie die für die Bewegung über starre 2D Oberflächen sind, einschließlich der Einhaltung, erfordert Migration durch ECM auch Zellen zu modulieren und dringen in dieses Polymer-Netz von ECM.
In diesem Video präsentieren wir die Struktur und Funktion von ECM und die grundlegenden Mechanismen von Zellen wie durch sie zu wandern. Dann untersuchen wir das Protokoll von einem Assay für Rohr Bildung von Endothelzellen, dessen Schritte zu anderen Experimenten basierend auf 3D Matrizen verallgemeinert werden können. Wir abschließend mehrere andere biologische Fragen angesprochen werden können, mit ECM-Invasion-Assays zu erkunden.
Wissenschaftler haben 3D Modelle genauer Studie Zelle Invasion und Migration Prozesse entwickelt. Während die meisten traditionellen Zellkultursysteme 2D sind, gibt es Zellen in unser Gewebe in einem 3D Netzwerk von Molekülen der extrazellulären Matrix oder ECM genannt. Während viele der mechanistischen Prozesse erforderlich für Zelle Motilität in 2D und 3D ähnlich sind, präsentieren alle Faktoren wie die reduzierte Steifigkeit im Vergleich zu Kunststoff-Oberflächen, die Hinzufügung einer dritten Dimension für die Migration und die körperliche Behinderung der Bewegung durch die Maschen des langen Polymere in der ECM ECM verschiedene Herausforderungen an die Zelle im Vergleich zu zweidimensionalen Migration.
Dieses Video wird kurz vorstellen, die grundlegende Funktion und Struktur des ECM, sowie die Mechanismen, durch die Zellen modulieren und durch sie zu migrieren. Anschließend besprechen wir ein allgemeines Protokoll zum Endothelzellen Invasion zu studieren. Schließlich werden wir mehrere Anwendungen 3D Matrizen zu studieren verschiedene biologische Fragen hervorheben.
Fangen wir durch die Untersuchung der Zusammensetzung der ECM und Zellen wie mit ihr zu interagieren.
Die ECM erfüllt viele Funktionen, wie z. B. Unterstützung für Zellen, die interzelluläre Kommunikation erleichtern und Gewebe zu trennen. ECM Zusammensetzung variiert zwischen den verschiedenen Geweben und hat verschiedene biologische Eigenschaften, aber es kann in zwei Arten eingeteilt werden. Die Basalmembran dient zum verankern und Gewebe, zu trennen, während interstitielle Matrix umgibt und die Zellen innerhalb eines Gewebes unterstützt. Die interstitielle Matrix besteht vor allem aus der faserigen Protein Kollagen, aber auch Elastin und Fibronektin.
Verschiedene biologische Prozesse müssen für die Zellen durch die ECM Wandern auftreten. Die erste ist Zellmatrix Adhäsion, die transmembranen Proteine, sogenannte Integrine beinhaltet. Diese verbinden die ECM mit internen Gerüst der Zelle, bekannt als das Zellskelett.
Ein weiterer Prozess ist die strukturelle Neuordnung der Zelle Cytoskelett. Dies führt zur Bildung von spezialisierten Strukturen, so genannte Invadopodia, die Vorsprünge der Zelle in der umgebenden Matrix sind. Der letzte Schritt ist die ECM-Modulation. Dies umfasst in der Regel abbauende Moleküle bekannt als Matrix-Metalloproteasen oder MMPs, reichern sich in der Invadopodia und verschlechtern die umliegenden ECM Zellinvasion zu erleichtern. 3D Matrix Invasion Assays können Wissenschaftler zu visualisieren und zu diesem komplexen Prozess zu studieren.
Nun, da Sie mit ECM und seiner Interaktion mit Zellen vertraut sind, gehen wir durch ein Protokoll für ECM-Invasion durch Endothelzellen zu Form Tubuli zu studieren. Durch Kultivierung Endothelzellen in einer 3D-Umgebung, kann man den biologischen Prozess von Wachstum von Blutgefäßen, auch bekannt als Angiogenese, simulieren, die bei normaler Entwicklung sowie Krebs wichtig.
Erstens die endotheliale Zellen kultiviert, und eine einzelne Zelle Suspension ist durch Behandlung der Zellen mit Proteasen wie Trypsin, und sie durch ein Filtersieb Zelle Klumpen aufzubrechen vorbereitet. Allgemein die 3D Matrix, bestehend aus Kollagen, Fibrin, Laminin oder komplexere Kombinationen dieser Komponenten — die kann entweder im Labor vorbereitet oder von kommerziellen Anbietern bestellt – ist dann auf Eis aufgetaut. Da die meisten ECM-Zubereitungen bei höheren Temperaturen polymerisieren, ist es hilfreich, andere Geräte und Reagenzien ebenso kalt zu halten. Die Zellsuspension vermischt sich mit dem aufgetauten Matrixlösung Zellen einbetten, und diese Mischung befindet sich in einer Zelle Kultur Brutkasten wo bewirkt die höhere Temperatur die Matrix zu polymerisieren.
Sobald die Zelle-haltige Matrix festgelegt ist, wird die Matrix-Schale Nährmedien mit angiogenen Faktoren hinzugefügt. Mit Zeitraffer Mikroskopie Software können Einzelzellen dann verfolgt werden um ihre Wanderung durch die Matrix zu beobachten. Die dabei entstandenen Bilder werden analysiert und Zelle Positionen werden verwendet, um Bewegungsrichtung und Entfernung in Mikron zu berechnen. Diese Werte können dann lokomotorischen Tätigkeit bestimmen geplottet werden – die durchschnittliche Migrationsrate der Zellen. Zu guter Letzt Rohr Netzwerkbildung wird beobachtet und analysiert mit Visualisierungs-Software, um Funktionen wie Knoten, Rohre und Schleifen zu identifizieren.
Nun, schauen wir uns ein paar Anwendungen 3D Matrizen in spezifischen Experimente.
Zellwanderung wird durch aktive Modulation der zellulären Cytoskelett vermittelt. In diesem Experiment wurden Kollagen Matrizen vorbereitet und gemischt mit einem Fleck mit rot fluoreszierende Protein, um Visualisierung zu ermöglichen. Einzelne Zelle Sphäroide, die frei schwebenden Zellcluster, wurden isoliert und in die Kollagenmatrix eingebettet. Nach Inkubation waren die eingebetteten Zellen gebeizt für bestimmte Zellskelett Komponenten und durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Die Forscher beobachteten Zellskelett Komponenten und deren Veränderungen wie Zellen durch die ECM migriert.
Wissenschaftler können auch studieren, wie sich die Eigenschaften des ECM Migration auswirken. Mit einem konzentrischen Gel-System, wo Zellen sind eingebettet in eine innere Gelmatrix umgeben von äußeren Matrizen der unterschiedlichen Konzentrationen, können Wissenschaftler verfolgen Zellen mittels Zeitraffer Mikroskopie, um ihre Migration aus dem inneren Gel auf das äußere zunächst zellfreie Gel zu studieren. Die Forscher beobachteten, dass die höhere Steifigkeit der höheren Konzentration Gele Erhöhungen der Zelle Verschiebung und Gesamtentfernung der Zellwanderung geführt.
Zu guter Letzt können Matrix Invasion Assays innerhalb ein lebendes Tier, Angiogenese in einem Organ-spezifischen Kontext studieren durchgeführt werden. Hier, Fibrin Gele – üblicherweise bei Gewebetechnik aufgrund ihrer biologisch abbaubar – generiert wurden, gefolgt von Implantation in Maus-Lunge wo wurden die Gele durch ein “Klebstoff”, gemacht von der Protein-Fibrinogen festgehalten. Zellwanderung und New Blutbildung Schiff durften für die nächsten 7 bis 30 Tage, auftreten, nach dem die Lungen und Fibrin Gels, festen und geschnittenen geerntet wurden. Bildgebung dieser Abschnitte offenbart Blutgefäß und Alveolen Bildung in die implantierten Gele, die Forscher Einblick in diesen entscheidenden Aspekt der Lungenentwicklung in seiner Umgebung in Vivo .
Sie haben nur Jupiters Video auf extrazelluläre Matrix Invasion Assays angesehen. Dieses Video erläutert die Zusammensetzung des ECM und wie Zellen Wandern durch es präsentiert ein einfaches Protokoll um Endothelzellen Migration durch eine 3D Matrix zu studieren und markiert mehrere zelluläre Prozesse, die derzeit im Rahmen der Zelle-ECM-Interaktionen untersucht. Da endogenen Zellwanderung im 3D-Raum erfolgt, werden diese biologischen Bedingungen am besten durch 3D Techniken simuliert. Verbesserungen in der Matrix-Zusammensetzung werden weiterhin können Wissenschaftler genauer zu replizieren und zelluläre Migration im Labor zu untersuchen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
Scientists have developed 3D models to more accurately study cell invasion and migration processes. While most traditional cell culture systems are 2D, cells in our tissues exist within a 3D network of molecules known as the extracellular matrix or ECM. While many of the mechanistic processes required for cell motility in 2D and 3D are similar, factors such as the reduced stiffness of ECM compared to plastic surfaces, the addition of a third dimension for migration, and the physical hindrance of moving through the mesh of long polymers in the ECM, all present different challenges to the cell compared to two-dimensional migration.
This video will briefly introduce the basic function and structure of the ECM, as well as the mechanisms by which cells modulate and migrate through it. Next, we’ll discuss a general protocol used to study endothelial cell invasion. Finally, we will highlight several applications of 3D matrices to studying different biological questions.
Let’s begin by examining the composition of the ECM, and how cells interact with it.
The ECM performs many functions, such as providing support for cells, facilitating intercellular communication, and separating tissues. ECM composition varies among different tissues and has different biological properties, but it can be classified into two broad types. The basement membrane serves to anchor and separate tissues, while interstitial matrix surrounds and supports the cells within a tissue. The interstitial matrix is mostly composed of the fibrous protein collagen, but also includes elastin and fibronectin.
Several biological processes need to occur for cells to migrate through the ECM. The first is cell-matrix adhesion, which involves transmembrane proteins called integrins. These link the ECM to the cell’s internal scaffold, known as the cytoskeleton.
Another process is the structural rearrangement of the cell’s cytoskeleton. This leads to the formation of specialized structures called invadopodia, which are protrusions of the cell into its surrounding matrix. The final step is ECM modulation. This typically involves degradative molecules known as matrix metalloproteases or MMPs, which accumulate in the invadopodia and degrade the surrounding ECM, facilitating cell invasion. 3D matrix invasion assays allow scientists to visualize and study this complex process.
Now that you’re familiar with ECM and its interaction with cells, let’s walk through a protocol for studying ECM invasion by endothelial cells to form tubules. By culturing endothelial cells in a 3D environment, one can simulate the biological process of blood vessel growth, also known as angiogenesis, which is important during both normal development, as well as cancer.
First, endothelial cells are cultured, and a single cell suspension is prepared by treating the cells with proteases such as trypsin, and passing them through a mesh filter to break up cell clumps. The 3D matrix, commonly composed of collagen, fibrin, laminin, or more complex combinations of these components—which can either be prepared in-lab or ordered from commercial vendors—is then thawed on ice. Since most ECM preparations polymerize at higher temperatures, it is helpful to keep other equipment and reagents cold as well. The cell suspension is mixed with the thawed matrix solution to embed cells, and this mixture is placed into a cell culture incubator where the higher temperature will cause the matrix to polymerize.
Once the cell-containing matrix is set, culture media containing angiogenic factors is added to the matrix dish. Using time-lapse microscopy software, individual cells can then be tracked to observe their migration through the matrix. The resulting images are analyzed, and cell positions are used to calculate movement direction and distance in microns. These values can then be plotted to determine locomotory activity—the average migration rate of the cells. Finally, tube network formation is observed and analyzed using visualization software to identify features such as nodes, tubes, and loops.
Now, let’s explore a few applications of 3D matrices in specific experiments.
Cell migration is mediated by active modulation of the cellular cytoskeleton. In this experiment, collagen matrices were prepared and mixed with a stain containing red fluorescent protein to allow for visualization. Individual cell spheroids, which are free-floating cell clusters, were isolated and embedded in the collagen matrix. Following incubation, the embedded cells were stained for specific cytoskeletal components, and imaged by fluorescence microscopy. Researchers observed cytoskeletal components and their alterations as cells migrated through the ECM.
Scientists can also study how the properties of the ECM affect migration. Using a concentric gel system, where cells are embedded in an inner gel matrix surrounded by outer matrices of varying concentrations, scientists can track cells using time-lapse microscopy to study their migration from the inner gel to the initially cell-free outer gel. Researchers observed that the greater stiffness of higher concentration gels resulted in increases in both cell displacement and overall distance of cell migration.
Finally, matrix invasion assays can be performed within a living animal to study angiogenesis in an organ-specific context. Here, fibrin gels—commonly used in tissue engineering due to their biodegradable nature—were generated, followed by implantation into mouse lungs where the gels were held in place by a “glue” made of the protein fibrinogen. Cell migration and new blood vessel formation were allowed to occur for the following 7 to 30 days, after which the lungs and fibrin gels were harvested, fixed, and sectioned. Imaging of these sections revealed blood vessel and alveoli formation in the implanted gels, giving researchers insight into this crucial aspect of lung development in its in vivo setting.
You’ve just watched JoVE’s video on extracellular matrix invasion assays. This video discussed the composition of the ECM and how cells migrate through it, presented a simple protocol to study endothelial cell migration through a 3D matrix, and highlighted several cellular processes currently being studied in the context of cell-ECM interactions. Because endogenous cell migration occurs in 3D space, these biological conditions are best simulated by 3D culture techniques. Improvements in matrix composition will continue to allow scientists to more accurately replicate and study cellular migration in the lab. As always, thanks for watching!
