Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung
25. September 2017
Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen mit mitochondrialen-abgeleitete Peptide stimulieren und die Signalisierung Kaskade und Lokalisierung von Phospho-Proteine zu beurteilen.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die nachgeschaltete Signalkaskade zu identifizieren, die an Zellen beteiligt ist, die mit mitochondrialen Peptiden stimuliert wurden. Diese Methode kann wichtige Fragen im Bereich der mitochondrialen Peptide beantworten, z. B. welche Signalwege beteiligt sind und wo dies geschieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unkompliziert und relativ einfach durchzuführen ist.
Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir den Humanin-vermittelten ERK-Signalweg untersuchten, der uns nur begrenzte Informationen über die nachgelagerten Fakten lieferte. Die Subscale-Kersher-Methode gab uns eine bessere Vorstellung von der Rolle der Humanin-vermittelten Signalübertragung. Am dritten Tag nach dem Plattieren und Waschen zweimal zehn bis zum sechsten, SH-SY5Y oder HEK293 Zellen gemäß dem Textprotokoll.
Lösen Sie S14G-Humanin-Peptide in nullkommafiltriertem, zwei Mikron gefiltertem destilliertem Wasser auf. Und konstituieren Sie sie als eine einmillimolare Stammlösung. Aliquotieren Sie das vorgewärmte serumhaltige oder serumfreie Medium in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie eine Humanin-Peptid-Stammlösung bei Raumtemperatur hinzu, um eine Arbeitskonzentration zu erhalten.
Ersetzen Sie sofort das Medium in den Zellen durch sechs Milliliter der Peptidlösung. Und inkubieren Sie die Zellen für die entsprechende Zeitspanne. Verwenden Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.
Dann kratzen Sie die Zellen in fünf Millilitern eiskaltem PBS von der Platte. Und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G und vier Grad Celsius.
Das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Fraktionierungspuffer erneut suspendieren und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 mal G und vier Grad Celsius. Sammeln Sie dann den Überstand als zytoplasmatische Fraktion und bewahren Sie das Pellet für die Kernfraktion auf.
Zentrifugieren Sie den Überstand, um Zelltrümmer und andere Verunreinigungen zu entfernen, bei 18000 mal G und vier Grad Celsius für zehn Minuten. Und dann überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist die Cytisolfraktion.
Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern eiskaltem Waschpuffer und zentrifugieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 250 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 100 Mikroliter eiskalten nuklearen Extraktionspuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Dann beschallen Sie die Probe 10 Mal auf Eis.
Zentrifugieren Sie die Probe erneut. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Um die rohe mitochondriale Fraktion zu isolieren, verwenden Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen in jeder 10-Zentimeter-Schale zu waschen.
Fügen Sie dann fünf Milliliter eiskaltes PBS hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Aspirieren Sie das PBS und verwenden Sie einen Milliliter eiskalten mitochondrialen Isolationspuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Homogenisieren Sie dann mit einem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Stößel auf Eis die Zellen mit 25 Hüben eines Zwei-Milliliter-Homogenisators. Übertragen Sie das Homogenat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 600 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellkerne und unzerbrochenen Zellen zu entfernen.
Sammeln Sie dann den Überstand, geben Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Lösung bei 7000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Pellet erneut mit 200 Mikrolitern eiskaltem Mitochondrien-Isolationspuffer und überführen Sie die Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 7000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Verwenden Sie nach dem Waschen 15 Mikroliter RIPA-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 16000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie den Überstand, bei dem es sich um die mitochondriale Fraktion handelt, in ein neues Röhrchen.
Quantifizieren und führen Sie Western Blotting gemäß dem Textprotokoll durch. Unter Verwendung des in diesem Video gezeigten Verfahrens wurden HEK293- und SH-SY5Y-Zellen mit einem und 100 mikromolaren S14 G Humanin, einem potenten Humanin-Analogon, zurückgebildet. Und die Gesamt- und phosphorylierte Form von ERK12 an Theanin 202, Tyrosin 204 aus Gesamtproteinextrakten wurden analysiert.
Wie hier zu sehen ist, zeigte die Behandlung mit S14G Humanin eine Zunahme der Phosphorylierung von ERK12 und seiner regulatorischen Theanin-202-Tyrosin-204-Stelle. Um das Ziel der S14G-Humanin-vermittelten ERK12-Aktivierung zu verstehen, wurde die subzelluläre Lokalisation von gesamtem und phosphoryliertem ERK12 nach S14G-Humanin-Behandlung analysiert. Wie in diesen Western Blots gezeigt, stieg in HEK293-Zellen das phosphorylierte ERK sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern an, nicht jedoch in den Mitochondrien.
In SH-SY5Y-Zellen nahm die phosphorylierte ERK jedoch im Zytoplasmakern und in den Mitochondrien ab. Dies deutet darauf hin, dass die S14G-Humanin-vermittelte ERK-Phosphorylierung bei verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen Bedingungen eine unterschiedliche Rolle spielen kann. Einmal gemeistert, kann die Zellkernfraktionierung in einer Stunde und die mitochondriale Fraktionierung in einer Stunde und 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben auf Eis zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie co-immunale Fällung und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die nachgeschalteten Ziele der Signalmoleküle zu verstehen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen mit mitochondrialen Peptiden stimuliert und die Signaltransduktion sowie die Lokalisation von Phosphoproteinen analysiert werden können. Das übergeordnete Ziel besteht darin, die downstream-Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, die in Zellen aktiviert wird, die mit diesen Peptiden stimuliert wurden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellsignalgebung
- Mitochondriale Biologie
- Proteinkinasephosphorylierung
Hintergrund
- Die von Mitochondrien abgeleiteten Peptide spielen eine Rolle bei der zellulären Signalübertragung.
- Das Verständnis dieser Signalwege kann Einblicke in die zelluläre Funktion liefern.
- Frühere Methoden lieferten nur begrenzte Informationen über nachgeschaltete Effekte.
- Die Subscale-Kersher-Methode verbessert das Verständnis der Humanin-vermittelten Signalübertragung.
Zweck der Studie
- Untersuchung der durch mitochondriale Peptide aktivierten Signalwege.
- Bestimmung der Lokalisation von Phospho-Proteinen als Reaktion auf Stimulation.
- Vorstellung einer einfachen Methode zur Untersuchung dieser Effekte.
Verwendete Methoden
- Stimulation von SH-SY5Y- oder HEK293-Zellen mit mitochondrialen Peptiden.
- Beurteilung der downstream gerichteten Signaltransduktionskaskaden.
- Lokalisierungsstudien von Phosphoproteinen.
- Anwendung der Subskalen-Kersher-Methode zur verbesserten Analyse.
Hauptergebnisse
- Identifizierung zentraler Signalwege, die an der Antwort auf mitochondriale Peptide beteiligt sind.
- Einblicke in die Lokalisation von Phospho-Proteinen während der Signalübertragung.
- Validierung der Subscale-Kersher-Methode zur Untersuchung der Humanin-vermittelten Signaltransduktion.
- Entwicklung eines einfachen experimentellen Protokolls.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet eine klare Methode, um die Signalübertragung durch mitochondriale Peptide zu untersuchen.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Mitochondrienbiologie bei.
- Das Protokoll kann für weitere Forschungen auf diesem Gebiet genutzt werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht es Biopharma-F&E-Teams, die ERK-Aktivierung und die subzelluläre Lokalisation in Reaktion auf mitochondriale Peptide quantitativ zu bewerten und unterstützt so die Zielvalidierung und die mechanistische Entwederung von Risiken in der frühen Entdeckungsphase. Durch einen einfachen Aufreinigungsansatz, der mit der Western-Blot-Analyse kompatibel ist, erleichtert sie die Hypothesenprüfung von peptidvermittelten Signalwegen, die für neuroprotektive Effekte und Stoffwechselerkrankungen relevant sind. Der Ansatz erhöht das Vorhersagevertrauen bei der Untersuchung von Signalwegen, bevor Bemühungen zur Identifizierung von Leitstrukturen unternommen werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese einer Interaktion von mitochondrialen Peptiden mit den ERK-Signalwegen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch quantitative Messung von phosphoryliertem ERK in zytoplasmatischen, nukleären und mitochondrialen Fraktionen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem zelltypspezifische Signalantworten aufgedeckt werden, die zur mechanistischen Risikominimierung beitragen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte subzelluläre Fraktionen, die für die nachgeschaltete Western-Blot-Analyse von Phosphorylierungsereignissen geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Bietet ein einfaches, auf Eis durchgeführtes Protokoll, das eine konsistente Isolierung zytoplasmatischer, nukleärer und mitochondrialer Fraktionen gewährleistet.
- Möglichmachung von Screening: Bereitet validierte biologische Systeme für die zuverlässige Wirkstoffbewertung in phänotypischen Screening-Kaskaden vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Unterstützt die Untersuchung mitochondrienderivierter Peptide in Modellen zum neuroprotektiven Effekt und metabolischen Stress, die mit präklinischer Krankheitsrelevanz übereinstimmen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Beobachtungen aus der Entdeckungsphase zu Signalwegen mit präklinischer Validierung durch quantifizierbare Daten zur Lokalisation phosphorylierter Proteine.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem geklärt wird, ob die beobachtete ERK-Aktivierung in krankheitsrelevanten subzellulären Kompartimenten stattfindet.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Bewertung der Zielstrukturenbindung bis hin zur Aufklärung von Signalwegen ein und ermöglicht den Übergang von phänotypischen Treffern zu einem mechanistischen Verständnis, bevor die Optimierung der Leitsubstanzen erfolgt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Mechanismen mitochondrial abgeleiteter Peptide durch die Auflösung von ERK-Aktivierungsereignissen auf subzellulärer Ebene.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige Fraktionen mit quantitativen Phosphorylierungs-Nachweisen zur Vergleichbarkeit von Substanzeffekten.
- Analytik: Erzeugt Messungen der Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)-Aktivität, die Teams ermöglichen, Stimulationsbedingungen und Hemmereffekte zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet ERK-Lokalisierungsmuster mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Dominanz nukleärer gegenüber zytoplasmatischer Signalübertragung in relevanten Zellmodellen identifiziert.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Fraktionierungsplattform, die auf verschiedene mitochondrial abgeleitete Peptide und therapeutische Wirkstoffe über menschliche Humanin-Analoga hinaus anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung von Zielwegen, indem mechanistische Unklarheiten in der peptidvermittelten Signalübertragung verringert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht standardisierte, reproduzierbare Fraktionierung, die mit Western-Blot-Analysen innerhalb von Forschungsteams kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem ein frühzeitiges Absichern von mitochondrialen Zielstrukturen vor erheblichen Investitionen in die Leitstrukturentwicklung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Erleichtert die risikoadjustierte Priorisierung, indem produktive Signalaktivierung von artefaktbedingtem oder kompartimentenspezifischem Rauschen unterschieden wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Techniken der Subzellulären Fraktionierung und der Detektion von Phospho-Epitopen mittels Western Blot.
- Setzt den Zugang zu Zentrifugenausrüstung voraus, die eine präzise Steuerung der G-Kraft und der Temperatur für die Isolierung von Fraktionen ermöglicht.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Fraktionierungszeiten und der Verwendung von Protease- und Phosphatase-Inhibitoren, um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte umfassen die Optimierung für verschiedene Zelltypen sowie Peptidkonzentrationen, basierend auf Löslichkeits- und Stabilitätsprofilen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört das Risiko einer Kreuzkontamination zwischen den Fraktionen, falls die Waschschritte nicht streng eingehalten werden, wie im Protokoll beschrieben.
