Name: Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Dezellularisierung und Entkalkung von Mäusecochleae für Tissue-Engineering-Anwendungen am Innenohr. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen.

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Das aktuelle Projekt wurde von der University of Kansas Beweis des Konzept-Fonds finanziert. Wir möchte das Pflegepersonal an KUMC (Kansas City, KS) unterstützen uns bei der Beschaffung von menschlichen Nabelschnur und David Jorgensen mit Cochleae Kulturen zu unterstützen.

Alle Verfahren, einschließlich tierischen Euthanasie wurden entsprechend dem genehmigten institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Protokoll (ACUP #2014-2234) an der University of Kansas Medical Center (KUMC) durchgeführt.
Hinweis: HWJCs wurden isoliert von menschlichen Nabelschnur, die von den Patienten gespendet wurden, die Einwilligung zur Verfügung gestellt und Proben dienten im Einklang mit den Protokollen von der University of Kansas menschlichen Themen Ausschuss (KU-IRB #15402) genehmigt.
1. Felsenbein Ernte und Cochlea-Isolation
<ol>
	<li>Enthaupten Sie eine entsprechend euthanasierten, 15 Wochen alten Maus durch Schneiden zwischen dem Schädel und dem ersten Halswirbel mit einem scharfen chirurgische Schere zu, dann sprühen Sie den Kopf mit 70 % Ethanol (Abbildung 1A) zu desinfizieren.</li>
	<li>Halbieren Sie den Schädel in einer Mitte-sagittale Ebene mit den gleichen scharfen chirurgische Schere (Abbildung 1 b-C, gestrichelte Linien).</li>
	<li>Entfernen Sie das Hirngewebe aus dem Schädel mit einer Zange (Abb. 1, Pfeil).</li>
	<li>Identifizieren des Schläfenbeins durch die Anwesenheit des auditorischen und Vestibular Nervenwurzeln (Abb. 1E-F, Pfeilspitzen) auf der Innenseite des Schädels und der Gehörgang von außen (Abb. 1F, Pfeil). Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel des Schläfenbeins vom Rest des Schädels (Abbildung 1) zu isolieren. Hinweis: In einigen Fällen kann es zart hebeln die umliegenden Knochen des Schädels vom Temporal Knochen ohne Schneiden möglich.</li>
	<li>Einfügen der feinen Zange in die Öffnung des Gehörgangs ca. 5 mm (Abbildung 1 H), so dass die Spitzen nicht riskieren Durchbohrung der Cochlea. Sanft aufbrechen die Knochen von Pufels (Abbildung 1 H, Top rot schraffierte Fläche) so dass es Frakturen (Abbildung 1I, rote gepunktete Linie). Hinweis: Bei Bedarf kann eine Dissektion Mikroskop dabei Hilfe für präzise Positionierung und Handhabung der Instrumente zu gewährleisten.</li>
	<li>Mit feinen Pinzette, Hebeln Sie entfernt den Rest der Bulla aus dem Felsenbein, Freilegung der knöchernen Labyrinths der Cochlea (Abbildung 1J, roten Klammern).</li>
	<li>Legen Sie eine Petrischale groß genug für das Felsenbein (z.B., 30 mm oder größer) unter dem sezieren Umfang Sichtfeld und füllen es mit genügend Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zur Deckung des Schläfenbeins (z.B. 0,5 bis 1 mL).</li>
	<li>Tauchen Sie das Felsenbein mit der Bulla in PBS mit ovalen und runden Fenster der Cochlea nach oben entfernt. Hinweis: Entfernen des vestibulären Systems aus der Cochlea ist nicht notwendig, da das vestibuläre System auch als Griff dient für Manipulation und Funktionen der Cochlea (Abbildung 1I und Abbildung 2 b) orientieren.</li>
	<li>Mit einer ultra-feine Pinzette, entfernen Sie die stapedial Arterie, die durch den Steigbügel führt.</li>
	<li>Legen Sie eine Spitze der ultrafeinen Zange durch den Bogen von den Steigbügel, wo die Arterie durchlaufen, und zart heben Sie die Steigbügel nach oben. Die Sauropoden Steigbügel sollten deaktivieren des ovalen Fensters aufheben.</li>
	<li>Mit einer Spitze der ultra-feine Zange, Punktion des Ovals und Runde Fenster.</li>
	<li>Gefüllt mit einer 1 X PBS 28,5-Gauge-Spritze mit Schlauch (Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) befestigt, positionieren Sie den Schlauch über das ovale Fenster (Abbildung 2A -B). Hinweis: Die Öffnung des Röhrchens manipuliert werden kann mit ultra-feinen Pinzette helfen, die um genaue Platzierung zu gewährleisten.<ol>
		<li>Verwenden Sie frische Spritze und Schläuche für jede Cochlea.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundieren Sie 2 mL 10 % Antibiotikum Antimykotikums (Anti-Anti) und 10 % Penicillin-Streptomycin (Stift-Strep) mit PBS-Puffer durch die Cochlea über 5 min die Perilymphe zu entfernen. Zu schnell mit zu viel Druck Vorrichtung beschädigen die feinen Strukturen in der Cochlea. Hinweis: Manuell fahren die Spritze von hand um die Flüssigkeit durch die Cochlea durchspülen ist wirksam, obwohl eine Perfusion Pumpe als Alternative verwendet werden könnte.<ol>
		<li>Verwenden Sie manuelle Vorrichtung, ein paar feine, selbstschließende Pinzette zur Stabilisierung der Cochlea (Abbildung 2A) während der Perfusion durch das Greifen des vestibulären Teils des Schläfenbeins. Hinweis: Obwohl nicht erforderlich, dies lässt beide Hände frei, Instrumente zu behandeln; Einerseits kann die Spritze (Abbildung 2A) fahren, während die andere den Schlauch positionieren kann entsprechend (Abb. 2 b).</li>
		<li>Von diesem Schritt vorwärts, kümmern uns um die Cochlea unnötig an der Luft auszusetzen zu vermeiden. Einführung von Luftblasen in die fließende Räume Flüssigkeitszirkulation blockiert, und weitere Austrocknen die feinen Strukturen in der Cochlea beschädigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Entfernen Sie und entsorgen Sie alle restlichen Muskel und Knochen Fragmente mit feinen Pinzette.</li>
	<li>Gegebenenfalls speichern Sie isolierten Cochleae bei 4 ° C in Anti-Anti 10 % und 10 % Stift-Strep Lösung mit PBS-Puffer für bis zu sieben Tage mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung alle 48 h.</li>
</ol>
(2) Cochlea-Verarbeitung
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>Für jede Cochlea füllen ein 20-mL-Glas funkeln Fläschchen mit einer 1 % Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) Lösung in deionisiertes (DI) Wasser, das verwendet wird, um decellularize die Cochlea.</li>
		<li>Schneiden Sie die Spitze weg von einem Kunststoff 7 mL Transferpipette mit einer Rasierklinge, so dass die Öffnung groß genug für ein Cochlea ist passieren.</li>
		<li>Mit der Transferpipette, sanft Aufstellen der Cochlea in die Pipette also es nur die Cut-off Rand um wenige Millimeter geht.</li>
		<li>Die Cochlea in 1 % SDS-Lösung gefüllt funkeln Fläschchen zu vertreiben.</li>
		<li>Zirkulieren Sie 2 mL 1 % SDS deionisiertes (DI) Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in ein Rotator und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren.<ol>
			<li>1 % SDS-Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 Stunden zu ändern. Vorsicht beim SDS um der Cochlea an die Luft setzen Sie niemals ändern.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Die Cochlea dreimal für jeweils 30 min. mit VE-Wasser zu waschen.</li></ol></li></ol>Führen Sie Waschungen in dem gleichen funkeln Vial verwendet für die SDS-Gebühren; in diesem Stadium ist die Cochlea decellularized.
	
	
	<li>Entkalkung
	<ol>
		<li>Entfernen des Restwassers DI aus der Durchstechflasche funkeln, verlassen gerade genug, um die Cochlea eingetaucht.</li>
		<li>Fügen Sie Entkalkung zunächst 5 mL 10 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (0,02 M) in VE-Wasser, das Funkeln-Fläschchen mit der Cochlea.</li>
		<li>Zirkulieren Sie 2 mL 10 % EDTA DI Wasser durch die Cochlea im Funkeln Fläschchen mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Das Funkeln Fläschchen zurück in den Rotator, und ermöglichen Sie das Funkeln Fläschchen mit 10 u/min für 72 h bei Raumtemperatur rotieren. Wechseln Sie die 10 % EDTA Lösung alle 24 h über einen Zeitraum von 72 h. Vorsicht beim Lösungen zu ändern, so dass die Schnecke nicht Luft ausgesetzt ist.</li>
		<li>Spülen Sie die Cochlea 3 Mal für jeweils 2 h mit 1 X PBS; in diesem Stadium ist die Cochlea entkalkt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lagerung
	<ol>
		<li>Speichern der Cochleae für bis zu 72 h in einer 10 % Anti-Anti, 10 % Feder-Strep Lösung mit PBS-Puffer bei 4 ° c Hinweis: Längere Lagerung können mit regelmäßigen Änderungen antibiotische Lösung möglich sein; längere Lagerung von verarbeiteten Cochleae wurde jedoch nicht in diesem Protokoll validiert.</li>
	</ol>
	</li>

3. Beschaffung und den Ausbau der hWJCs
<ol>
	<li>HWJCs nach zuvor veröffentlichten Protokolle22zu isolieren. Kurz, Segment Nabelschnüre in 3-cm-Abschnitte.</li>
	<li>Machen Sie sorgfältig einen flachen Schnitt mit einem Skalpell auf jedem Segment der Nabelschnur zu entrollen und setzen die Wharton Gelee von der Nabelschnur in Längsrichtung. Verwenden Sie Zange um die Blutgefäße zu entfernen.</li>
	<li>Waschen Sie Segmente der Nabelschnur zweimal mit genügend PBS (z.B. 40 mL in einem 60 mm Petrischale), um das Gewebe zu tauchen. Hacken Sie fein Gewebe Segmente mit einem Skalpell. Gewebe in einem 100 mm Petrischale mit 50 mL Verdauung Medium zu verdauen (0,2 % Typ 2 Kollagenase, 1 % Penicillin-Streptomycin, in niedrig-Glukose Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM)).</li>
	<li>Legen Sie Gewebe bei der Verdauung von Medium auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min über Nacht in einer 5 % CO2, 37 ° C Inkubator. Am nächsten Tag Verdauung Medium in einem Verhältnis von 01:16 in 2 % Antibiotikum Antimykotikums in PBS verdünnen und pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 10 min. verwerfen überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Pellets in mesenchymale Stammzellen Wachstum Medium (MSCGM) und rekombinieren Sie Zellen. Platte Zellen bei einer Dichte von 7 x 103 Zellen/cm2 in Gewebekultur behandelt T-75 Flaschen. Kultur HWJCs in MSCGM, und erweitern Sie auf Abschnitt 5 für Experimente. Hinweis: HWJCs können Sub kultiviert werden in größeren T-Fläschchen (z.B.t-150, T-300) beim Passagierung zur Erhöhung der Ausbeute an hWJCs für Experimente.</li>
</ol>
(4) Infusion von hWJCs in Decellularized Cochleae
<ol>
	<li>Bereiten Sie decellularized cochleae
	<ol>
		<li>Mit aseptischen Technik gespeicherten Cochleae in 1 X PBS dreimal für jeweils 30 min. waschen.</li>
		<li>Cochleae in separaten Vertiefungen einer 24-Well-Platte übertragen, und fügen Sie 1 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM.</li>
		<li>Inkubieren Sie Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für ein Minimum von 1 h vor der Infusion von Zellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HWJCs distanzieren und Aufschwemmen
	<ol>
		<li>Waschen hWJCs mit 37 ° C vorgewärmt es 1 X PBS zweimal.</li>
		<li>Fügen Sie genügend 37 ° C vorgewärmt Trypsin mit 0,5 % EDTA an die Zelloberfläche Schiff zu decken.</li>
		<li>Inkubieren Sie hWJCs für bis zu 5 min in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator.<ol>
			<li>Vergewissern Sie sich, dass 90 % der Zellen von der Zelloberfläche Kultur getrennt haben, indem Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop ansehen. Hinweis: Zellen, die sich bewegen, wenn das Kulturgefäß sanft getippt wird, getrennt haben. Zellen, die stationär bleiben, nicht gelöst haben.</li>
			<li>Klopfen Sie leicht die Seiten des Kolbens, weiteren angeschlossene Zellen verdrängen.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aseptischen Technik verwendet, Transfer hWJCs aus dem Kulturgefäß für eine 50mL konische Röhrchen mit gleichwertigem Umfang des MSCGM auf das Volumen des Trypsin, die Zellen zu trennen.</li>
		<li>Pellet-die hWJCs durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur (~ 27 ° C) für 5 Minuten.</li>
		<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie hWJCs in MSCGM in einer Konzentration von 500.000 Zellen/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfundieren cochleae
	<ol>
		<li>Übertragen Sie Cochleae auf einen neuen 24-Well-Platte mit einer Transferpipette.</li>
		<li>Einen Tropfen des MSCGM auf jede Schnecke, Cochlea Austrocknen verhindert wird.</li>
		<li>Zart orientieren Sie die Cochlea mit ultra-feine Pinzette, so dass die ovalen und runden Fenster sind nach oben. Hinweis: Extreme Vorsicht im Umgang mit direkt jede Schnecke da die Cochlea leicht beschädigt ist.</li>
		<li>Mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulin-Spritze mit angeschlossenen Schläuchen, erarbeiten von 0,2 mL Nukleinsäuretablette hWJCs (100.000 Zellen).</li>
		<li>Positionieren Sie mit sterilisierten feine Pinzette, Schlauch über das ovale Fenster.</li>
		<li>Zart und langsam durchspülen die Cochlea mit 0,2 mL resuspendierte hWJCs mit einer 28,5-Gauge Insulin Spritze verbunden mit Polyethylen-Rohre (Außendurchmesser: 0,61 mm, Innendurchmesser: 0,28 mm) über ca. 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie nach der Perfusion, 0,8 mL von 37 ° C vorgewärmt MSCGM, die gut mit der Cochlea, das Gesamtvolumen in den Brunnen zu 1 mL zu bringen.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritte 4.3.3-4.3.7 für jede Schnecke, mit einer frischen Spritze und Schlauch jedes Mal.</li>
		<li>Perfundierten Cochleae in einer 5 % CO2, 37 ° C Zelle Kultur Inkubator und ändern Sie Medien dreimal pro Woche zu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
(5) Cochlea Ernte und Konservierung
Hinweis: Cochleae möglicherweise kultiviert und geerntet zu jedem Zeitpunkt bis zu 30 Tage nach dem Perfusion.
<ol>
	<li>Um Cochleae zu bewahren, in 4 % Paraformaldehyd in 1 X PBS über Nacht bei 4 ° C auf einem schaukelnden Plattform zu beheben.</li>
	<li>Waschen Sie nach der Fixierung Cochleae mit 1 X PBS drei Mal für 5 Minuten.</li>
	<li>Allmählich austrocknen Cochlea mit Ethanol und klar mit einem aliphatische Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel vor Einbettung in Paraffin.</li>
	<li>Abschnitt-Proben bis zu einer Dicke von 10 µm, die mit einem Mikrotom und Mount auf Glas-Objektträger. Hinweis: Die Proben sind nun bereit für histologische oder immunhistochemische Bearbeitung mit standard-Protokolle.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir haben erfolgreich gezeigt, dass native Cochlea-Zellen aus der Cochlea über einen Decellularization-Prozess entfernt werden können, ermöglicht die Verwendung der Cochlea als eine komplizierte, dreidimensionale Gewebe-Gerüst. Santi Et Al. 15 die erste Methode für einem Cochleae entwickelt und haben genau die Volumen der durch viele Cochlea-Strukturen mit Hilfe von leichten Merkblatt Mikroskopie23geschätzt. Diese frühen Arbeiten war eine starke Basis für die Geweb...

Die Cochlea ist eine komplizierte Spiralstruktur in das Felsenbein gefunden. Es besteht aus einem äußeren knöchernen Labyrinth und eine konzentrische, innere Membranous Labyrinth1. Die Membranous Labyrinth besteht aus drei fließende Räume: Scala Vestibuli, Scala Media und Scala Pauke1. Die Scala Media beherbergt das sensorische Epithel, die aus einer Vielzahl von Zelltypen besteht, aber die sensorischen Haarzellen (HC), die mechanischen Energie in Schallwellen in Nervenimpulse2transduzieren, von besonderem Interesse sind. Belastung durch Knalltrauma3,4,5, Medikamente6, Krankheit7,8und Altern9 kann alle Beeinträchtigung der auditiven Funktion über HC Tod führen. Haarzelle Verlust bei Säugetieren ist dauerhaft, im Gegensatz zu Vogelgrippe HCs, die nach Verletzungen10regenerieren können.
Eine Vielzahl von zeitgenössischen Forschungsbemühungen haben versucht, Wiederherstellen von verlorenen HCs, obwohl die spezifische experimentelle Ansätze variieren. Manipulation der gen-Expression in den sensorischen Epithel und Implantation von Stammzellen differenzierte außerhalb des Körpers sind dominante Ansätze im Bereich, obwohl Induktion Methoden, die darauf abzielen, Stammzellen in Cochlea Organellen zu unterscheiden gewesen 11,12,13versucht. Jeder dieser Ansätze ist entweder direkt auf Stammzellen oder die Entwicklungsstörungen Cues verwendet durch Stammzellen; jedoch eine zweite geteilt und potenziell kritische Element ist das ECM der Cochlea selbst14,15.
ECM bietet nicht nur physische Unterstützung für Zellen und Gewebe, die eine Oberfläche für die Zelladhäsion, Proliferation, überleben und Migration, aber auch spielt entscheidende Rolle bei der Entwicklung der HCs und die Spirale Ganglion15,16 ,17. Natürlich bietet vorkommende ECM induktive Signale, die Zelle Phänotyp Entschlossenheit und/oder Zelle Adhäsion, Vermehrung und überleben18führen können. Daher die Verwendung von decellularized Cochlea in Kombination mit kultivierten hWJCs bieten eine einmalige Gelegenheit, die Rolle der ECM und HC Regeneration zu erforschen. HWJCs sind eine schnell verfügbare, unumstrittenen Zelltyp abseits der menschlichen Nabelschnur, die Verhalten sich wie mesenchymalen Stammzellen19. HWJCs haben die Fähigkeit zu differenzieren, neurosensorische Zelle Linien20,21gezeigt. So beschreibt das aktuelle Protokoll der Isolation, Decellularization und Durchblutung des Cochleae von C57BL Maus Kadaver mit hWJCs für das Innenohr Tissue Engineering.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R Zentrifuge</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Semi-Rigid Schläuche</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafeine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>Konische 50-ml-Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>Scientific 12565271</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulinspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS Objektträger aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel mit Dapi</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Serie II 3110 Wasser-Jacekted CO2 Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Mesenchymales Stammzellwachstumsmedium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Kulturflasche</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 Kulturflasche</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 Kulturflasche</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Seziermikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire Klasse II, Typ A2 Biosicherheitswerkbank</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für einem maus cochleae für das innenohr tissue engineering

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

Bei Säugetieren, Mechanosensory Haarzellen, die Anhörung fehlt die Fähigkeit zu regenerieren, zu erleichtern hat die Behandlungen für Hörverlust beschränkt. Aktuelle Strategien der regenerativen Medizin konzentrierten sich auf die Transplantation von Stammzellen oder genetische Manipulation der umliegenden Stützzellen im Innenohr zu ermutigen, Ersatz der beschädigten Zellen, Verlust der Hörfähigkeit zu korrigieren. Doch die extrazelluläre Matrix (ECM) kann spielen eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der Funktion der Haarzellen und nicht gut untersucht. Mit dem Cochlea-können ECM als Gerüst zu adulten Stammzellen wachsen einzigartige Einblicke in wie die Zusammensetzung und die Architektur der extrazellulären Umgebung aids Zellen bei der Aufrechterhaltung des Gehörs. Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung und einem Cochleae von Mäusen, als Gerüste akzeptieren perfundierten adulten Stammzellen zu verwenden. In dem aktuellen Protokoll sind Cochleae isoliert euthanasierten Mäuse, decellularized und entkalkt. Danach wurden menschliche Wharton Gelee Zellen (hWJCs), die aus der Nabelschnur isoliert wurden sorgfältig in jedem Cochlea durchblutet. Die Cochleae dienten als Bioreaktoren, und Zellen waren für 30 Tage vor einer Bearbeitung für die Analyse kultiviert. Decellularized Cochleae identifizierbare extrazelluläre Strukturen beibehalten, aber das Vorhandensein von Zellen oder spürbare Fragmente von DNA nicht offenbart. Zellen in die Cochlea durchblutet erobert die meisten von Interieur und Exterieur der Cochlea und wuchs ohne Zwischenfall über eine Dauer von 30 Tagen. So kann die aktuelle Methode verwendet werden, wie Cochlea-ECM Affekte Zellentwicklung und Verhalten zu studieren.

Mithilfe der hier vorgestellten Methoden, erfolgreiche Decellularization Cochleae wurden abgeschätzt, indem untersucht das Vorhandensein oder Fehlen von DNA durch 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Cochleae galten als voll decellularized, wenn DNA in der decellularized Cochlea nicht erkannt wurde. Ein native Cochlea aus einer früheren Experiment, die nicht Decellularization oder Entkalkung unterzogen wurde als Positivkontrolle verwendet, um die Strukturen und Zellen, die tradi...

Das Ziel dieses Protokolls ist eine effektive Methode, um decellularize und Entkalken Maus Cochleae zur Nutzung als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen zu demonstrieren.

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine effektive Methode zur Dezellularisierung und Entkalkung von Maus-Cochleae zu demonstrieren, um ein Gerüst für Innenohr-Tissue-Engineering-Anwendungen zu verwenden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hör- und Gewebezüchtung zu beantworten, wie z. B. wie die 3D-Cochlea und verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix die Stammzelldifferenzierung beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Forscher ermöglicht zu untersuchen, wie Zellen direkt mit der extrazellulären Matrix der Cochlea interagieren, um sensorisches Epithel zu bilden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Schläfenknochenisolierung und den Zellprofusionsapparat allein auf der Grundlage von Textbeschreibungen korrekt zu visualisieren. Um diesen Eingriff zu beginnen, halbieren Sie den Schädel in der mittleren Sagittalebene mit einer scharfen chirurgischen Schere. Entfernen Sie als Nächstes das Hirngewebe aus dem Schädel.Identifizieren Sie dann das Schläfenbein durch das Vorhandensein der auditorischen und vestibulären Nervenwurzeln auf der Innenseite des Schädels und des Gehörgangs von außen. Schneiden Sie vorsichtig durch den Schädel, um das Schläfenbein vom Rest des Schädels zu isolieren. Führen Sie anschließend die feine Pinzette etwa fünf Millimeter in die Öffnung des Gehörgangs ein, damit die Spitzen nicht Gefahr laufen, die Cochlea zu durchstechen.Brechen Sie den Knochen der Bola vorsichtig auf, so dass er bricht. Hebeln Sie mit einer feinen Pinzette den Rest der Bola vom Schläfenbein ab und legen Sie das knöcherne Labyrinth der Cochlea frei. Tauchen Sie anschließend das Schläfenbein in PBS mit den ovalen und runden Fenstern der Cochlea nach oben ein.Entfernen Sie mit einer ultrafeinen Pinzette die Steigbügelarterie, die durch den Steigbügel verläuft. Führen Sie dann eine Spitze der ultrafeinen Pinzette durch den Steigbügelbogen ein, durch den die Arterie verläuft, und heben Sie den Steigbügel vorsichtig nach oben. Anschließend die ovalen und runden Fenster durchstechen.Positionieren Sie anschließend den Schlauch, der mit einer PBS-gefüllten 28,5-Gauge-Spritze verbunden ist, über dem ovalen Fenster. Geben Sie zwei Millimeter 10% Antibiotikum-Atimykotika und 10% Penicillin-Streptomycin in PBS über fünf Minuten durch die Cochlea, um die Perilymphe zu entfernen. Entfernen und entsorgen Sie dann verbleibendes Muskelgewebe und Knochenfragmente.Für die Dezellularisierung wird die Cochlea mit der Transferpipette vorsichtig nach oben in die Pipette gezogen, so dass sie nur wenige Millimeter über die abgeschnittene Kante hinausgeht. Stoßen Sie anschließend die Cochlea in das mit 1%SDS-Lösung gefüllte Szintillationsfläschchen aus. Zirkulieren Sie zwei Milliliter 1 %SDS in entionisiertem Wasser mit einer Transferpipette durch die Cochlea im Szintillationsfläschchen.Stellen Sie das Szintillationsfläschchen in einen Rotator und lassen Sie es 72 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 10 U/min rotieren. Ersetzen Sie die Lösung über einen Zeitraum von 72 Stunden alle 24 Stunden durch eine frische 1%ige SDS-Lösung und achten Sie darauf, die Cochlea während des Lösungswechsels nicht der Luft auszusetzen. Waschen Sie danach die Cochlea dreimal im selben Szintillationsfläschchen für jeweils 30 Minuten in VE-Wasser.In diesem Stadium sollte die Cochlea dezellularisiert werden. Entfernen Sie zur Entkalkung das restliche DI-Wasser aus dem Szintillationsfläschchen, so dass gerade so viel übrig bleibt, dass die Cochlea untergetaucht bleibt. Um mit der Entkalkung zu beginnen, geben Sie fünf Milliliter 10%iges EDTA- und DI-Wasser in das Szintillationsfläschchen mit der Cochlea.Zirkulieren Sie zwei Milliliter 10 % EDTA in deionisiertem Wasser mit einer Transferpipette durch die Cochlea im Szintillationsfläschchen. Setzen Sie das Szintillationsfläschchen wieder in den Rotator ein und lassen Sie das Szintillationsfläschchen 72 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 10 U/min rotieren. Wechseln Sie die 10%ige EDTA-Lösung alle 24 Stunden über einen Zeitraum von 72 Stunden.Achten Sie beim Wechseln der Lösungen darauf, dass die Cochlea nicht der Luft ausgesetzt ist. Spülen Sie dann die Cochlea dreimal für jeweils zwei Stunden mit PBS aus. In diesem Stadium sollte die Cochlea entkalkt werden.Beginnen Sie vor der Infusion der Zellen mit der Inkubation von dezellurierten und entkalkten Cochlea in einem 5%igen Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator mit 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Um die Cochleae zu überschwemmen, geben Sie als nächstes einen Tropfen MSCGM in jede Cochlea, um ein Austrocknen der Cochlea zu verhindern. Übertragen Sie sie mit einer Transferpipette auf eine neue 24-Well-Platte.Richten Sie die Cochlea mit einer ultrafeinen Pinzette vorsichtig aus, so dass die ovalen und runden Fenster nach oben zeigen. Entnehmen Sie dann mit einer sterilen 28,5-Gauge-Insulinspritze mit angeschlossenem Schlauch 0,2 Milliliter resuspendierter humaner Wharton-Geleezellen. Positionieren Sie anschließend den Schlauch mit einer sterilisierten Feinzange über dem ovalen Fenster.Füllen Sie die Cochlea sanft und langsam über einen Zeitraum von fünf Minuten mit 0,2 Millilitern resuspendierten menschlichen Wharton-Geleezellen. Dieser Schritt der Fülle ist wichtig. Die erfolgreiche Flüssigkeitszufuhr durch die Cochlea hat einen großen Einfluss auf das Ergebnis dieses Protokolls.Geben Sie nach dem Aufgießen 0,8 Milliliter 37 Grad Celsius vorgewärmtes MSCGM in die Vertiefung mit Cochlea, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen. Wiederholen Sie den Vorgang für jede Cochlea. Jedes Mal mit einer frischen Spritze und einem Schlauch.Legen Sie die stark empfundene Cochlea in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator und wechseln Sie das Medium dreimal pro Woche. Hier ist die erfolgreiche Dezellularisierung und Entkalkung einer Maus-Cochlea ohne injizierte Zellen zu sehen. Insgesamt ist die Anatomie der Cochlea erhalten, wobei Hohlräume ohne feuchte Verfärbungen zurückbleiben.Hier sind die repräsentativen Ergebnisse von erfolgreich kultivierten Geleezellen von Human Wharton auf einem Cochlea-Gerüst. Reichlich Feuchtfärbung ist in der gesamten Cochlea und auf der äußeren knöchernen Oberfläche zu beobachten. Eine genauere Untersuchung der einzelnen Windungen zeigt, dass feine Cochlea-Strukturen nach der Dezellularisierung und Entkalkung erhalten bleiben und dass injizierte Zellen an die native extrazelluläre Cochlea-Matrix gebunden sind und/oder mit ihr interagieren.Auch die Dezellularisierung in nachfolgenden Zellkulturen wurde mittels H&E-Färbung untersucht. Die dezellularisierte Cochlea enthielt keine der Zellen der nativen Cochlea, behält aber den größten Teil der Anatomie des Corti-Organs bei, da die extrazelluläre Matrix erhalten bleibt. Bei der Injektion in kultivierte Zellen kann beobachtet werden, dass sie durch das Corti-Organ mit der dezellularisierten extrazellulären Matrix interagiert.Einmal gemeistert, kann die Fülle der Zellen in eine dezellularisierte Cochlea etwa 10 bis 15 Minuten dauern, wenn die Cochlea bereits vorbereitet ist und die erforderlichen Werkzeuge entsprechend ausgelegt sind. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, die Cochlea vorsichtig zu behandeln, da sie zerbrechlich ist. Es ist auch wichtig, das Eindringen von Luft in die Cochlea zu vermeiden, da Blasen den Flüssigkeitsfluss während des Überflusses blockieren.Dieses allgemeine Verfahren kann auf Cochleae anderer Spezies angewendet werden, und es kann auch eine Vielzahl von Zelltypen injiziert werden. Die spezifischen Dezellularisierungs- und Entkalkungszeiten werden wahrscheinlich variieren, aber die zugrunde liegenden Konzepte werden die gleichen bleiben. Dr. Peter Santi von der University of Minnesota entwickelte ursprünglich die Dezellularisierungstechnik, die wir für dieses Protokoll modifiziert haben.Wir hoffen, unsere Technik und Zellkultur auf Cochlea-Gerüsten anderen Tissue Engineers zur Verfügung stellen zu können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Schläfenknochen erfolgreich isolieren, dezellularisieren und entkalken können, bevor Zellen für die Verwendung in Kulturexperimenten injiziert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt.  Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Es gibt verschiedene Methoden, um ototoxische Wirkstoffe in die Cochleae von Tiermodellen einzuführen. Vorgestellt wird ein chirurgisches Protokoll zur Verabreichung von ototoxischen Wirkstoffen an die runde Fensternische. Das Verfahren ist zuverlässig, erzeugt gezielte intracochleäre Läsionen und vermeidet mechanische Schäden an der Mikroarchitektur. Eine Untersuchung der Selbstreparatur/Regeneration der Cochlea ist möglich.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Primäre Zilien beeinflussen verschiedene Signalwege. Die Cochlea von Säugetieren ist ideal für die Untersuchung der Signalübertragung der planaren Zellpolarität (PCP). Die Dysfunktion der Zilien beeinflusst das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterung und die Ausrichtung der Haarzellen, die Messwerte des PCP. Unser Ziel ist es, die PCP-Signalübertragung in der Cochlea der Maus mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren.

Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Zwei mikrochirurgische Ansätze zur lokalen Wirkstoffabgabe an das Innenohr werden hier beschrieben und hinsichtlich ihres Einflusses auf Hörparameter, die Cochlea-Zytoarchitektur und die Expression von Entzündungsmarkern verglichen.

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanale Injection

Dieser Artikel stellt eine modifizierte Cochlea-Oberflächenvorbereitungsmethode vor, die eine Entkalkung und Verwendung eines Zell- und Gewebeklebers erfordert, um die Stücke der Cochlea-Epithel an 10 mm runden Abdeckungsscheinen für die Immunhistochemie bei erwachsenen Mauscochleae zu haften.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Hier präsentieren wir eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditiven Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen. Darüber hinaus kann Dextrans von 3–10 kDa verwendet werden, um Endozytose im Haar und unterstützenden Zellen des Organs von Corti zu studieren.

Dextran Etikettierung und Aufnahme in lebenden und funktionellen Murine Cochlear Haarzellen

In dieser Studie stellen wir ein Echtzeit-Bildgebungsverfahren unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie vor, um Zellen zu beobachten, die sich durch Ex-vivo-Inkubation mit dem Cochlea-Epithel, das das Organ von Corti enthält, in Richtung geschädigtes Gewebe bewegen.

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging zur Erforschung der Zellmigration zum Organ von Corti

Das aktuelle Protokoll aktualisiert frühere Protokolle und enthält relativ einfache Ansätze für die Kultivierung hochwertiger Cochlea-Explantate. Dies ermöglicht eine zuverlässige Datenerfassung und hochauflösende Bildgebung in lebenden und fixierten Zellen. Dieses Protokoll unterstützt den anhaltenden Trend zur Untersuchung von Innenohrzellen.

Ganze neonatale Cochlea-Explantate als In-vitro-Modell

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

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Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

Lernen Sie eine Methode zur Dezellularisierung und Entkalkung von Mäusecochleae für Tissue-Engineering-Anwendungen am Innenohr. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

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