Name: Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie eine chirurgische Methode zur intrazerebralen Zika-Virus-Injektion in Mäuseembryonen, Neugeborene und Erwachsene. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung viraler Pathogenese und neurodevelopmentaler Störungen.

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Die Autoren möchte Dr. Abdellatif Benraiss an der University of Rochester für seine Betreuung und Diskussionen für die Erwachsenen chirurgische und Neugeborene Techniken zu lernen anerkennen. Die Autoren möchten auch anerkennen, Dr. James Lauderdale am UGA für die Nutzung seiner stereotaktischen Ausrüstung und Diskussionen im Zusammenhang mit der Methodik für diese Technik und die Förderung für Forschung College Wissenschaftler (ARCS) Grundlage für die Einrichtung ihrer Support und Hotline NIH (NINDS gewährt R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01).

Alle Tier verwenden Protokolle folgen die Tierpflege-Richtlinien von der University of Southern California und der University of Georgia. Euthanasie-Methoden für Schwangere Dämme und Erwachsene erfolgt nach anerkannten Protokolle: Kohlendioxid Erstickung, gefolgt von zervikale Dislokation als sekundäre Methode zur Euthanasie zu gewährleisten. Neugeborene Welpen sind durch Enthauptung eingeschläfert.
Achtung: Das folgende Protokoll beinhaltet ein pathogenes Virus Handhabung. Beim Umgang mit dem Virus, sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Alle Protokolle bedürfen der Zustimmung der entsprechenden institutionellen Ausschuss vor dem Gebrauch.
(1) embryonalen intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus
<ol><li>Betrachten Sie zur rechten Zeit schwanger Paarung, Mittag des Tages nach der Paarung als E0.5. Paar Mäuse am Ende des Tages und überprüfen Sie den Stecker in den frühen Morgenstunden, Variabilität der Paarungszeit zu reduzieren.</li>
	<li>Bereiten Sie die glasnadel vor der Operation. Ziehen Sie die Nadel und an 1/3 ihrer Länge geschnitten, dann in einem Winkel von 45° mit einer Mikropipette Schleifmaschine mit einem Tropfen Wasser, bis die Pore, um 50-70 µm. Check Nadelspitzen unter ein Stereoskop für Qualität und Bruch angepasst wird zu schärfen.</li>
	<li>Halten Sie das Virus aliquoten auf Eis. Nur vor der Operation laden Sie die ZIKV Injektion Mischung in die vorbereitete Glas Injektionsnadel. Montieren Sie der gasdichte Injektionsspritze (50 µL Volumen), Luer-Lock Befestigung und Schläuche, und sättigen Sie die montierte Spritze mit dem Schlauch mit Mineralöl. Gesättigt, befestigen Sie die Nadel und ziehen ~ 6-7 µL ZIKV in die Nadel (~ 1 µL beträgt 1,7 × 106 TCID50/mL).</li>
	<li>Injizieren Sie schwanger C57BL/6J oder 129S1/SvImJ Mäuse mit embryonalen Tag E14.5 Embryonen (für intrakranielle Injektion) oder E10.5 Embryonen (für intrauterine Injektion) mit Ketamin Hydrochlorid (80-100 mg/kg) und Xylazin (5 – 10 mg/kg) in steriler Kochsalzlösung verdünnt Anästhesie bei der Mutter intraperitoneal induzieren. Alternativ zu betäuben Mütter mit überwachten Isofluran Isofluran vorgesehenen Inhalation mit Abgas Aufräumvorgang, gegebenenfalls. Buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutan zur Analgesie induzieren zu injizieren.</li>
	<li>Kneiftest Mütter auf der Fußspitze oder Schweif betäubt und dann legen Sie diese Rückenlage auf ein Tier zugelassen Heizkissen (Wärmeleitpad von 100 x 200 2,5 mm). Die Zehe Prise Zangen sind nicht steril und werden nicht verwendet, um Gewebe in der Chirurgie zu behandeln. Behandschuhte Händen können alternativ verwendet werden, die Zehe Prise Rückzug Reflex testen. Hinweis: Finden Sie Ihren institutionellen Tierärzten für die bevorzugte Perioperative Heizung Methode. Eine Abdeckung wurde zwischen dieses Heizkissen und dem Tier gelegt.</li>
	<li>Fügen Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen.</li>
	<li>Die Oberfläche des Bauches zu rasieren und desinfizieren mit Jod und Alkohol dreimal. Wechseln Sie die Tücher Jod und Alkohol; Wischen Sie in einer kreisförmigen Bewegung weg von der Operationsstelle.</li>
	<li>Drapieren Sie die Haut rund um die Operationsstelle mit sterilen Tüchern zur Vermeidung von Kontaminationen der Schnitt und die Instrumente. Hinweis: Das Tuch öffnen sollte nicht größer als der vorbereiteten Operationsstelle sein; kein Haar sollte in der Faltenwurf Öffnung gesehen werden.</li>
	<li>Drücken Sie die Mutter Haut weg von ihrem Bauch mit der Pinzette und schneiden Sie Unterbauch in einer 1-1,5 cm-Linie an der medialen sagittale Linie mit sterile Chirurgische Schere. Dieses schneidet in die Haut und weiter in die Bauchhöhle, so dass die Embryonen nun ausgesetzt sind. Hinweis: Chirurgische Scheren dienen zur Haut und peritonealen Schicht einzuschneiden. Sterile Instrumente und Handschuhe sind für jede Operation eingesetzt.</li>
	<li>Schneiden Sie einen Schlitz in der Mitte eine kleine sterile Gaze und wenden auf der Oberseite der chirurgischen Eröffnung. Hydrat mit steriler Kochsalzlösung. Ziehen Sie die Embryonen durch den Schlitz auf die sterile Gaze, mit Sorgfalt, nicht mehr als 4-5 Embryonen mit Schwerpunkt auf eine uterine Horn auf einmal zu entfernen.</li>
	<li>Hydrat die Embryonen mit steriler Kochsalzlösung vor und während der Impfung um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen. Behalten Sie den Überblick welche Embryonen injiziert werden und ihre Position innerhalb der Gebärmutter Horn. Einzelnen Embryonen werden somit als separate Experimente als Embryonen nicht Position ändern während der Entwicklung im Mutterleibbehandelt. (Weiter zu Schritt 1.15 für intrauterine Injektion).</li>
	<li>Sanft lege einen Spatel unter dem Kopf des Embryos. Beleuchten Sie die Embryonen auch mit einer Lampe, die Kopf und Schädel Nähte zu visualisieren. Hinweis: Aseptischer Technik ist gefolgt, einschließlich sterile OP-Handschuhe und Instrumente. Nach unsteril Elemente (z. B. Leuchte) manipuliert, Handschuhe mit neuen sterile Handschuhe vor dem Umgang mit sterilen Instrumenten und Bereichen ausgetauscht werden.</li>
	<li>Stellung den Kopf durch die Manipulation des Embryos mit der Lampe (hinter dem Kopf sichtbar) und die Finger frei, bis der Kopf des Embryos ist direkt gegen die Gebärmutterwand geschoben und mit der nichtdominanten Hand in Position gehalten. Hinweis: Positionierung des Embryos ist ein wichtiger Bestandteil und die Technik, die meisten Praxis findet. Zuviel Druck mit den Fingern kann die embryonale Membranen führt zu Letalität beschädigen und nicht genügend Druck kann die Injektion schwierig machen.</li>
	<li>Die Blutgefäße, die entlang der Schädel Naht als Leitfaden zu verwenden. ZIKV Virus zu injizieren (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL mexikanische isolieren MEX1-44) in die seitlichen Ventrikel E14.5 Embryo Gehirne mit dem montierten Spritze und Nadel. Verwenden Sie Steuermedien als einer Scheininjektion.</li>
	<li>Zur Verbesserung der Aufbewahrung der Schwangerschaft vermeiden Sie viralen Injektion von zwei Embryonen neben den Eierstöcken und den zwei Embryonen neben der oberen Vagina (Abbildung 1A). Insgesamt sind nicht mehr als 6 Embryonen injiziert pro Wurf, reduzieren Sie die Zeit der Operation und Embryo Verlust zu verhindern.</li>
	<li>Setzen Sie die injizierten Embryonen wieder schwanger Dämme, und füllen Sie die Bauchhöhle mit ~ 0,5 mL sterile Kochsalzlösung. Abschließend möchte ich sagen, zuerst beide den peritonealen Bauchmuskel Naht und dann zweitens die äußere Hautschicht mit 4,0 steriles Nahtmaterial Naht. Es ist vorzuziehen, unterbrochene Nähte zu verwenden; Es besteht die Möglichkeit der Wunde Dehiszenz wenn die Maus den Faden kaut.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen um die Maus zu einem unbeheizten Bereich zu entkommen, bei Bedarf zu ermöglichen. Überwachen Sie die Mütter während sie zurückgewinnen (1-2 h) aus der Narkose. Nach Chirurgie für Zeiten nach einzelnen Experimenten variiert entwickeln Sie die Embryonen.</li>
	<li>
Intrauterine Injektion
	<ol>
<li>Mit einer Gebärmutter Horn und Embryonen ausgesetzt, verwenden Sie eine 1 mL Spritze und 27G Nadel 100 μL Zika-Virus (106 TCID50 Einheiten in 100 μL DMEM aufgehängt), Spritzen oder Steuermedium, in der intrauterinen Raum oder in der plazentaren Gewebes. Beachten Sie, welche Embryonen für embryonalen Stadium Sezierungen injiziert haben. Zuvor veröffentlichte Arbeit für mehr Details18zu sehen.</li>
		<li>Setzen Sie injizierte Embryonen wieder schwanger Dämme, und füllen Sie die Bauchhöhle mit ~ 0,5 mL sterile Kochsalzlösung. Zu schließen, zuerst den peritonealen Bauchmuskel Naht und dann zweitens die äußere Hautschicht mit 4,0 steriles Nahtmaterial Naht. Es ist vorzuziehen, unterbrochene Nähte zu verwenden; Es besteht die Möglichkeit der Wunde Dehiszenz wenn die Maus den Faden kaut.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen um die Maus zu einem unbeheizten Bereich zu entkommen, bei Bedarf zu ermöglichen. Überwachen Sie die Mütter während sie zurückgewinnen (1-2 h) aus der Narkose. Nach Chirurgie für Zeiten nach einzelnen Experimenten variiert entwickeln Sie die Embryonen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Neugeborenen intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus: P0/P1
<ol><li>Sicherstellen Sie, dass die gasdichte Injektionsspritzen (10 µL Volumen) und Nadeln nicht verstopft sind. Gereinigt und getestet durch das Laden drei 20 mL Einwegspritzen mit 26-Gauge Nadeln: eines mit Kochsalzlösung, eine mit 70 % Ethanol und eine mit Luft, die Lösungen zu löschen. Sterilisieren Sie mit 10 % Bleichmittel, wenn zuvor für Virus Injektion verwendet.</li>
	<li>Halten Sie Viren auf Eis. Laden Sie die Spritze durch füllen mit Kochsalzlösung, Totvolumen in der Spritze zu reduzieren und zeichnen Sie 0,75 µL der Luft das Injektionsmaterial Salzlösung getrennt.</li>
	<li>Richten Sie eine angewärmte befeuchtete Erholung Kammer für injizierten Welpen. Mit einem Heizblock, einen verschließbaren Behälter (z. B. eine leere Tipp-Box) mit steriler Gaze und mit Kochsalzlösung befeuchtet. Heizen Sie es vor dem Beginn der Injektionen.</li>
	<li>Richten Sie die Microinjector einschließlich der Pumpe und dem Controller. Bestimmen Art Gerätecode für die spezifische Spritze (d. h., bei einer 10 µL Spritze, der Gerätetyp ist "D"). Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der Injektion.</li>
	<li>Die postnatale Tag 0 oder 1-Welpen (P0/P1) in der Nähe der chirurgischen Einrichtung zu sammeln. Laden Sie die Injektionsspritze mit Virus. Desinfizieren der Welpe Galgen mit 70 % EtOH.</li>
	<li>Wickeln Sie die Welpen in eine dünne Schicht aus Gaze und beerdigen Sie vollständig im Eis, einen Narkose Zustand zu erreichen. Welpen sind Cryoanesthetized für 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Welpen ausreichend für die Injektion betäubt sind, durch die Durchführung einer Rute/Toe Klemme ohne Antwort. Dies ergibt ca. 15 min von einer Narkose Zustand.</li>
	<li>Platzieren Sie den Welpen am Galgen, Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes mit Jod und Ethanol (dreimal) und dann mit einem sterilen Tuch trockenwischen (Isopropanol oder 70 % EtOH).</li>
	<li>Markieren Sie Lambda mit einem schwarzen Filzstift und notieren Sie die Koordinaten an Lambda mit dem stereotaktischen Instrument. Die Distanz von Lambda bis an den Rand des Auges und ab der stereotaktischen Koordinaten von Lambda berechnen Sie den Abstand von 2/5 von Lambda für das Auge (für beide Gehirnhälften, wenn Sie beide injizieren).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Narkose Tiefe vor dem Erstellen ein Loch für die Injektionsstelle. Verwenden Sie eine 26-Gauge-Nadel, um vorsichtig und oberflächlich zu durchbohren die Kopfhaut und Schädel an den anspritzpunkt (der Schädel ist sehr weich beim Neugeborenen) um eine Öffnung für die Injektionsnadel zu erstellen.</li>
	<li>Senken Sie die Injektionsnadel in die punktierte Stelle, und sobald die Nadel nur die Haut verletzt ist, berechnen Sie eine 1 mm Tiefe für die Injektionsstelle (seitliche Ventrikel) mit dem stereotaktischen Instrument.</li>
	<li>Sobald die Nadel auf die Injektion Tiefe abgesenkt ist, Programmieren der Microinjector zu injizieren: 1 µL des Virus, mit einer Rate von 10 nL/s, Injektion von etwa 1 µL über 1,5 min (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).</li>
	<li>Wenn die Injektion abgeschlossen ist, warten 30 s und zurückziehen die Nadel in Schritten von 0,5 mm durch Drehen der Schraube (dorsal), warten 30 s nach jedem Schritt. Hinweis: Dies verringert Leckage des injizierten Virus.</li>
	<li>Sobald entfernt, entweder schnell laden die Nadel und Spritze mit mehr Virus (verschiedene Viren oder mock Kontrollen sollten in separaten Spritzen/Nadeln geladen werden) oder der Welpe aus der Galgen in die vorgewärmte Feuchte Kammer entfernen. Überwachen Sie die Welpen alle paar Minuten um Erholung zu beurteilen. Ersetzen Sie die Welpen mit ihren Wurf.</li>
</ol>3. Erwachsene intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus
<ol><li>Injizieren sie Erwachsene Mäusen intraperitoneal mit Ketamin Hydrochlorid (80-100 mg/kg) und Xylazin (5 – 10 mg/kg) verdünnt in sterile Kochsalzlösung, Anästhesie zu induzieren. Buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutan zur Analgesie induzieren zu injizieren. Zehe/Tail Kneifen die Maus, um die Narkose Zustand zu gewährleisten, und montieren Sie ihn anschließend auf dem stereotaktischen Instrument (mit einem Heizkissen) um den Kopf während der Operation zu immobilisieren.</li>
	<li>Fügen Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, die Augen der Maus vor dem Austrocknen während der Operation zu verhindern. Rasieren der Kopfhaut, hinter den Augen bis zum Anfang der Ohren ab. Sterilisieren die exponierten Haut mit Jod und 70 % EtOH dreimal. Wechseln Sie die Tücher Jod und Alkohol; Wischen Sie in einer kreisförmigen Bewegung weg von der Operationsstelle.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Narkose Tiefe vor Einritzen der Haut. Mit einem Skalpell, machen Sie einen 0,5 cm Schnitt entlang der medialen sagittale Linie des Kopfes in den sterilisierten Standort Bregma auszusetzen. Mit eine Rollbewegung mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator, klar die Oberfläche des Schädels von meningealen Gewebe, drücken Sie gleichzeitig die Haut weg von den Injektionsstellen.</li>
	<li>Ausgehend von Bregma, die chirurgische Bohrer ausrichten und identifizieren die Injektionsstellen mit den folgenden Koordinaten: AP-0,50 mm, ML: + /-1,5 mm. mit Fußpedal steuern, Bohren in Schädel langsam, nur Knochen Bohren, bis ein Loch für die Nadel gelöscht wurde.</li>
	<li>Ersetzen Sie den Bohrer mit Microinjector Pumpe und gasdichte Spritze (10 µL Volumen) auf der stereotaktischen. Eine kleine Luftblase zwischen Kochsalzlösung und Virus verlassend zeichnen ~ 4-5 µL des Virus. Bestimmen Sie den Typ Gerätecode für spezifische Spritzenvolumen (dh, D für 10 μL Volumen Spritze). Senken Sie die Nadel auf DV:-1,50 mm von der Oberfläche des Gehirns. 1 µL des Virus zu injizieren, programmieren Sie eine Rate von 10 nL/s, ca. 1 µL über 1,5 min injizieren.</li>
	<li>Wenn die Injektion abgeschlossen ist, warten 30 s, und entfernen Sie die Nadel in Schritten von 0,5 mm, warten 30 s nach jedem Zug. Dies reduziert Rückfluss und Leckage des injizierten Virus.</li>
	<li>Nach Abschluss der Injection(s) verwenden Sie Zange, um der Haut zu lösen und den freigelegten Schädel zu erholen. Naht die Kopfhaut wieder zusammen mit 4,0 Nähte und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Statt der Maus in einen Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen erlauben die Maus, um zu einem unbeheizten Bereich bei Bedarf zu entkommen und zu überwachen, während sie (1-2 h) wiederherstellen aus der Narkose.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschrieben, ist eine Methode für intrazerebrale Inokulation von der ZIKV in embryonalen, Neugeborene und Erwachsene Stadien für die Untersuchung der ZIKV-induzierten Schäden in die Entwicklung des Gehirns. Während einfach, gibt es ein paar Überlegungen, die Ermittler nehmen sollten, um die Qualität der Studie und die Sicherheit aller Beteiligten zu gewährleisten.
DENV ist ZIKV in der Gattung Flavivirus eng verwandt. DENV ist nicht kausal mit pädiatrischen hirnstörungen bei Menschen verbu...

Mikrozephalie ist eine Erkrankung, die durch defekte Gehirnentwicklung gekennzeichnet durch kleiner als durchschnittliche Kopfumfang bei Neugeborenen. Kinder mit Mikrozephalie weisen eine Reihe von Symptomen, darunter für Entwicklungsverzögerung, Beschlagnahme, geistige Behinderung, Schwerhörigkeit, Sehstörungen und Probleme mit Bewegung und Gleichgewicht, unter anderem abhängig von der Schwere der Erkrankung und Ursache1,2,3. Diese Bedingung ist multifaktoriell, in der Natur, mit genetischen, infektiöse Agenten und Umweltfaktoren verbunden, Mikrozephalie,4,5,6,7,8zu verursachen, 9. Vor dem Ausbruch 2015-2016 ZIKV waren 8 Kinder von 10.000 Geburten mit Mikrozephalie in den Vereinigten Staaten nach der CDC-10diagnostiziert. Am Februar 1St 2016 die Weltgesundheitsorganisation erklärte der Zika-Virus eine Public Health Notlage von internationaler Tragweite aufgrund der alarmierenden Zunahme Mikrozephalie Diagnosen zugeordnet ZIKV Infektion in Mütter11, 12. Eine aktuelle Studie aus der CDC ZIKV Fälle in den Vereinigten Staaten legt nahe, dass mütterliche ZIKV Infektion führt in ein 20-fold erhöhtes Risiko für ein Kind, Mikrozephalie, im Vergleich zu nicht infizierten Personen und 4 % der ZIKV infizierte Mütter aus den USA zu entwickeln geführt haben Kinder mit Mikrozephalie11. Die Rate der Mikrozephalie assoziierten Fehlbildungen während der Schwangerschaft von ZIKV Infektion in Brasilien gemeldet wurden, betroffen sind bis zu 17 % der Babys in infizierten Müttern, darauf hinweist, dass andere Faktoren in Lateinamerika auf das erhöhte Risiko beitragen kann 13. während wir wissen, dass die ZIKV in den neuronalen Vorläuferzellen Zelle (NPC) Bevölkerung7,8,14Mikrozephalie und Pathogenese führen kann, die komplette Pathogenese von ZIKV in der Entwicklung des Gehirns bleibt schwer. Es ist wichtig, Tiermodelle um weiter zu untersuchen, die Krankheitsmechanismen, die die Gehirn Anomalien ZIKV Infektion zu entwickeln.
Um direkt die Wirkung zu untersuchen, die die ZIKV auf die Entwicklung des Gehirns hat, haben wir zuerst ein Maus-Modell mit ZIKV7intrazerebrale Inokulation von embryonalen Tag 14,5 (E14.5) Gehirn entwickelt. Diese Phase wurde gewählt, weil es als repräsentativ für das Ende des ersten Trimesters in menschlichen Schwangerschaft14 gilt. Welpen können mit dieser Methode der embryonalen intrazerebrale Injektion bis zu postnatalen Tag 5 (P5) überleben (~ 1 µL von 1,7 x 106 Gewebekultur Infektionsdosis (TCID50/mL)). Diese postnatalen Welpen zeigen eine Reihe von Phänotypen, die in ähnlicher Weise beobachtet bei infizierten menschlichen Säuglingen einschließlich der erweiterten Ventrikel, neuronaler Verlust axonalen Verdünnung, Astrogliosis und Microglial Aktivierung12,15. Ein Neugeborenes Mäusegehirn ist relativ unreif, vergleichbar mit der Entwicklungsstufe des menschlichen Gehirns bei Mid Schwangerschaftswoche16und Maus Gehirnentwicklung umfasst eine postnatale Hauptkomponente. Um späteren Schwangerschaft Bühne Infektionen zu studieren, ist eine Methode für die postnatale Infektion auch beschrieben. Neugeborene infiziert mit ZIKV auf P1 sind in der Lage, bis zu 13 Tage nach der Injektion zu überleben. Blut geboren Erwachsenstadium Infektion ist beschrieben worden, in der Maus bisher17 aber den Einsatz von erfordert Interferon (IFN) regulatorischen Faktor (IRF) Transkription Faktoren IRF-3,-5-7 triple Knockout-Stamm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des ZIKV intraventricularly um zu umgehen, Deaktivieren der antiviralen Reaktion des murinen Modells beim Erwachsenen impfen. Während dies das murine Immunsystem umgeht, ist diese Route der Injektion nicht direkt den typischen Weg der Infektion nachahmen. Um diese Diskrepanz zu beheben kann direkt, der Experimentator eine intrauterine Infektion der ZIKV anstelle der intrakraniellen Route durchführen. Aus früheren Arbeiten18übernommen, haben wir diese Technik in diesem Protokoll embryonalen Infektion kurz beschrieben.
Zika Virusstämme umgesetzt mit dieser Technik gehören das mexikanische Isolat MEX1-447,19 und die afrikanischen isolieren Herr-766 in 194720isoliert. Zika MEX1-44 wurde in Chiapas, Mexiko isoliert im Januar 2016 von einem infizierten Aedes Aegypti Mücke. Wir erhalten dieses Virus mit Genehmigung durch die University of Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Darüber hinaus wurde das Dengue-Virus Serotyp 2 (DENV2) geimpft mit dieser Technik in einer Vergleichsstudie. DENV2, Stamm S16803 (Reihenfolge GenBank GU289914), wurde im Jahr 1974 von einer Patientenprobe aus Thailand isoliert und in C6/36 Zellen passagiert. Das Virus wurde zweimal in Vero-Zellen durch die Welt-Referenzzentrum für auftauchende Viren und Arboviren (WRCEVA) vor der Maus Injektionen passagiert. Dies zeigt, dass diese Technik genauso funktioniert gut für verschiedene Stämme von ZIKV und anderen Flaviviren, die sich auf die Entwicklung des Gehirns auswirken können.

<table><tbody><tr><td>Flexible Antriebswelle Bohrer Hängender Motor</td><td>Leica</td><td>39416001</td><td></td></tr><tr><td>Maus Stereotax</td><td>Kopf</td><td>04557R</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Mikrospritzenpumpen-Controller</td><td>WPI</td><td>SYS-MICRO4 UMP3</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump</td><td>WPI</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Modulamp</td><td></td><td></td> Schott-Luer-Lock-Schlauch <td></td></tr><tr><td>(19-Gauge)</td><td>Hamilton</td><td>90619</td><td></td></tr><tr><td>Schmelzpunkt Kapillare</td><td>Kimble</td><td>34500-99</td><td>Glasnadel</td></tr><tr><td>Fluor-Max: Rot Fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Thermo Scientific</td><td>R25</td><td>Keine Verdünnung; Verwendung für Übungsinjektionen</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L, Modell 1701 LT SYR</td><td>Hamilton</td><td>80001</td><td>für embryonale Inokulation</td></tr><tr><td>10 & Mikro; L, Modell 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 Zoll, Punktausführung 2</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>für Neugeborene/Erwachsene</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon Nylon Nähte</td><td>Ethicon-Mineralöl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> VWR-Mikropipettenabzieher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenschleifer</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Fastgreen FCF Farbstoff</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td>injiziert 0,5 % Farbstoff</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavivirus-Gruppen-Antigen-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB10216</td><td>ms IgG2a 1:400 (Abbildung 2, Abbildung 3)</td></tr><tr><td>Pax6</td><td>DBHB</td><td>Pax6-s</td><td>ms IgG1 1:20</td></tr></tbody></table>

mausmodelle für zika-virus-induzierte neurologische erkrankungen mit intrazerebrale injektion strategien etablieren: embryonale, neugeborene und erwachsene

Establishing Mouse Models for Zika Virus-induced Neurological Disorders Using Intracerebral Injection Strategies: Embryonic, Neonatal, and Adult

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Flavivirus derzeit in Nord-, Mittel- und Südamerika weit verbreitet. Es ist jetzt festgestellt, dass die ZIKV Mikrozephalie und zusätzliche Gehirn Anomalien verursachen kann. Der Mechanismus der Pathogenese von ZIKV in das sich entwickelnde Gehirn bleibt jedoch unklar. Intrazerebrale Operationsmethoden werden häufig in der neurowissenschaftlichen Forschung Fragen über normalen und abnormalen Hirnentwicklung und Funktion des Gehirns verwendet. Dieses Protokoll nutzt klassische Operationstechniken und beschreibt Methoden, die ein Modell ZIKV-assoziierten neurologischen Krankheiten des Nervensystems Maus zu lassen. Während direkte Gehirn Impfung nicht den normalen Modus der Virenübertragung Modell, kann die Methode Ermittler, gezielte Fragen über die Folge nach ZIKV Infektion der das sich entwickelnde Gehirn. Dieses Protokoll beschreibt embryonale, Neugeborene und Erwachsene Phasen der intraventrikulären Inokulation von ZIKV. Einmal gemeistert, kann diese Methode eine einfache und reproduzierbare Technik werden, die dauert nur ein paar Stunden durchzuführen.

Repräsentative Bilder unserer Einspritzung Methoden für die ZIKV Impfung des embryonalen Gehirns in Diagrammen darstellen intrazerebrale Injektionen (Abbildung 1A) angezeigt werden und intrauterine und Intraplacental Injektionen (Abbildung 1 b), zur Veranschaulichung der Art und Weise der schwangeren Damm und Embryonen sollten angesehen und für Chirurgie (embryonale Inokulation Protokoll) orientiert. Abbildun...

Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

The Zika virus (ZIKV) is a flavivirus currently endemic in North, Central, and South America. It is now established that the ZIKV can cause microcephaly ...

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Operationsmethoden ist es, in vivo Modelle der intrakraniellen Zika-Virusinfektion zu etablieren. Diese Methode kann dazu beitragen, die Schlüsselfragen auf diesem Gebiet zu beantworten, wie z. B. die Pathologie und den Mechanismus der Zika-Virusinfektion im Gehirn sowohl im frühen und späteren Entwicklungsstadium als auch im Erwachsenenstadium. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Richtungsinfektion des Gehirns leicht erreicht werden kann.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf Therapien oder Diagnosen von Zika-Virus-induzierter Mikrozephalie oder anderen neurologischen Entwicklungsstörungen. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Pathogenese des Zika-Virus geben kann, kann sie auch zur Untersuchung anderer Flavivirus-Infektionen im Gehirn, wie z. B. des Dengue-Virus, angewendet werden. Laden Sie kurz vor der Operation die Zika-Virus-Injektionsmischung in eine vorbereitete Glasinjektionsnadel, indem Sie zuerst die gasdichte 50-Mikroliter-Injektionsspritze, den Luer-Lock-Aufsatz und den Schlauch zusammenfügen.Tränken Sie die zusammengebaute Spritze und den Schlauch mit Mineralöl. Sobald die Nadel gesättigt ist, befestigen Sie sie und ziehen Sie etwa sechs bis sieben Mikroliter Virus in die Nadel. Nach der Betäubung einer mit E14.5-Embryonen schwangeren Hündin testen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Zehe oder den Schwanz einklemmen.Wenn eine chirurgische Anästhesieebene erreicht ist, stellen Sie sicher, dass der Damm in Rückenlage auf einem Heizkissen liegt. Rasieren Sie die Oberfläche des Bauches und sterilisieren Sie sie dreimal mit Jod und Alkohol. Decken Sie die Haut rund um das Operationsfeld mit sterilen Tüchern ab, um eine Kontamination des Schnitts und der Instrumente zu vermeiden.Kneifen und heben Sie die Haut des Bauches mit einer Pinzette an, dann verwenden Sie eine sterile Schere, um einen 1 bis 1 1/2 Zentimeter großen Schnitt im Unterbauch an der medial-sagittalen Linie zu machen und die Embryonen freizulegen. Schneiden Sie dann einen Schlitz in die Mitte einer kleinen sterilen Gaze und legen Sie ihn über die chirurgische Öffnung. Hydratisieren Sie die Öffnung und die Gaze mit steriler Kochsalzlösung.Ziehen Sie dann die Embryonen durch den Schlitz, um auf der Gaze zu ruhen, und achten Sie darauf, nicht mehr als vier oder fünf Embryonen auf einmal zu entfernen. Hydratisieren Sie die Embryonen vor und während der Impfung mit steriler Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen. Beleuchten Sie den zu injizierenden Embryo mit einer Lampe, um die Kopf- und Schädelnähte sichtbar zu machen, legen Sie dann vorsichtig einen Spatel unter den Kopf des zu injizierenden Embryos und manipulieren Sie den Embryo, bis der Kopf direkt gegen die Gebärmutterwand gedrückt wird.Halten Sie den Embryo mit der nicht-dominanten Hand an Ort und Stelle. Verwenden Sie die Spritze, um das Zika-Virus oder das Kontrollmedium in die Seitenventrikel des embryonalen Gehirns zu injizieren. Verwenden Sie für die intrauterine Injektion im E11,5-Stadium eine Ein-Milliliter-Spritze und eine 27-Gauge-Nadel, um das Zika-Virus oder ein Kontrollmedium in den Intrauterinraum zu injizieren.Um den Erhalt der Schwangerschaft zu verbessern, vermeiden Sie es, die beiden Embryonen neben den Eierstöcken und die beiden Embryonen neben der oberen Vagina zu injizieren. Wenn Sie eine intrauterine Injektion durchführen, injizieren Sie in den intrauterinen Raum oder in die Plazenta. Setzen Sie die Embryonen wieder in die trächtige Mutterdame ein und füllen Sie die Bauchhöhle mit etwa 0,5 Millilitern steriler Kochsalzlösung.Vernähen Sie sowohl den Bauchfellmuskel als auch die äußere Hautschicht mit sterilen 4-0-Nähten. Halten Sie den Damm auf einem Heizkissen und überwachen Sie, während Sie sich von der Narkose erholen. Tauen Sie das Virus auf Eis auf und befüllen Sie dann die Spritze, indem Sie sie mit Kochsalzlösung füllen, um das Totvolumen in der Spritze zu reduzieren.Ziehen Sie bis zu 0,75 Mikroliter Luft, um die Kochsalzlösung vom Injektionsmaterial zu trennen. Um eine erwärmte, befeuchtete Auffangkammer einzurichten, stellen Sie einen verschließbaren Behälter mit einer sterilen Gaze auf eine auf 37 Grad Celsius eingestellte Wärmebox und tränken Sie sie mit Kochsalzlösung. Nachdem Sie die Mikroinjektorpumpe und den Controller eingerichtet haben, beladen Sie die Injektionsspritze mit dem Virus und sterilisieren Sie die Pumpenkopfhalterung des chirurgischen Aufbaus mit 70 % Ethanol.Nachdem Sie die neugeborenen Welpen fünf Minuten lang kryoanästhesiert haben, stellen Sie eine ausreichende Anästhesie für die Injektion sicher, indem Sie nicht auf ein Einklemmen des Schwanzes oder der Zehen reagieren. Setze den Welpen auf die Kopfhalterung. Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes mit Jod, dann mit Ethanol und wischen Sie sie dann mit einem Alkoholtupfer trocken.Markieren Sie Lambda mit einem schwarzen Marker, messen Sie dann den Abstand von Lambda zum Augenrand und berechnen Sie mit stereotaktischen Koordinaten den 2/5-Abstand von Lambda zum Auge. Verwenden Sie anschließend eine 26-Gauge-Nadel, um die Kopfhaut und den Schädel an der Injektionsstelle vorsichtig und oberflächlich zu durchstechen und eine Öffnung für die Injektionsnadel zu schaffen. Senken Sie nun die Injektionsnadel in die Einstichstelle ab und berechnen Sie, nachdem die Nadel gerade die Haut durchbrochen hat, mit dem stereotaktischen Instrument eine Tiefe von einem Millimeter für die Injektion in die Seitenkammer.Sobald die Nadel auf die Injektionstiefe abgesenkt ist, injizieren Sie einen Mikroliter Virus mit einer Geschwindigkeit von 10 Nanolitern pro Sekunde. Warten Sie 30 Sekunden nach der Injektion und ziehen Sie die Nadel dann in Schritten von 0,5 Millimetern zurück, indem Sie die Schraube nach dorsal drehen und nach jedem Schritt 30 Sekunden warten, um das Austreten des injizierten Virus zu reduzieren. Nach Beendigung der Injektion wird der Welpe in die vorgewärmte, befeuchtete Kammer überführt und bis zur Genesung überwacht.Den Kopf einer anästhesierten erwachsenen Maus in das stereotaktische Instrument ruhigstellen und ein Heizkissen unter die Maus legen. Nach einem Kneifen der Zehen oder des Schwanzes, um eine chirurgische Anästhesie zu gewährleisten, rasieren Sie die Kopfhaut beginnend hinter den Augen bis zum Anfang der Ohren. Sterilisieren Sie die exponierte Haut mit Jod und 70% Ethanol.Nachdem Sie einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt entlang der medial-sagittalen Linie des Kopfes an der sterilisierten Stelle gemacht haben, um das Bregma freizulegen, befreien Sie die Oberfläche des Schädels von meningealem Gewebe und drücken Sie gleichzeitig die Haut von den Injektionsstellen weg. Richten Sie den chirurgischen Bohrer auf das Bregma aus und identifizieren Sie dann die Injektionsstelle anhand der stereotaktischen Koordinaten. Bohren Sie mit dem Fußpedal langsam in den Schädel, bis das Loch für die Nadel frei ist.Ersetzen Sie den Bohrer durch die Mikroinjektorpumpe und die gasdichte 10-Mikroliter-Spritze. Lassen Sie eine kleine Luftblase zwischen der Kochsalzlösung und dem Virus und ziehen Sie vier bis fünf Mikroliter Virus auf. Senken Sie die Nadel bis zu 1,5 Millimeter unter die Gehirnoberfläche von der Gehirnoberfläche ab und injizieren Sie einen Mikroliter Virus mit einer Geschwindigkeit von 10 Nanolitern pro Sekunde, wobei der eine Mikroliter über 1 1/2 Minuten injiziert wird.Nachdem Sie die Nadel wie zuvor schrittweise aus dem Gehirn entfernt haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut zu lockern und den freiliegenden Schädel wieder zu bedecken. Sobald die Kopfhaut mit 4-0-Nähten vernäht wurde, nehmen Sie die Maus aus der Stereotax und überwachen Sie sie auf einem Heizkissen, bis sie sich erholt hat. Neuro-Vorläuferzellen sind vier Tage nach der Injektion bei E18.5 mit Pax6 (rot zu sehen) und Zika-Virus über Flavivirus-Antigene (grün) immunmarkiert.Das embryonale Gehirn ist mit dem MEX1-44-Stamm des Zika-Virus in allen Schichten des sich entwickelnden Neokortex infiziert. Der TCID50-Assay mit Gewebe aus Hirngewebe nach der Geburt am dritten Tag, das mit E14.5 geimpft wurde, zeigt, dass sich das Zika-Virus effizient replizieren und in sich entwickelnden Gehirnen wachsen kann. Dieses Bild zeigt eine MEX1-44-Zika-Virusinfektion an der P13-Großhirnrinde nach P0-Injektion.Zika wird mit einem Antikörper gegen das Antigen der Flavivirus-Gruppe nachgewiesen, das in Rot zu sehen ist. Diese Bilder zeigen die fluoreszierenden Kügelchen, die verwendet wurden, um die Injektionsstelle und den Erfolg der lateralen Ventrikelinjektion bei Erwachsenen zu üben. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Überblick über die injizierten Embryonen zu behalten, geeignete Kontrollen durchzuführen und die Operationswunden klein zu halten.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie intraperitoneale oder arterielle Injektionen durchgeführt werden, um die zusätzliche Frage zu beantworten, wie z.B. wie das Zika-Virus die Plazenta passiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das In-vivo-Mausmodell einer Zika-Virusinfektion im Gehirn generiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt die Erstellung eines experimentellen Mausmodells für zerebrale Malaria. Sporozoiten, die aus mit Plasmodium berghei infizierten weiblichen Mücken isoliert wurden, werden in die Schwanzvenen einer gefesselten Maus injiziert, was zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einer Gehirnentzündung führt, die zerebrale Malaria verursacht. Dieses infizierte Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der mikrovaskulären Pathologie in vivo im Zusammenhang mit...

Generierung eines Mausmodells für experimentelle zerebrale Malaria unter Verwendung von Sporozoiten aus der Wirtsmücke

Dieses Video zeigt die Etablierung eines in vitro Modells für Zika-Virusinfektionen in einem sich entwickelnden Gehirn. Menschliche zerebrale Organoide, die Rosetten von Stammzellen, neuralen Vorläuferzellen (NPCs) und Neuronen enthalten, sind mit dem Zika-Virus infiziert. Das Virus infiziert NPCs und löst Apoptose aus, wodurch die Entwicklung von Organoiden gestört wird.

Entwicklung eines In-vitro-Modells für Zika-Virusinfektionen in zerebralen Organoiden

Dieses Video zeigt die Generierung eines Mausmodells mit einer ZNS-Infektion. Einem säugenden Welpen wird das Virus sowohl intrakraniell als auch intraperitoneal injiziert. Das Virus breitet sich aus, infiziert das ZNS und verursacht neuronalen Zelltod und Entzündungen. Der Welpe wird im Verlauf der Krankheit auf Symptome einer Infektion untersucht.

Generierung eines Mausmodells mit einer Infektion des Zentralnervensystems

Das Video zeigt die intrazerebrale Injektion von Zika-Virussuspension in eine erwachsene Maus, um Neurodegeneration zu induzieren. Eine anästhesierte Maus wird in einem stereotaktischen Rahmen gesichert und ein Loch in den freiliegenden Schädel gebohrt, das zur Injektion verwendet wird. Eine Suspension des Zika-Virus wird in das Hirngewebe injiziert. Die Virusinfektion verursacht Entzündungen, die zu Neurodegeneration führen.

Etablierung eines Modells der Zika-Virus-induzierten Neurodegeneration bei einer erwachsenen Maus

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Infektion menschlicher fetaler neuraler Stammzellen mit dem Zika-Virus. Die infizierten Zellen können für weitere Studien verwendet werden.

Zika-Virus-Infektion von fötalen neuralen Stammzellen

Hier demonstrieren wir eine Technik zur weit verbreiteten neuronalen Transduktion durch intraventrikuläre Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das neonatale Mausgehirn.  Diese Methode bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, eine lebenslange Expression von viral transportierten Transgenen zu erreichen.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik verwendet, um Zika-Virus-Infektion für die Entwicklung des menschlichen Gehirns zu modellieren. Mit Wildtyp oder veränderter Zelllinien, können Forscher diese Technik verwenden, um entdecken Sie die verschiedenen Mechanismen oder Behandlungen, die frühe Infektion des Gehirns und resultierende Mikrozephalie bei Zika Virus-infizierten Embryos beeinträchtigen können.

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

Dieser Artikel beschreibt die Methoden, die verwendet werden, um die menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen in Kultur, sowie zur Unterscheidung in verschiedenen neuronalen Subtypen und Astrozyten, mit einem Schwerpunkt auf den Einsatz von neuronalen Stammzellen Zika-Virus-Infektion zu studieren zu erweitern.

Zika-Virus-Infektion der kultivierten menschlichen fetalen Gehirns neurale Stammzellen für Immunocytochemical Analyse

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1- / - Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Schaffung eines immunkompetenten ICR (Institute of Cancer Research) murinen Modells der Infektion des zentralen Nervensystems vor, um die Entwicklung der Neuropathie anzuzeigen. Die Überwachung akuter viraler Enzephalit-Erkrankungen durch identische Krankheitswerte könnte durchgeführt werden, um die dengue-Virus-induzierte Neuropathie in vivo zu zeigen.

Ein murines Modell der Dengue-Virus-induzierten akuten viralen Enzephalitis-ähnlichen Krankheit

Das Ziel des Protokolls ist es, die Techniken zu demonstrieren, die verwendet werden, um Viruserkrankungen zu untersuchen, indem das Zika-Virus von mehreren Organen in einer Maus nach einer Infektion isoliert und quantifiziert wird.

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

Lernen Sie eine chirurgische Methode zur intrazerebralen Zika-Virus-Injektion in Mäuseembryonen, Neugeborene und Erwachsene. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung viraler Pathogenese und neurodevelopmentaler Störungen.

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene (Video) | JoVE Journal

Mausmodelle für Zika-Virus-induzierte neurologische Erkrankungen mit intrazerebrale Injektion Strategien etablieren: embryonale, Neugeborene und Erwachsene

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