Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Wirksamkeit von genotoxischen Wirkstoffen in Krebszellen mit Hilfe eines Einzelzell-Elektrophorese-Assays, der auch als Comet-Assay bezeichnet wird, zu untersuchen. Dieses Verfahren ist sinnvoll, um die vier genetischen toxikologischen Studien zu messen. Und es ist auf verschiedene Evaluierungen anwendbar, wie z.B. die frühere Auswahl von Medikamentenkandidaten und die Grundlagenforschung zu DNA-Schäden und -Reparaturen.

Diese Technik bietet eine direkte Möglichkeit, den DNA-Schaden quantitativ zu bewerten. Und es ist effizient, einfach durchzuführen und relativ kostengünstig. Bereiten Sie die Agarose für die Objektträgerbeschichtung vor, indem Sie ein Prozent Agarose zwei bis drei Minuten lang in der Mikrowelle schmelzen oder bis die Agarose vollständig geschmolzen ist.

Tauchen Sie einen Glasobjektträger in die Agarose und wischen Sie mit einem fusselfreien Tuch eine Seite des Objektträgers ab. Legen Sie die Rutsche zum Trocknen an der Luft auf eine ebene Fläche. Nach dem Trocknen sollte sich ein transparenter Agarosefilm bilden.

Legen Sie die beschichteten Objektträger vor Gebrauch bei 37 Grad Celsius ab. Die therapeutische Wirkung der Chemotherapie wird an U251-Gliomzellen untersucht, die in DMEM/Ham F-12-Medium kultiviert wurden, das mit 10 % FBS, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 10 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin ergänzt wurde. Verdauen Sie die Zellen drei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin und neutralisieren Sie dann das Trypsin mit DMEM/Ham F-12-Medium mit FBS.

Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Und drehen Sie sich vier Minuten lang mit dem 300-fachen G. Saugen Sie das Medium an.

Und suspendieren Sie die Zellen bei zwei mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in 1x PBS. Zellen und sollten unmittelbar vor Beginn des Assays vorbereitet werden. Und die sollten im Dunkeln gehandhabt werden.

Alles bei schwachem Licht, um Schäden zu vermeiden. Kombinieren Sie die Zellsuspension mit einem Prozent geschmolzener Agarose bei niedrigem Schmelzpunkt bei einem Volumenverhältnis von eins zu 10. Vorsichtig mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.

Und pipettieren Sie sofort 30 Mikroliter auf einen Objektträger. Verwenden Sie den Schieber der Pipettenspitze, um die Agarosemischung zu verteilen, um die Bildung einer dünnen Schicht zu gewährleisten. Legen Sie die Objektträger flach bei vier Grad Celsius im Dunkeln für 10 Minuten hin.

Tauchen Sie die Objektträger eine Stunde lang bis über Nacht in eine vier Grad Celsius heiße Lyselösung im Dunkeln. Für den alkalischen Kometen-Assay nehmen Sie die Objektträger vorsichtig aus der Lyselösung, lassen überschüssige Flüssigkeit ab und tauchen Sie die Objektträger eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln vorsichtig in AES, damit sich die DNA abwickeln kann. Geben Sie vorgekühltes AES in die Elektrophorese-Objektträgerschale.

Überschreiten Sie nicht 0,5 Zentimeter über den Rutschen. Legen Sie die Objektträger hinein und decken Sie sie mit einer Kappe ab. Stellen Sie die Netzspannung auf ein Volt pro Zentimeter ein und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius laufen.

Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, lassen Sie überschüssiges AES von den Objektträgern ab. Tauchen Sie die Objektträger zweimal vorsichtig für jeweils fünf Minuten in destilliertes Wasser bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Objektträger danach vorsichtig fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol

Für den neutralen Kometen-Assay nehmen Sie die Objektträger vorsichtig aus der Lyselösung, lassen Sie überschüssige Flüssigkeit ab und tauchen Sie es 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln vorsichtig in das NES. Geben Sie vorgekühltes NES in die Elektrophorese-Objektträgerschale, die nicht mehr als 0,5 Zentimeter über den Objektträgern liegt. Legen Sie die Objektträger hinein und decken Sie sie mit einer Kappe ab.

Stellen Sie die Versorgungsspannung auf ein Volt pro Zentimeter ein und lassen Sie sie 45 Minuten lang bei vier Grad Celsius laufen. Lassen Sie überschüssigen Puffer von den Objektträgern ab. Tauchen Sie die Objektträger vorsichtig 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in DNA-Fällungslösung.

Tauchen Sie die Objektträger nach 30 Minuten vorsichtig 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in 70%iges Ethanol. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Objektträger 10-15 Minuten lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius trocknen. Geben Sie anschließend 50-100 Mikroliter grün fluoreszierende Nukleinsäure-Färbelösung auf die getrocknete Agarose jedes Objektträgers und färben Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Spülen Sie die Objektträger kurz in destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie vollständig bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Führen Sie die Bildaufnahme und -analyse unmittelbar nach dem Färben der Kometenobjektträger durch. Legen Sie einen Objektträger mit einem Objektträgerhalter unter ein Fluoreszenzmikroskop.

Wählen Sie die 10-fach-Objektivlinse und stellen Sie sicher, dass das Agarose-Gel zur Objektivlinse zeigt. Nehmen Sie nach dem Zufallsprinzip Bilder von jedem gefärbten Kometenobjektträger auf. Vermeiden Sie die Ränder und die Bereiche um Luftblasen.

Stellen Sie sicher, dass jeder Kometenschweif horizontal verteilt ist. Kometenköpfe sollten von links und der Schweif von rechts kommen. Speichern Sie jedes Bild in einem binären Format mit heller DNA-Färbung und dunklem Hintergrund.

Laden Sie für die Bildanalyse zunächst alle Bilder in die Comet-Assay-Software, indem Sie die Schaltfläche Zu analysierende Dateien auswählen verwenden, die sich links in der Symbolleiste befindet. Ein Bildansichtsfenster sollte angezeigt werden. Zeichnen Sie einen Messrahmen auf dem Bildschirm und passen Sie seine Größe an den Kometen der Zelle an.

Klicken Sie auf Anpassen, um den Schwellenwert für Kopf, Komet und Schweif entsprechend dem Bild festzulegen. Klicken Sie dann auf Messungen starten. Wählen Sie eine Zelle mit dem Rahmen aus und aktivieren Sie die Messung, indem Sie auf die Schaltfläche Assay the Comet klicken.

Im Profilfenster wird ein Intensitätsbild mit den ausgewählten Messparametern angezeigt. Speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf die Schaltfläche Ergebnisse speichern klicken. Analysieren Sie mindestens 50 Zellen pro Behandlung.

Die Ergebnisse der alkalischen und neutralen Kometen-Assays zeigen, dass die Kometenschweife von Doxorubicin-behandelten UT51-Zellen länger waren und eine höhere DNA-Intensität aufwiesen, was auf eine erhebliche Akkumulation fragmentierter DNA hindeutet. Die quantitative Analyse des alkalischen oder des neutralen Kometen-Assays zeigte eine signifikant erhöhte Kometenschweifbildung nach Doxorubicin-Behandlungen, was auf DNA-Schäden hinweist. Eine Kombinationsbehandlung mit einem PARP-Inhibitor, Olaporib, und einem Alkylierungsmittel, Temozolomid, erhöhte die DNA-Schäden in Gliomzellen signifikant, was sich in der zunehmenden Länge und Intensität des Kometenschweifsignals widerspiegelte.

Olaporib allein führte nicht zu DNA-Schäden. Dabei potenzierte es die genotoxische Wirkung von Temozolomid. Repräsentative Bilder von Gliomzellen unter Einzel- und Kombinationsbehandlungen zeigten die längeren und intensiveren Kometenschweife von Zellen, die mit Temozolomid und Olaporib behandelt wurden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Genotoxizität, um DNA-Stringbrüche in vielen Arten von ukaryotischen Zellen zu messen. Zum Beispiel kultivierte Zellen oder Zellen, die aus Organismen isoliert wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Comet-Assay verwenden, um die Wirksamkeit eines genotoxischen Wirkstoffs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Schadensreagenz äußerst gefährlich sein kann. Und die Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen eines Laborkittels und von Handschuhen, sollten immer bei der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.