Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine effektive Methode zur Dezellularisierung und Entkalkung von Maus-Cochleae zu demonstrieren, um ein Gerüst für Innenohr-Tissue-Engineering-Anwendungen zu verwenden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hör- und Gewebezüchtung zu beantworten, wie z. B. wie die 3D-Cochlea und verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix die Stammzelldifferenzierung beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Forscher ermöglicht zu untersuchen, wie Zellen direkt mit der extrazellulären Matrix der Cochlea interagieren, um sensorisches Epithel zu bilden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Schläfenknochenisolierung und den Zellprofusionsapparat allein auf der Grundlage von Textbeschreibungen korrekt zu visualisieren. Um diesen Eingriff zu beginnen, halbieren Sie den Schädel in der mittleren Sagittalebene mit einer scharfen chirurgischen Schere. Entfernen Sie als Nächstes das Hirngewebe aus dem Schädel.

Identifizieren Sie dann das Schläfenbein durch das Vorhandensein der auditorischen und vestibulären Nervenwurzeln auf der Innenseite des Schädels und des Gehörgangs von außen. Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel, um das Schläfenbein vom Rest des Schädels zu isolieren. Führen Sie anschließend die feine Pinzette etwa fünf Millimeter in die Öffnung des Gehörgangs ein, damit die Spitzen nicht Gefahr laufen, die Cochlea zu durchstechen.

Brechen Sie den Knochen der Bola vorsichtig auf, so dass er bricht. Hebeln Sie mit einer feinen Pinzette den Rest der Bola vom Schläfenbein ab und legen Sie das knöcherne Labyrinth der Cochlea frei. Tauchen Sie anschließend das Schläfenbein in PBS mit den ovalen und runden Fenstern der Cochlea nach oben ein.

Entfernen Sie mit einer ultrafeinen Pinzette die Steigbügelarterie, die durch den Steigbügel verläuft. Führen Sie dann eine Spitze der ultrafeinen Pinzette durch den Steigbügelbogen ein, durch den die Arterie verläuft, und heben Sie den Steigbügel vorsichtig nach oben. Anschließend die ovalen und runden Fenster durchstechen.

Positionieren Sie anschließend den Schlauch, der mit einer PBS-gefüllten 28,5-Gauge-Spritze verbunden ist, über dem ovalen Fenster. Geben Sie zwei Millimeter 10% Antibiotikum-Atimykotika und 10% Penicillin-Streptomycin in PBS über fünf Minuten durch die Cochlea, um die Perilymphe zu entfernen. Entfernen und entsorgen Sie dann verbleibendes Muskelgewebe und Knochenfragmente.

Für die Dezellularisierung wird die Cochlea mit der Transferpipette vorsichtig nach oben in die Pipette gezogen, so dass sie nur wenige Millimeter über die abgeschnittene Kante hinausgeht. Stoßen Sie anschließend die Cochlea in das mit 1%SDS-Lösung gefüllte Szintillationsfläschchen aus. Zirkulieren Sie zwei Milliliter 1 %SDS in entionisiertem Wasser mit einer Transferpipette durch die Cochlea im Szintillationsfläschchen.

Stellen Sie das Szintillationsfläschchen in einen Rotator und lassen Sie es 72 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 10 U/min rotieren. Ersetzen Sie die Lösung über einen Zeitraum von 72 Stunden alle 24 Stunden durch eine frische 1%ige SDS-Lösung und achten Sie darauf, die Cochlea während des Lösungswechsels nicht der Luft auszusetzen. Waschen Sie danach die Cochlea dreimal im selben Szintillationsfläschchen für jeweils 30 Minuten in VE-Wasser.

In diesem Stadium sollte die Cochlea dezellularisiert werden. Entfernen Sie zur Entkalkung das restliche DI-Wasser aus dem Szintillationsfläschchen, so dass gerade so viel übrig bleibt, dass die Cochlea untergetaucht bleibt. Um mit der Entkalkung zu beginnen, geben Sie fünf Milliliter 10%iges EDTA- und DI-Wasser in das Szintillationsfläschchen mit der Cochlea.

Zirkulieren Sie zwei Milliliter 10 % EDTA in deionisiertem Wasser mit einer Transferpipette durch die Cochlea im Szintillationsfläschchen. Setzen Sie das Szintillationsfläschchen wieder in den Rotator ein und lassen Sie das Szintillationsfläschchen 72 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 10 U/min rotieren. Wechseln Sie die 10%ige EDTA-Lösung alle 24 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden.

Achten Sie beim Wechseln der Lösungen darauf, dass die Cochlea nicht der Luft ausgesetzt ist. Spülen Sie dann die Cochlea dreimal für jeweils zwei Stunden mit PBS aus. In diesem Stadium sollte die Cochlea entkalkt werden.

Beginnen Sie vor der Infusion der Zellen mit der Inkubation von dezellurierten und entkalkten Cochlea in einem 5%igen Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator mit 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Um die Cochleae zu überschwemmen, geben Sie als nächstes einen Tropfen MSCGM in jede Cochlea, um ein Austrocknen der Cochlea zu verhindern. Übertragen Sie sie mit einer Transferpipette auf eine neue 24-Well-Platte.

Richten Sie die Cochlea mit einer ultrafeinen Pinzette vorsichtig aus, so dass die ovalen und runden Fenster nach oben zeigen. Entnehmen Sie dann mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulinspritze mit angeschlossenem Schlauch 0,2 Milliliter resuspendierter humaner Wharton-Geleezellen. Positionieren Sie anschließend den Schlauch mit einer sterilisierten Feinzange über dem ovalen Fenster.

Füllen Sie die Cochlea sanft und langsam über einen Zeitraum von fünf Minuten mit 0,2 Millilitern resuspendierten menschlichen Wharton-Geleezellen. Dieser Schritt der Fülle ist wichtig. Die erfolgreiche Flüssigkeitszufuhr durch die Cochlea hat einen großen Einfluss auf das Ergebnis dieses Protokolls.

Geben Sie nach dem Aufgießen 0,8 Milliliter 37 Grad Celsius vorgewärmtes MSCGM in die Vertiefung mit Cochlea, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Cochlea. Jedes Mal mit einer frischen Spritze und einem Schlauch.

Legen Sie die stark empfundene Cochlea in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium dreimal pro Woche. Hier ist die erfolgreiche Dezellularisierung und Entkalkung einer Maus-Cochlea ohne injizierte Zellen zu sehen. Insgesamt ist die Anatomie der Cochlea erhalten, wobei Hohlräume ohne feuchte Verfärbungen zurückbleiben.

Hier sind die repräsentativen Ergebnisse von erfolgreich kultivierten Geleezellen von Human Wharton auf einem Cochlea-Gerüst. Reichlich Feuchtfärbung ist in der gesamten Cochlea und auf der äußeren knöchernen Oberfläche zu beobachten. Eine genauere Untersuchung der einzelnen Windungen zeigt, dass feine Cochlea-Strukturen nach der Dezellularisierung und Entkalkung erhalten bleiben und dass injizierte Zellen an die native extrazelluläre Cochlea-Matrix gebunden sind und/oder mit ihr interagieren.

Auch die Dezellularisierung in nachfolgenden Zellkulturen wurde mittels H&E-Färbung untersucht. Die dezellularisierte Cochlea enthielt keine der Zellen der nativen Cochlea, behält aber den größten Teil der Anatomie des Corti-Organs bei, da die extrazelluläre Matrix erhalten bleibt. Bei der Injektion in kultivierte Zellen kann beobachtet werden, dass sie durch das Corti-Organ mit der dezellularisierten extrazellulären Matrix interagiert.

Einmal gemeistert, kann die Fülle der Zellen in eine dezellularisierte Cochlea etwa 10 bis 15 Minuten dauern, wenn die Cochlea bereits vorbereitet ist und die erforderlichen Werkzeuge entsprechend ausgelegt sind. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, die Cochlea vorsichtig zu behandeln, da sie zerbrechlich ist. Es ist auch wichtig, das Eindringen von Luft in die Cochlea zu vermeiden, da Blasen den Flüssigkeitsfluss während des Überflusses blockieren.

Dieses allgemeine Verfahren kann auf Cochleae anderer Spezies angewendet werden, und es kann auch eine Vielzahl von Zelltypen injiziert werden. Die spezifischen Dezellularisierungs- und Entkalkungszeiten werden wahrscheinlich variieren, aber die zugrunde liegenden Konzepte werden die gleichen bleiben. Dr. Peter Santi von der University of Minnesota entwickelte ursprünglich die Dezellularisierungstechnik, die wir für dieses Protokoll modifiziert haben.

Wir hoffen, unsere Technik und Zellkultur auf Cochlea-Gerüsten anderen Tissue Engineers zur Verfügung stellen zu können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Schläfenknochen erfolgreich isolieren, dezellularisieren und entkalken können, bevor Zellen für die Verwendung in Kulturexperimenten injiziert werden.