Name: Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Lernen Sie eine RANKL-basierte Osteoklastenkultur aus Mäuseknochenmark zur Untersuchung der mTORC1-Rolle bei der Osteoklastenbildung. Diese Methode liefert innerhalb einer Woche eine große Anzahl riesiger Osteoklasten.

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Die Autoren danken Dr. Minghan Tong und S. Kato für freundlicherweise die Reagenzien und Mäuse. Wir danken die Mitgliedern des Zou Lab für nützliche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse von 973-Programm aus dem chinesischen Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) [2014CB964704 und 2015CB964503], klinische Forschungsprogramm des 9. Volks Krankenhaus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Danke für die Hilfe von Core Facility für Zellbiologie und Core Facility für chemische Biologie, CAS Zentrum für Exzellenz in der molekularen Zelle Wissenschaft, Shanghai Institut für Biochemie und Zellbiologie, Chinese Academy of Sciences.

Alle Verfahren in Bezug auf die Tiere wurden nach dem Protokoll von der Stanford-Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) genehmigt durchgeführt und wurden durch die Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute für Biochemie und Zelle genehmigt Biologie.
1. Vorbereitung
<ol><li>Generieren von Osteoklasten bestimmte Raptor Löschung Mäuse (Raptorfl/fl; Ctsk-Cre, jenseits CtskRap) bei der Paarung Raptorfl/fl -Mäuse mit Ctsk-Cre Mäuse. Verwenden Sie die Raptorfl/fl -Mäuse als WT-Kontrolle in dieser Studie.</li>
	<li>Haben Sie einen Behälter mit Eis, isolierte Knochen zu halten.</li>
	<li>
Kulturmedium vorzubereiten.
	<ol>
<li>Bereiten Sie α-MEM Kulturmedium durch Ergänzung minimale wesentliche mittlere Alpha (α-MEM) mit 1 X Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10 % fetalen Kälberserum vor.</li>
		<li>Vorbereiten des Knochenmarks Makrophagen Induktion Medium bestehend aus 50 mL α-MEM Medium und M-CSF bei 20 ng/mL.</li>
		<li>Bereiten Sie Osteoklasten Induktion Medium bestehend aus M-CSF und RANKL bei 20 ng/mL, bzw., in 50 mL α-MEM Medium vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die folgenden Puffer vor der Falle zu beflecken.
	<ol>
<li>Bereiten Sie Fix-Lösung bestehend aus 6,5 mL Aceton, 2,5 mL Citrat-Lösung und 0,8 mL 37 % (Vol/Vol) Formaldehyd-Lösung.</li>
		<li>Bereiten Sie TRAP Färbelösung vor.<ol>
<li>Prewarm deionisiertes Wasser auf 37 ° C.</li>
			<li>100 µL schnell Granat GBC Basislösung und 100 µL Natrium Nitrit-Lösung in einem 1,5 mL Reaktionscup und mischen durch sanfte Umkehrung für 30 S. lassen die Mischung für 2 min stehen.</li>
			<li>Prewarm 9 mL entionisiertem Wasser auf 37 ° C. Fügen Sie 200 µL des Diazotized schnell Granat GBC Basislösung aus Schritt 1.4.2.2, 100 µL Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung, 400 µL Acetat-Lösung und 200 µL Tartrat-Lösung.</li>
			<li>Halten Sie die Falle Färbelösung Mischung in einem Wasserbad bei 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie den folgenden Puffer vor der Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium.
	<ol>
<li>Bereiten Sie Tartrat Puffer (50 mL): 2 mL 0,33 M L-Weinsäure Säure, 48 mL 0,33 M-Natrium-Tartrat Diabas-entwässern. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,9.</li>
		<li>4-Nitrophenyl Binatrium (pNPP) Phosphatpuffer (200 mL) vorbereiten: 1,502 g Glycin, 41 mg MgCl2, 27,2 mg ZnCl2und 180 mL entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 10.4 mit 3 M NaOH und die Lautstärke auf 200 mL mit entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Vorbereiten der pNPP Puffer mit Phosphatase Substrat (einer 96-Well-Platte): 49,37 mg Phosphatase Substrat und 175 µL pNPP Puffers von Schritt 1.5.2.</li>
		<li>Bereiten Sie Substratpuffer (9 mL/96-Well-Platte): 6,24 mL deionisiertes Wasser, 360 μL der Acetat-Lösung und 2,4 mL Tartrat Puffer. Mischen von Wirbel und Heizen Sie bei 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
		<li>9ml vorgeheizten Substrat buffer(1.5.4) um eine Substratmischung und Wirbel für 10 90 μL pNPP Puffer mit Phosphatase substrate(1.5.3) hinzufügen s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation (Tag-1)
<ol><li>Einschläfern Sie 3 ein-Monat-alte weibliche WT und RapCtsk Mäuse durch CO2 getrennt. Durchführen Sie CO2 -Inhalation mit geeigneter Ausrüstung von geschultem Personal.</li>
	<li>Tauchen Sie 6 Mäuse in ein Becherglas mit 100 mL 75 % Ethanol (Vol/Vol) für 5 min, bakterielle Kontamination zu verhindern und dann auf eine Dissektion Brett in Rückenlage legen. Machen Sie einen Schnitt an der distalen Tibia vertikal und sezieren Sie die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen mit ophthalmologischen Schere.</li>
	<li>Geschnitten Sie das Gelenke Ligament des Hüftgelenks mit einer Schere und verrücken Sie der hinteren Gliedmaßen aus dem Kofferraum.</li>
	<li>Schneiden Sie die artikuläre Bandverletzungen des Kniegelenks und trennen Sie sorgfältig zu, der Tibia und Femur aus dem Kniegelenk. Entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe mit einer Schere.</li>
	<li>Legen Sie alle Knochen ein Genotyp in einem einzigen Mausklick in jede Vertiefung eine sechs-Well-Platte mit 2 mL α-MEM auf Eis. Hinweis: Um die Zellviabilität zu erhalten, sollte der Knochen unter diesen Bedingungen weniger als 1 h gehalten werden.</li>
</ol>3. Isolation (Tag-1)
<ol><li>Einen Brunnen von einer sechs-Well-Platte mit 75 % Ethanol (3 mL) und die weiteren 5 Bohrungen mit α-MEM Medium (3 mL) füllen.</li>
	<li>Setzen Sie alle Knochen von einem Genotyp in der Ethanol-Wäsche für 15 s und waschen Knochen 5 Mal mit α-MEM Medium für 10 s jedes Mal.</li>
	<li>Die Epiphysen mit der Schere abgeschnitten und 0,45 mm Spritze Nadel in den Hohlraum und Flush Knochenmark, mit α-MEM Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Spülen Sie den Knochenhohlraum mit der gleichen Methode vom anderen Ende des Knochens. Mindestens zweimal wiederholen Sie, um den Knochenhohlraum gründlich waschen, bis der Knochen blass ist.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Knochenmark um eine Zelle Pellet bei 800 X g und 4 ° C für 5 min. Absaugen der Überstand zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 3 mL der roten Blutzelle Lysis Puffer in die Zentrifugenröhrchen und Pipette vorsichtig auf das Knochenmark Aufschwemmen. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen für 8 min zu den Erythrozyten zu lysieren auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 6 mL α-MEM Medium in die Zentrifugenröhrchen, Zelle Lysis zu stoppen. Bei 500 x g und 4 ° C für 10 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.</li>
	<li>In 3 mL Kulturmedium α-MEM Aufschwemmen Sie und legen Sie die Zellen in einem sechs-Well-Platte (in der Regel eine Maus pro Well).</li>
	<li>Über Nacht bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
</ol>(4) Beschichtung (Tag 0)
<ol><li>Übertragen des Überstands auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen, die ungebunden Zellen am nächsten Morgen zu sammeln.</li>
	<li>Bei 800 x g und 4 ° C für 5 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie in 4 mL Kulturmedium α-MEM.</li>
	<li>20 µL der Zelle Lösung nehmen und mischen mit 20 µL Trypan blau. Die Zählkammer 10 µL der Mischung hinzu und erhalten Sie die Zellzahl pro mL Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie einem entsprechenden Volumen α-MEM Kulturmedium eine Zelle Lösung von 500.000 Zellen/mL zu erhalten.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL und 50 µL Knochenmark Makrophagen Induktion Medium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL und 50 µL der Zelle Lösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>3 Tage bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator inkubieren.</li>
</ol>5. Differenzierung (3-7 Tage)
<ol><li>Drei Tage nach der Beschichtung, kassiere 50 µL Medium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und bei-20 ° C eingefroren und aspirieren Sie passives Medium.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL und 100 µL Osteoklasten Induktion Medium in jedem Brunnen von einer 24-Well-Platte und einer 96-Well-Platte, beziehungsweise.</li>
	<li>2 Tage bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Kassiere in jede Vertiefung 50 µL Medium und aspirieren Sie passives Medium.</li>
	<li>Fügen Sie Osteoklasten Induktion Medium in jede Vertiefung.</li>
	<li>1 Tag bei 37 ° C inkubieren. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten große, mehrkernigen Osteoklasten unter einem inversen Mikroskop (Abbildung 2A) eingesehen werden.</li>
	<li>Wenn Osteoklasten nicht gesehen werden, verändern Sie die Osteoklasten Induktion Medium und täglich zu beobachten Sie, bis die Osteoklasten zu sehen sind.</li>
	<li>Sammeln Sie 50 µL Medium aus jeder Quelle des 96-Well-Platte, nachdem Osteoklasten gebildet haben.</li>
</ol>6. Tartrat resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung
Hinweis: Reifen Osteoklasten können nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur (Schritt 4) vorhanden sein.
<ol><li>Aspirieren Sie Medium und waschen Sie vorsichtig 3mal mit 1 X PBS.</li>
	<li>Beheben Sie die Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 µL Lösung für 30 s bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach der Fixierung die Lösung und waschen Sie sanft 3 Mal mit entionisiertem Wasser auf 37 ° c vorgewärmt Deionisiertes Wasser abzusaugen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL der TRAP Fleck in jede Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und platzieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min und Schild aus Licht.</li>
	<li>Nach dem Färben, Aspirieren des TRAP-Flecks und 3 Mal mit entionisiertem Wasser sanft waschen.</li>
	<li>Bild Osteoklasten mit einem inversen Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.</li>
</ol>(7) Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium
<ol><li>Sammle 30 µL Kultur Überstand von jedem Bohrloch der 96-Well-Platte aus Schritt 5.1, 5.4 und 5.8; Verwenden Sie 30 µL-kultivierte Osteoklasten Induktion Medium als die negativ-Kontrolle. Legen Sie die Proben in einer neuen 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 90 μL der Substrat-mixture(1.5.5) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h und Schild aus Licht.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 3 M NaOH in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.</li>
	<li>Messen Sie Theabsorbance bei der Wellenlänge von 405 nm.</li>
</ol>(8) Western Blotting
Hinweis: Nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur in der 24-Well-Platte, sollte Reifen Osteoklasten sichtbar sein.
<ol><li>Aspirieren Sie das Medium.</li>
	<li>Waschen Sie sanft mit vorgekühlten 1 x PBS 3 Mal.</li>
	<li>Aspirieren Sie PBS.</li>
	<li>100 µL 1 x SDS Lyse Puffer mit Protease-Inhibitor cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Sammeln Hitze Lysates bei 105 ° C für 10 min und Zentrifuge bei 12.000 × g und 4 ° C für 10 min. die Überstände, die Proteine enthalten.</li>
	<li>Trennen Sie die Lysates mit 30 µg Protein durch 10 % SDS-PAGE11 und übertragen Sie dann auf eine Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran.</li>
	<li>Die Membranen mit 5 % Magermilch für 30 min zu blockieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membranen mit Anti-Raptor, Anti-P-S6, Anti-S6, Anti-β-Aktin in 1:1,000 Verdünnung über Nacht in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 8,9 zweimal.</li>
	<li>Die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubieren-konjugierten Anti-Maus oder Kaninchen-IgG-Antikörper bei 1:5,000 Verdünnung in 5 % Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit TBST für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Für die Erkennung von Chemolumineszenz westlichen Chemolumineszenz HRP Substrat auf den Membranen hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Abtropfen Sie das überschüssige Substrat und setzen Sie die Flecken auf Röntgenfilm.</li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.

Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.
In der vorang...

Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen1. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolge osteoclastic Knochenabbau Knochen bilden Kapazität von Osteoblasten2,3. So um pharmazeutische Ziele zur Behandlung von Skeletterkrankungen wie Osteoporose zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, die Erzeugung und die Biologie der Osteoklasten4.
Osteoklasten sind einzigartige mehrkernigen Riesenzellen befindet sich an oder nahe der Knochenoberfläche und gehören zu der Familie Monocyte/Makrophagen-1. Ibbotson K. J. Et al. eine Methode zur Erzeugung Osteoklasten-wie Zellen in Vitro mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin D35-haltigem Medium berichtet. Die Identifizierung von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator für nukleare Faktor κ B Ligand (RANKL) als wesentliche Faktoren der Osteoklasten Bildung hat dramatisch zugenommen, die Effizienz der Osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. die Möglichkeit, Kultur Osteoklasten in Vitro hat unser Verständnis der Generation und Regulierung der Osteoklasten verbessert.
Das Säugetier/mechanistischen Ziel von Rapamycin (mTOR) Funktionen in zwei strukturell und funktionell unterschiedliche komplexe, nämlich mTORC1 und mTORC28,9. Die zwei Multi-Protein-komplexe sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Komponenten und nachgelagerten Substrate voneinander. mTORC1 enthält das einzigartige regulatorischen-assoziierten Protein mTOR (Raptor), während mTORC2 Rapamycin-unempfindliche Begleiter von mTOR (Rictor)9enthält. mTORC1 können integrieren und übertragen wichtige Signale, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass diese mTORC1 spielt eine Schlüsselrolle im Netzwerk der katabolen Knochenabbau durch Löschen des Raptor , mTORC1 in Osteoklasten10zu inaktivieren. Jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde eine Osteoclastogenic RANKL-basierte Methode Osteoklasten aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) der Wildtyp (WT) und RapCtsk Mäuse zu generieren und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten verwendet. Bildung.

<table><tbody><tr><td>Raptorfl/fl</td><td>Mäuse Das Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-cre Mäuse</td><td></td><td></td><td>ein Geschenk von S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-M-CSF-Protein</td><td>R& D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes Maus-RANKL-Protein</td><td>F& D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citratlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC Basislösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitritlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-BI Phosphatlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Acetatlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Tartratlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>L-Weinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtartrat zweibasische Dehydratisierung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Substrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>anti-P-ribosomales Protein S6 (S235/236)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>anti-ribosomales Protein S6</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-Aktin</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Xilong wissenschaftliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemilumineszenz HRP Substrat (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45-mm-Spritze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mückenzange</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein rankl-basierte osteoklasten kultur assay der maus knochenmark zu untersuchen, die rolle von mtorc1 in osteoklasten bildung

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.

Mit Hilfe dieses Protokolls, wurden eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten am 6. Tag gesehen; Wenn riesige Osteoklasten nicht gesehen werden, möglicherweise einen weiteren Tag der Osteoklasten Differenzierung benötigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Osteoklasten Bildung bestätigte Falle Färbung (Abbildung 2A). Osteoklasten waren Wein rot/violett Riesenzellen mit mehr als 3 Kerne. Mehr als 250 Osteoklasten wurden in jede Vertiefu...

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Osteoklasten in vitro aus dem Knochenmark der Maus zu isolieren und zu kultivieren und die Rolle des Säugetierziels des Rapamycin-Komplexes eins bei der Osteoklastenbildung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Bildung von Osteoklasten zu beantworten, wie z.B. die Rolle von mTORC1 bei der Osteoklastendifferenzierung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass innerhalb einer Woche eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten entsteht.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Osteoporose, da es hilfreich ist, den Mechanismus zu untersuchen, durch den sich Osteoklasten von ihren Vorläufern unterscheiden. Um diesen Eingriff zu beginnen, machen Sie einen vertikalen Schnitt am distalen Ende der Tibia einer euthanasierten Maus und präparieren Sie die Haut entlang der Hintergliedmaßen. Schneiden Sie anschließend das Gelenkband der Hüftgelenke mit einer Schere ab und verrenken Sie die hinteren Gliedmaßen vom Rumpf.Schneiden Sie das Gelenkband des Kniegelenks ab und trennen Sie vorsichtig das Schienbein und den Oberschenkelknochen davon. Entfernen Sie das Weichgewebe vorsichtig mit einer Schere. Legen Sie alle Knochen einer Maus in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern Alpha-MEM auf Eis.Zur Isolierung füllen Sie eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 75 % Ethanol und die anderen fünf Wells mit Alpha-MEM. Legen Sie alle Knochen einer Maus für 15 Sekunden in die Ethanolwäsche und waschen Sie die Knochen dann fünfmal jeweils 10 Sekunden lang mit Alpha-MEM. Schneiden Sie die Epiphysen mit der Schere ab und führen Sie eine 0,45-Millimeter-Spritzennadel in die Knochenhöhle ein.Spülen Sie das Mark mit alpha-MEM in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus. Spülen Sie anschließend die Knochenhöhle mit der gleichen Methode vom anderen Ende des Knochens aus. Wiederholen Sie dies mindestens zweimal, um die Knochenhöhle gründlich zu waschen, bis der Knochen blass ist.Anschließend zentrifugieren Sie das Knochenmark, um fünf Minuten lang ein Zellpellet bei vier Grad Celsius zu erhalten. Anschließend aspirierst du den Überstand. Geben Sie drei Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen in das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie vorsichtig, um das Knochenmark wieder zu suspendieren.Halten Sie dann das Zentrifugenröhrchen acht Minuten lang auf Eis, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Geben Sie nach acht Minuten sechs Milliliter Alpha-MEM in das Zentrifugenröhrchen, um die Zelllyse zu stoppen. Bei 800 g und vier Grad Celsius 10 Minuten lang zentrifugieren und den Überstand absaugen.Dann resuspendieren Sie die Zellen in drei Millilitern Alpha-MEM-Kulturmedium und legen Sie sie in eine Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie in diesem Schritt den Überstand in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um die ungebundenen Zellen am nächsten Morgen zu sammeln.Danach wird fünf Minuten lang bei 800 g und vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Anschließend werden die Zellen in vier Millilitern Alpha-MEM-Kulturmedium resuspendiert. Nehmen Sie 20 Mikroliter der Zelllösung und mischen Sie sie mit 20 Mikrolitern Trypanblau.Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Mischung in die Zählkammer und erhalten Sie die Zellzahl pro Milliliter Lösung. Fügen Sie anschließend ein geeignetes Volumen Alpha-MEM-Kulturmedium hinzu, um eine Zelllösung von 500.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter und 50 Mikroliter Knochenmarkmakrophagen-Induktionsmedium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte hinzu.Geben Sie anschließend 500 Mikroliter und 50 Mikroliter Zelllösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte. Drei Tage lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sammeln Sie drei Tage nach dem Plattieren 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte und frieren Sie es bei minus 20 Grad Celsius ein.Anschließend wird das Restmedium abgesaugt. Geben Sie jeweils einen Milliliter und 100 Mikroliter Osteoklasten-Induktionsmedium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius.Nach zwei Tagen werden 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung entnommen und das Restmedium abgesaugt. Geben Sie dann Osteoklasten-Induktionsmedium in jede Vertiefung und inkubieren Sie einen Tag lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem sich Osteoklasten gebildet haben, sammeln Sie 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.In diesem Schritt aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Probe dreimal vorsichtig mit 1X PBS. Fixieren Sie anschließend die Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Fixierlösung für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung aspirieren Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen dreimal vorsichtig mit deionisiertem Wasser, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.Saugen Sie dann das deionisierte Wasser an und geben Sie 100 Mikroliter TRAP-Beize in jede Vertiefung der 96-Well-Platte. Stellen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator und schirmen Sie sie vor Licht ab. Aspirieren Sie nach dem Färben den TRAP-Fleck und waschen Sie ihn dreimal vorsichtig mit entionisiertem Wasser.Anschließend bilden Sie die Osteoklasten in einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung ab. Übertragen Sie dann 30 Mikroliter des zuvor gesammelten Mediums auf eine neue 96-Well-Platte. Geben Sie als Nächstes 90 Mikroliter Substratmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.Stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator und schützen Sie sie vor Licht. Stoppen Sie die Reaktion nach einer Stunde, indem Sie 30 Mikroliter Natriumhydroxid mit drei Molen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte geben. Messen Sie dann die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern mit dem EnVision Multilabel Plate Reader.Hier ist die repräsentative Ansicht der Osteoklasten, die am sechsten Tag im Hellfeld beobachtet wurden. Die rote Linie umriss den Rand der Osteoklasten. Und hier ist ein typisch riesiger, mehrkerniger, TRAP-positiver Osteoklasten.Der schwarze Pfeil zeigte zwei Kerne des mehrkernigen Osteoklasten. Diese Abbildung zeigt die TRAP-Färbung von BMMs am sechsten Tag. Es werden Bilder mit hoher Vergrößerung der Quadrate in Wildtyp- bzw. Ctsk-Cre Raptor-Knockout-Gruppen gezeigt.Dabei handelte es sich um weniger riesige, TRAP-positive Osteoklasten, die in den Ctsk-Cre Raptor Knockout-BMMs gebildet wurden, im Vergleich zur Wildtyp-Gruppe. Diese Abbildung zeigt die TRAP-Aktivität von kultivierten Wildtyp- und Ctsk-Cre Raptor-Knockout-BMMs. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Lebensfähigkeit der Knochenmarkmakrophagen zu erhalten, da die optimale Aussaatdichte lebensfähiger Knochenmarkmakrophagen entscheidend ist. Es wird empfohlen, den Knochen nicht länger als eine Stunde auf Eis zu halten und die Zellen sanft zu resuspendieren. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden, wie z.B. dem Osteoklasten-Resorptionsassay mit Knochenscheiben, kombiniert werden, um die normale und pathologische Physiologie von Osteoklasten zu untersuchen.Mit dieser Methode haben wir festgestellt, dass mTORC1 eine wichtige Rolle bei der Bildung von Osteoklasten spielt, die in Zukunft als potenzielles pharmakologisches Ziel für die Behandlung von Knochenstoffwechselstörungen wie Osteoporose dienen könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

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