Name: Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die subzelluläre Fraktionierung zur Analyse der ERK-Aktivierung nach Stimulation mit mitochondrialen Peptiden in SH-SY5Y- und HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Lokalisierung von Phosphoproteinen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program, SJK und ein Glenn Foundation Award und NIH vergibt an PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alle Autoren erscheinen im Film.

1. Peptid Behandlung Zellen <ol><li>Platte 2 Millionen SH-SY5Y oder HEK293 Zellen (2 x 10 6) in einem 10 cm-Speise- und wachsen sie für 2 Tage</li> <li>(Optional) den nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit serumfreien Dulbecco &#39; s geändert Medium (DMEM) Medien einmal Adler und inkubieren Sie mit Serum freie DMEM über Nacht, wenn die Behandlung im Serum freie Medien getan werden muss.</li>
	<li>Am 3. Tag, auflösen S14G-Humanin Peptide in 0,2 µm filtriert, destilliertes Wasser und rekonstruieren sie als Stammlösung 1mM. 
	Hinweis: Die Peptide sollte in dem entsprechenden Lösungsmittel aufgelöst werden, die durch die Sequenz Eigenschaften des Peptids (z. B. Gesamtladung) ermittelt werden und kann vom Hersteller bereitgestellt werden, wenn die Peptide im Handel erhältlich sind. Z. B. auflösen S14G-Humanin, SHLP2, und SHLP6 und MOTS-c in Wasser. Aliquoten die Peptide in einem entsprechenden Volumen (z. B. 50 μL) zu vermeiden, Einfrieren und Auftauen Zyklen. Einmal aufgetaut, verwenden Sie sie nicht wieder.</li>
	<li>Aliquot der vorgewärmten Serum-haltigen oder serumfreie Medien in ein 50 mL konische Rohr und fügen Sie Raumtemperatur 1 mM Stammlösung zu machen, in eine arbeiten-Konzentration (z.B., 1 µM, 10 µM).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Medien mit 6 mL Peptidlösung aus Schritt 1.4. und inkubieren Sie die Zellen für die entsprechende Menge an Zeit. 
	Hinweis: Wählen Sie die Inkubationszeit je nach Kondition die ERK aktiviert.</li>
</ol> 2. Subzellulären Fraktionierung Cytosol und Kern <ol><li>die Zellen zweimal mit 10 mL eiskaltem PBS waschen und kratzen Sie die Zellen aus der Platte in 5 mL eiskaltem PBS übertragen die Zellsuspension in ein 15 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellen bei 500 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren der PBS und wieder auszusetzen das Pellet in 200 µL eiskalt, Fraktionierung-Puffer (10 mM HEPES pH = 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5 % (V/V) Glycerin, 1 % nicht-ionische Tenside (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) (n), Protease/Phosphatase-Inhibitoren). 
	Hinweis: Um die Proteine in ihrem Phosphorylierung-Status zu halten, mal die Phosphatase-Inhibitor sowie Protease Inhibitor frisch angefügt werden soll und Proben sollten auf Eis überhaupt gehalten werden. Einfrieren und Auftauen Wiederholung Zyklen der Proben sollte vermieden werden. Aliquoten Proben in kleinen Betrag (z.B. 50 μg) vor dem Einfrieren sie bei-80 ° c</li>
	<li>Brüten wieder abgehängte Pellet für 15 min auf Eis und anschließend Zentrifugieren bei 250 X g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Den Überstand der zytoplasmatischen Bruch sammeln und halten Sie die Pellets für die nukleare Bruchteil.</li>
	<li>Zentrifugieren des Überstands um Zelltrümmer und andere Verunreinigungen bei 18.000 x g für 10 min bei 4 ° C zu entfernen und dann den Überstand zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Dies ist der Bruchteil Zytosol.</li>
	<li>Aufschwemmen das Pellet in 200 μL eiskaltem Waschpuffer (10 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (V/V) Glycerin, 0,2 mM EDTA, Protease/Phosphatase-Hemmer) und Zentrifuge bei 250 X g für 5 min bei 4 ° C</li>
	<li>Den Überstand zu entfernen und das Pellet in 100 μl eiskalt, nukleare Extraktionspuffer Aufschwemmen (20 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25 % (V/V) Glycerin, 0,2 mM EDTA, Protease/Phosphatase-Hemmer) und beschallen 10 Mal (5 s auf 10 s ab 30 % amp.) auf Ice</li>
	<li>Zentrifuge bei 18.000 x g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Den Überstand auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Dies ist die nukleare Bruchteil.</li>
	<li>QUANTIFY den Protein-Betrag mit einem BCA-Assay</li></ol>
 3. Rohöl mitochondrialen Fraktion <ol><li>der Zellen in jedem 10 cm Teller mit 10 mL eiskaltem PBS waschen, fügen Sie 5 mL eiskaltem PBS und lösen die Zellen mit einem Schaber Zelle. 
	Hinweis: Verwenden Sie drei 10 cm Gerichte von Zellen zu einer guten Ausbeute von Mitochondrien für Western Blotting.</li>
	<li>Die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Rohr übertragen und kombinieren alle aus drei 10 cm Gerichte in einem 15 ml konische Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellen bei 600 X g für 10 min bei 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren der PBS und wieder auszusetzen das Pellet in 1 mL eiskaltes Mitochondrien-Isolierung-Puffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM Saccharose, passen Sie auf pH = 7,4).</li>
	<li>Homogenisieren der Zellen mit 25 Schlägen von einer 2 mL-Homogenisator mit Polytetrafluorethylen beschichtet Stößel auf Ice 
	Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für die mitochondriale Integrität und maximieren die Ausbeute der mitochondrialen Fraktion. Die Anzahl der Schläge sollte für jeden Zelltyp optimiert werden. Der Homogenisator vor Beginn des Verfahrens PreCool.</li>
	<li>Übertragen die Homogenat zu einem Microcentrifuge Schlauch und 600 X g für 10 min bei 4 ° C, Kerne und ungebrochene Zellen entfernen zentrifugieren.</li>
	<li>Den Überstand zu sammeln, auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen und Zentrifugieren es 7.000 x g für 10 min bei 4 ° c 
	Hinweis: Das Pellet ist locker, den Überstand mit Sorgfalt sammeln und versuchen Sie nicht zu stören das Pellet.</li>
	<li>Überstand entfernen, erneut aussetzen das Pellet mit 200 μL der eiskalte Mitochondrien Isolierung Puffer und die Lösung zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 7.000 x g für 10 min bei 4 ° c</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.8 das Pellet zu waschen. Es ist nicht notwendig, einen neuen Microcentrifuge Schlauch in diesem Schritt des Überstands übertragen.</li>
	<li>Das gewaschene Pellet überstand entnehmen und wieder auszusetzen das Pellet mit Mitochondrien mit 50 μL der RIPA Puffer.</li>
	<li>Inkubation der Aussetzung auf Eis für 10 min.</li>
	<li>Zentrifugieren die Aussetzung bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
	<li>Den Überstand auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch übertragen. Dies ist die mitochondriale Bruchteil.</li>
	<li>Quantifizieren den Protein-Betrag mit einem BCA-Assay.</li>
</ol> 4. Western Blot-Phospho-spezifische Proteine <ol><li>führen ein SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (8-16 % vorgefertigten Gel) und übertragen Sie das Protein mit einer PVDF Membran 4.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit 5 % BSA in TBST (0,1 % Polysorbat 20) für 30 min bei Raumtemperatur Hintergrund unspezifischen Bindungsstellen blockieren. 
	Hinweis: Für die Erkennung von phosphorylierten Proteine blockieren Sie die Membran mit BSA keine Milch. Milch enthält Kasein, eine reichlich Phosphoprotein, führt zu hohen unspezifische Signal.</li>
	<li>Die Membran mit dem primären Antikörper (Anti-Phospho-ERK1/2) bei 4 ° C über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Am nächsten Tag, waschen Sie die Membran mit TBST (0,1 % Polysorbat 20) dreimal für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Membran mit sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen-HRP) für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Die Membran mit TBST waschen (0,1 % Polysorbat 20) dreimal für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit ECL-Lösung und die Membran im Image Analyzer Bild.</li>
	<li>Streifen der Membran mit stripping Puffer für 15 min bei Raumtemperatur und waschen die Membran mit TBST drei Mal für 5 min.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.7 mit dem Anti-insgesamt ERK1/2 Antikörper.</li>
	<li>Um die Reinheit der einzelnen Fraktionen zu überprüfen, führen Sie SDS-PAGE und führen Immunoblots mit Antikörpern erkennen Marker für jedes Fach (z.B. Lamin B1 für Kern, GAPDH für Zytosol und TOM20 für Mitochondrien).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen ist Gesellschafter und Berater für CohBar, Inc. Kelvin Yen diente als Berater für CohBar, Inc.

Hier haben wir bewiesen, dass Humanin Peptid-vermittelten ERK1/2 Aktivierung in zwei verschiedenen Zelltypen tritt und die subzelluläre Lokalisation des aktivierten ERK1/2, je nach Bedingungen (z.B., Portion Peptid, Zeitpunkt und Zelle abweichen kann Typ). Es hat sich gezeigt, dass Humanin Signale durch zwei verschiedene Rezeptoren22,23, die die Unterschiede bei der Signalisierung zwischen den beiden Zelllinien sowie die Forderung nach verschiedenen Dosi...

Neue Studien zeigen, dass Mitochondrien-abgeleitete Peptide (MDPs) in Cytoprotection und Stoffwechsel1,2,3eine wichtige Rolle spielen. Verständnis der Signalweg Transduktion in Anwesenheit von MDPs gibt uns Einblick in den Mechanismus, durch den MDPs verschiedene Funktionen modulieren. Die erste identifizierte MDP, Humanin, wurde gezeigt, dass extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1/2 (ERK1/2) erhöhen Phosphorylierung durch seinen Rezeptor binden4,5. Die nachgeschaltete Wirkung von ERK1/2 Aktivierung ist jedoch immer noch unentdecktes.
Die Kaskade ERK1/2 dient als ein wesentlicher Vermittler in einer Vielzahl von zellulären Prozessen einschließlich Proliferation, Zellmigration, Zellstoffwechsel, überleben und Apoptose6,7,8. Um alle zu orchestrieren sind diese unterschiedliche zelluläre Prozesse, die Aktivität und subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 durch Phosphatasen und Gerüst Proteine9,10streng reguliert. Neben Post-translationale Modifikation regelt dynamische pendelt von ERK1/2 auch die Signalisierung Funktion, Bewegung und Spezifität11,-12. ERK1/2 ist in erster Linie in der Zellflüssigkeit13lokalisiert. Eine Reihe von Ankern und Gerüst Proteine helfen ERK1/2 im Zellskelett Elemente auf der Oberfläche der Organellen oder diffuse im Zytoplasma13beibehalten. Nach Stimulation ERK1/2 ist phosphoryliert und wird aus seiner Verankerung Proteine dissoziiert, so dass die Translokation von ERK1/2 zu anderen subzelluläre Kompartimente, einschließlich der Zellkern, Mitochondrien, Golgi und Lysosomen14, 15 , 16.
Humanin ist zwar bekannt, die ERK1/2 Signalweg aktivieren, wird die Aktivierung von ERK1/2 nur in der Ergebniszelle Lysates beobachtet. Wie zuvor beschrieben, da ERK1/2 subzelluläre Lokalisation eine entscheidende Rolle für die nachgeschaltete Wirkung, die Analyse der subzellulären Lokalisierung und der gesamten spielt ist phosphorylierten ERK1/2 notwendig, ein umfassendes Verständnis der Humanin-induzierten ERK1/2 Aktivierung und die Aktivierung der nachgeschalteten Ziele.
Um das Ziel Organellen der aktivierten ERK1/2 zu verstehen, wurde subzellulären Fraktionierung gefolgt von westlichen beflecken für phosphorylierten ERK1/2 durchgeführt. Diese Methode kann leicht implementiert werden, da es standard Laborgeräten und Reagenzien verwendet. Die isolierten subzelluläre Kompartimente sind von hoher Reinheit, sodass die Ergebnisse unkompliziert auszulegen. Immunostaining ERK1/2 kann zu ähnliche Ergebnissen führen. Allerdings sind bestimmte subzelluläre Kompartimente relativ schwer zu visualisieren und erfordern besondere Fixierung und Permeabilisierung Methoden. ERK1/2 Ebenen subzelluläre Kompartimente sind unterschiedlich, und diese Variante könnte dazu führen, dass falsch positive und falsch negative Signale bei der Betrachtung der gesamten Zelle Lysates. Daher gibt ein Immunoblot mit isolierten subzelluläre Kompartimente uns ein besseres Verständnis der ERK1/2 Lokalisierung.
Die Vielseitigkeit der Methode ermöglicht Änderungen des Protokolls zum anderen Stimulanzien, einschließlich andere MDPs oder Translokation der andere Signalmoleküle wie STAT3 auswirkt. Vor kurzem sind entdeckten kleinen Humanin-wie Peptide (SHLPs) von 16 s rRNA Region codiert, wo Humanin codiert, und sie haben ähnliche aber unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu HN17. Z. B. aktivieren SHLP2 und SHLP3 ERK1/2 nach 8 h obwohl Humanin ERK1/2 innerhalb von 5 min. Prüfungs-subzelluläre Lokalisation der ERK1/2 als Reaktion auf unterschiedliche Peptiden aktiviert uns ein besseres Verständnis für die Biologie dieser Peptide geben wird. Anzeichen dafür zeigte, dass die subzelluläre Lokalisation der Signalmoleküle in deren nachgelagerten Auswirkungen eine entscheidende Rolle spielt. Zum Beispiel STAT3 ist traditionell bekannt, vor allem in der Zellflüssigkeit in ruhende Zellen lokalisiert werden, und dann translocates es in den Zellkern, Genexpression in Reaktion auf Zytokine18zu aktivieren. STAT3 auch translocates zu Mitochondrien und regelt die TCA-Zyklus und ATP Produktion19. Zur Regelung der Autophagie moduliert verschiedene subzelluläre Lokalisation des STAT3 Autophagie in verschiedenen Weisen20. Z. B. nuklearen STAT3 transcriptionally Autophagie-Genen reguliert und fungiert als ein Autophagie-Modulator. Zytoplasmatischen STAT3 hemmt konstitutiv Autophagie durch Interaktion mit Autophagie Signalmoleküle. Mitochondriale STAT3 hemmt und verhindert Mitophagy durch oxidativen Stress induzierten Autophagie zu unterdrücken. Daher ist diese subzelluläre Fach Isolationsmethode entscheidend für das Verständnis der Rolle der anderen Signalisierung Moleküle sowie ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9102</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4370</td><td>Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>Lamin B1</td><td>Zellsignalisierung</td><td>12586</td><td>Kernmarker, Verdünnung 1:1.000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Zellsignalisierung</td><td>5174</td><td>Zytoplasmatischer Marker, Verdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-17764</td><td>Mitochondrienmarker, Verdünnung 1:2.000</td></tr><tr><td>anti-Kaninchen-HRP konjugierte</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7074</td><td>Verdünnung 1:30.000</td></tr><tr><td>RIPA Lyse- und Extraktionspuffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Kulturschale</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG-Peptid</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Spritzenfilter</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td></td><td>Sigma M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>ThermoFisher</td><td>SCIENTIFIC BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&Handel; Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stößel Tissue-Grinder-Baugruppen mit glatten Stößeln</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX Vorgefertigte Proteingele</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Modul</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Puffer</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

subzellulären fraktionierung für erk-aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet peptid-behandlung

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Mitochondriale-abgeleitete Peptide (MDPs) sind eine neue Klasse von Peptiden, die durch kleine offene Lesung Rahmen in anderen bekannten Genen des mitochondrialen Genoms kodiert sind. MDPs haben eine Vielzahl von biologischen Wirkungen wie Neuronen vor Apoptose zu schützen, Verbesserung der Stoffwechselmarker und schützt Zellen vor Chemotherapie. Humanin war der erste MDP, entdeckt zu werden und ist die am meisten untersuchte Peptid unter der MDP-Familie. Die Membranrezeptoren und nachgeschaltete Signalwege der Humanin wurden sorgfältig charakterisiert. Zusätzliche MDPs wie MOTS-c und SHLP1-6 haben vor kurzem entdeckt und die Signalisierung Mechanismen müssen noch geklärt werden. Hier beschreiben wir eine Zelle Kultur, die Methode, um die Funktion dieser Peptide bestimmen. Insbesondere erlauben Zelle Fraktionierung Techniken in Kombination mit westlichen beflecken für die quantitative Bestimmung der Aktivierung und Translokation von wichtiges Signalmolekül. Zwar gibt es andere Methoden der Zelle Fraktionierung, ist wie hier beschrieben eine einfache und unkomplizierte Methode. Diese Methoden können verwendet werden, den Wirkmechanismus dieser Peptide und andere Therapeutika weiter aufzuklären.

Bei der hier vorgestellten Verfahren behandelten wir HEK293 und SH-SY5Y Zellen mit 1 μm und 100 μm S14G-Humanin, ein potenter Humanin analoge21, jeweils in komplette Medien für die angegebenen Zeiträume (Abbildung 1A , Abbildung 1 B). wir dann total und phosphorylierten Form von ERK1/2 am Thr202/Tyr204 Gesamt-Protein Extrakte untersucht. S14G-Humanin...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Zellen mit mitochondrialen-abgeleitete Peptide stimulieren und die Signalisierung Kaskade und Lokalisierung von Phospho-Proteine zu beurteilen.

Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die nachgeschaltete Signalkaskade zu identifizieren, die an Zellen beteiligt ist, die mit mitochondrialen Peptiden stimuliert wurden. Diese Methode kann wichtige Fragen im Bereich der mitochondrialen Peptide beantworten, z. B. welche Signalwege beteiligt sind und wo dies geschieht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie unkompliziert und relativ einfach durchzuführen ist.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir den Humanin-vermittelten ERK-Signalweg untersuchten, der uns nur begrenzte Informationen über die nachgelagerten Fakten lieferte. Die Subscale-Kersher-Methode gab uns eine bessere Vorstellung von der Rolle der Humanin-vermittelten Signalübertragung. Am dritten Tag nach dem Plattieren und Waschen zweimal zehn bis zum sechsten, SH-SY5Y oder HEK293 Zellen gemäß dem Textprotokoll.Lösen Sie S14G-Humanin-Peptide in nullkommafiltriertem, zwei Mikron gefiltertem destilliertem Wasser auf. Und konstituieren Sie sie als eine einmillimolare Stammlösung. Aliquotieren Sie das vorgewärmte serumhaltige oder serumfreie Medium in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie eine Humanin-Peptid-Stammlösung bei Raumtemperatur hinzu, um eine Arbeitskonzentration zu erhalten.Ersetzen Sie sofort das Medium in den Zellen durch sechs Milliliter der Peptidlösung. Und inkubieren Sie die Zellen für die entsprechende Zeitspanne. Verwenden Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.Dann kratzen Sie die Zellen in fünf Millilitern eiskaltem PBS von der Platte. Und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G und vier Grad Celsius.Das Pellet in 200 Mikrolitern eiskaltem Fraktionierungspuffer erneut suspendieren und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 mal G und vier Grad Celsius. Sammeln Sie dann den Überstand als zytoplasmatische Fraktion und bewahren Sie das Pellet für die Kernfraktion auf.Zentrifugieren Sie den Überstand, um Zelltrümmer und andere Verunreinigungen zu entfernen, bei 18000 mal G und vier Grad Celsius für zehn Minuten. Und dann überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist die Cytisolfraktion.Suspendieren Sie das Pellet erneut in 200 Mikrolitern eiskaltem Waschpuffer und zentrifugieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 250 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand und verwenden Sie 100 Mikroliter eiskalten nuklearen Extraktionspuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Dann beschallen Sie die Probe 10 Mal auf Eis.Zentrifugieren Sie die Probe erneut. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Um die rohe mitochondriale Fraktion zu isolieren, verwenden Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS, um die Zellen in jeder 10-Zentimeter-Schale zu waschen.Fügen Sie dann fünf Milliliter eiskaltes PBS hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Aspirieren Sie das PBS und verwenden Sie einen Milliliter eiskalten mitochondrialen Isolationspuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Homogenisieren Sie dann mit einem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Stößel auf Eis die Zellen mit 25 Hüben eines Zwei-Milliliter-Homogenisators. Übertragen Sie das Homogenat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 600 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellkerne und unzerbrochenen Zellen zu entfernen.Sammeln Sie dann den Überstand, geben Sie ihn in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Lösung bei 7000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Pellet erneut mit 200 Mikrolitern eiskaltem Mitochondrien-Isolationspuffer und überführen Sie die Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 7000 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Verwenden Sie nach dem Waschen 15 Mikroliter RIPA-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 16000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie den Überstand, bei dem es sich um die mitochondriale Fraktion handelt, in ein neues Röhrchen.Quantifizieren und führen Sie Western Blotting gemäß dem Textprotokoll durch. Unter Verwendung des in diesem Video gezeigten Verfahrens wurden HEK293- und SH-SY5Y-Zellen mit einem und 100 mikromolaren S14 G Humanin, einem potenten Humanin-Analogon, zurückgebildet. Und die Gesamt- und phosphorylierte Form von ERK12 an Theanin 202, Tyrosin 204 aus Gesamtproteinextrakten wurden analysiert.Wie hier zu sehen ist, zeigte die Behandlung mit S14G Humanin eine Zunahme der Phosphorylierung von ERK12 und seiner regulatorischen Theanin-202-Tyrosin-204-Stelle. Um das Ziel der S14G-Humanin-vermittelten ERK12-Aktivierung zu verstehen, wurde die subzelluläre Lokalisation von gesamtem und phosphoryliertem ERK12 nach S14G-Humanin-Behandlung analysiert. Wie in diesen Western Blots gezeigt, stieg in HEK293-Zellen das phosphorylierte ERK sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern an, nicht jedoch in den Mitochondrien.In SH-SY5Y-Zellen nahm die phosphorylierte ERK jedoch im Zytoplasmakern und in den Mitochondrien ab. Dies deutet darauf hin, dass die S14G-Humanin-vermittelte ERK-Phosphorylierung bei verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen Bedingungen eine unterschiedliche Rolle spielen kann. Einmal gemeistert, kann die Zellkernfraktionierung in einer Stunde und die mitochondriale Fraktionierung in einer Stunde und 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben auf Eis zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie co-immunale Fällung und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um die nachgeschalteten Ziele der Signalmoleküle zu verstehen.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie der mitochondrialen Atmungskette Komplexe von humanen embryonalen Stammzellen analysiert werden mit in Gel-Aktivitäts-Assays werden.

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Der Vergleich des mitochondrialen Membranpotentials zwischen Proben liefert wertvolle Informationen über den zellulären Status. Detaillierte Schritte zur Isolierung von Mitochondrien und zur Beurteilung des Ansprechens auf Inhibitoren und Entkoppler mittels Fluoreszenz werden beschrieben. Die Methode und der Nutzen dieses Protokolls werden anhand eines Zellkultur- und Tiermodells für zellulären Stress veranschaulicht.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Hier skizzieren wir, wie man die mitochondriale Lokalisation einer (Zellzyklus-)Kinase untersucht und wie man ihre submitochondriale Position sowie potenzielle mitochondriale Substrate/Ziele bestimmt. Die erzwungene Expression von Proteinen in die Mitochondrien stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die funktionellen Konsequenzen der mitochondrialen Lokalisierung eines Proteins von Interesse zu untersuchen.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Trotz der jüngsten Fortschritte bleiben viele mitochondriale Hefeproteine mit ihren Funktionen völlig unbekannt. Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung der submitochondrialen Lokalisation von Proteinen, die für die Aufklärung ihrer molekularen Funktionen von grundlegender Bedeutung war.

Beurteilung der Submitochondrialen Proteinlokalisation in angehender Hefe Saccharomyces cerevisiae

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

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RASopathien sind multisystemische genetische Syndrome, die durch eine Hyperaktivierung des RAS-MAPK-Signalwegs verursacht werden. Potenziell pathogene Varianten, die auf ihre Validierung warten, treten kontinuierlich auf, während schlechte präklinische Evidenz die Therapie einschränkt. Hier beschreiben wir unser in vivo-Protokoll zum Testen und Kreuzvalidieren von RASopathie-assoziierten ERK-Aktivierungsniveaus und ihrer pharmakologischen Modulation während der Embryogenese durch...

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

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Subzellulären Fraktionierung für ERK-Aktivierung bei der mitochondrialen abgeleitet Peptid-Behandlung

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