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Der ATP-Biolumineszenz-Assay

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Cell Biology

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The ATP Bioluminescence Assay

4.10: An Introduction to Cell Metabolism

4.13: An Introduction to Cell Death

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08:32 min

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April 30, 2023

Overview

Glühwürmchen das Enzym Luciferase wandelt eine Substanz namens Luciferin zu Oxyluciferin und produziert Licht oder “Lumineszenz” als Ergebnis. Diese Reaktion erfordert Energie aus ATP um fortfahren zu können, so dass Forscher die Luciferase-Luciferin Interaktion um ATP-Werte in den Zellen zu messen ausgenutzt haben. Angesichts der ATP Rolle als Währung in die Zelle Energie, kann die ATP-Biolumineszenz-Assay Zellstoffwechsel und allgemeine Zellgesundheit Einblick in.

In diesem Video erläutert JoVE Zellatmung, insbesondere Überprüfung wie Glukose-Stoffwechsel ATP-Produktion führt. Dies folgt Prinzipien, die hinter der ATP-Biolumineszenz-Test und ein allgemeines Protokoll für diese Technik. Zu guter Letzt einen Überblick wie Forscher derzeit den ATP-Biolumineszenz-Test nutzen, um Zellviabilität in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu bewerten.

Procedure

Die ATP-Biolumineszenz-Assay ist eine verbreitete Methode zur Quantifizierung ATP Niveaus und lebendige, metabolisch aktive Zellen zu erkennen. ATP oder Adenosintriphosphat ist die primäre Energiequelle für alle lebenden Organismen, und “alle” meinen wir alle. Auf der zellulären Ebene entsteht ATP durch eine Reihe von Stoffwechselprozessen Zellatmung genannt.

Heute besprechen wir kurz die Wege Zellatmung beteiligt. Als nächstes wir stellen die Prinzipien hinter den ATP-Biolumineszenz-Assay, und gehen Sie durch eine Schritt für Schritt Protokoll zur Durchführung dieses Verfahrens. Zu guter Letzt werden wir sehen, wie die Wissenschaftler diese Technik in ihrer aktuellen Forschung anwenden.

Durch die Einführung der Zellatmung beginnen wir. Dieses Phänomen betrifft mehrere Stoffwechselvorgänge, aber konzentrieren wir uns auf einen Umgang mit Glukose-Stoffwechsel.

Im Zytoplasma die Glykolyse Weg wandelt Glucose zu Pyruvat, und in den Prozess erzeugt zwei ATP-Moleküle. Pyruvat wird in die Mitochondrien, wo es in Acetyl-Coenzym A umgewandelt wird transportiert – ein Prozess, der auch Kohlendioxid erzeugt. Während noch in den Mitochondrien, Acetyl-Coenzym A wird anschließend betritt die tricarboxylic Säure oder TCA-Zyklus, in denen Kohlendioxid erneut generiert wird, sind als die energiereichen Moleküle von NADH und FADH2. Diese Moleküle tragen”letztlich” Elektronen in den Elektronentransport-Kette oder etc..

Innerhalb der ETC werden Elektronen nacheinander zwischen verschiedenen Proteinkomplexe in der inneren mitochondrialen Membran, vor der Konvertierung von Sauerstoff in Wasser übertragen. Während dieses Prozesses werden Protonen in den Intermembran Raum der Mitochondrien “gepumpt”. ATP entsteht eigentlich, wenn diese Protonen wieder in der mitochondrialen Matrix eingeben, wie sie durch ein Protein namens ATP-Synthase. Die Synthese von 36 ATP-Moleküle zusammen, ergeben des TCA-Zyklus usw.. Aufschlüsselung der anderen Nährstoffen Molekülen, wie Fette und Proteine, kann auch in den TCA-Zyklus und ETC, was zu ATP Produktion einfließen.

Nun, wir wissen, wie Zellen ATP erzeugen, lassen Sie uns erfahren Sie mehr über die Prinzipien, die hinter der Probe, ATP Biolumineszenz, die gewöhnlich zum intrazellulären Niveaus dieses Moleküls zu messen.

Strukturell, ATP hat eine Base Adenin, ein Zucker Ribose und drei Phosphatgruppen – von denen die letztere durch energiereiche Bindungen verbunden sind. Diese Anleihen lassen Sie Energie, wenn Sie gebrochen und die ATP-Biolumineszenz-Assay nutzt diese Energie.

Im Grunde dieser Test erfordert das Luciferin Verbindung, die aus “leuchtende” Organismen wie Glühwürmchen gewonnen wird, und seine entsprechenden Katalysator-Enzyms Luciferase genannt. In Gegenwart von Sauerstoff Luciferase bezieht Energie aus ATP und wandelt Luciferin zu Oxyluciferin. Nebenprodukte dieser Reaktion sind Pyrophosphat, das zwei Phosphatgruppen von ATP erhalten – Umwandlung in Adenosin Monophosphate oder AMP-Kohlendioxid und Licht oder Lumineszenz. Lumineszenz wird gelesen von einem Luminometer, eine Maschine, die Lichtemission quantifiziert. Da die Menge der Lumineszenz produziert direkt proportional zu der Menge von ATP ist, dient dies einen guten Indikator der Zellviabilität und des Stoffwechsels.

Nun, da Sie die Prinzipien hinter der ATP-Biolumineszenz-Test zu verstehen, lassen Sie uns beschreiben eines allgemeinen Protokolls.

Erstens sind Zellen in eine 96-Well-Platte mit Nährmedien ausgesät. Zellen sind in verschiedenen dichten in dreifacher Ausfertigung, dichteabhängigen Variation berücksichtigt beschichtet. Da die äußerste Brunnen nicht von anderen Brunnen auf allen vier Seiten umgeben sind, kann die Temperatur und Verdunstung in diesen Brunnen Variable sein. Daher Zellen sind nicht in den äußeren Vertiefungen überzogen, und stattdessen sie sind gefüllt mit Wasser, Platte-weite Verdunstung und Temperatur Variation zu vermeiden, die die Reaktion beeinträchtigen können. Platten sind dann über Nacht bei 37 ° C, damit die Zellen an die Kultur-Platten halten inkubiert.

Dann werden das Medium entfernt ist, Luciferase und Luciferin hinzugefügt zu jedem gut, und die Platte liegt auf einem Boston-Shaker für 5 – 15 Minuten, um die Reaktion zu erleichtern. Als nächstes wird ein Teil der Mischung aus jedem Brunnen auf einen weißen 96-Well-Platte übertragen; weiße Platten werden häufig verwendet, da sie reflektieren das Licht nach oben, für genauere Messungen der Lumineszenz. Darüber hinaus sollten Luftblasen vermieden werden, da sie nachfolgende Analysen stören könnten. Da die Lumineszenz-Signal im Laufe der Zeit verringern kann, wird die Platte innerhalb von 10 – 12 Minuten auf einem Luminometer gelesen.

Um die Luminometer Ergebnisse zu analysieren, wird ein durchschnittliche Lumineszenz Wert aus Brunnen mit der gleichen Zelle Dichte berechnet. Lumineszenz-Daten, die auf diese Weise von gesunden Kontrollproben und behandelten Zellen vergleichen, können Forscher die Auswirkungen einer bestimmten Behandlung auf Lebensfähigkeit und Stoffwechsel auswerten – insbesondere durch verminderte Lumineszenz in der experimentellen Gruppe suchen.

Nun, da Sie wie einen ATP-Biolumineszenz-Assay durchgeführt gesehen haben, sprechen wir über ihre Anwendungen in der Forschung.

Wissenschaftler versuchen immer neue antivirale Medikamente zu entwickeln, die nicht verletzen oder zu töten Wirtszellen. In dieser Studie wurden Säugerzellen in einem multiwell Teller ausgesät und mit einem bestimmten Virus infiziert. Verschiedenen antivirale Substanzen wurden hinzugefügt, um diese Proben, und Log Konzentration-Wirkungs-Kurven wurden erzeugt, um die wirksame Konzentration fünfzig oder EC50 berechnen. EC50 ist die Konzentration der Verbindung in welcher Zelle überleben 50 Prozent ist. Dies ist eine häufig verwendete Parameter eine Verbindung Zytotoxizität zu beurteilen.

ATP-Werte können auch Hinweise über mitochondriale Aktivität unter verschiedenen Bedingungen erzielt werden. Hier erfolgte der ATP-Biolumineszenz-Assay über die Vorbereitungen der Mitochondrien abgeleitet von Nagetier Leber- und Muskelzellen, die Forscher, inwieweit der mitochondrialen Funktion in normalen Geweben geholfen. Wichtig ist, könnte dieses Protokoll erweitert werden, um eine Möglichkeit zu prüfen, die Funktion der Mitochondrien bei Krankheitszuständen.

Dieser Assay benutzen Wissenschaftler auch um mögliche Krebs-Behandlungen in in-Vivo -Systemen zu untersuchen. In diesem Beispiel wurden menschlicher Tumorzellen geändert, um ausdrückliche Luciferase und in den Gehirnen von lebenden Mäusen injiziert. Nachdem die Tumorzellen in diesen Tieren hergestellt wurde, wurden sie mit einer Anti-Krebs-Medikament behandelt. Ein anschließende in Vivo ATP Biolumineszenz Assay ergab, dass Tumorzellen in Droge-exponierten Mäuse niedriger ATP Niveaus hatten.

Sie habe nur Jupiters Einführung in die ATP-Biolumineszenz-Assay beobachtet. Sie sollten jetzt mit der Zellatmung Wege und das Protokoll verwendet, um ATP, zu messen, die das Endprodukt dieser Wege ist vertraut sein. Die ATP-Biolumineszenz-Assay dient als eine ausgezeichnete Screening-Tool für Zellbiologen interessiert Untersuchung der Wirkung von physiologischen und pathologischen Faktoren auf den Zellstoffwechsel und Lebensfähigkeit. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

Transcript

The ATP bioluminescence assay is a common technique used to quantify ATP levels and detect living, metabolically active cells. ATP or adenosine triphosphate is the primary source of energy for all living organisms, and by “all” we mean ALL. At the cellular level, ATP is generated through a set of metabolic processes called cellular respiration.

Today, we’ll briefly discuss the pathways involved in cellular respiration. Next, we’ll introduce the principles behind the ATP bioluminescence assay, and go through a step-by-step protocol for performing this method. Finally, we’ll see how scientists are applying this technique in their current research.

Lets begin by introducing cellular respiration. This phenomenon involves several metabolic processes, but we’ll focus on the one dealing with glucose metabolism.

In the cytoplasm, the glycolysis pathway converts glucose to pyruvate, and in the process generates two ATP molecules. Pyruvate is transported into the mitochondria, where it is converted to acetyl-coenzyme A—a process that also generates carbon dioxide. While still in the mitochondria, acetyl-coenzyme A then enters the tricarboxylic acid or TCA cycle, during which carbon dioxide is again generated, as are the high-energy molecules of NADH and FADH2. These molecules ultimately “carry” electrons into the electron transport chain or ETC.

Within the ETC, electrons are sequentially transferred between different protein complexes in the inner mitochondrial membrane, before converting oxygen to water. During this process, protons are “pumped” into the intermembrane space of mitochondria. ATP is actually produced when these protons enter back into the mitochondrial matrix as they pass through a protein called ATP synthase. Together, the TCA cycle and ETC result in the synthesis of 36 ATP molecules. Breakdown of other nutrient molecules, such as fats and proteins, can also feed into the TCA cycle and ETC, leading to ATP production.

Now that we know how cells generate ATP, let’s learn about the principles behind the ATP bioluminescence assay, which is commonly used to measure intracellular levels of this molecule.

Structurally, ATP has an adenine base, a ribose sugar, and three phosphate groups—the latter of which are connected by high-energy bonds. These bonds release energy when broken, and the ATP bioluminescence assay capitalizes on this energy.

Basically, this assay requires the luciferin compound, which is obtained from “glowing” organisms like fireflies, and its corresponding catalyst enzyme called luciferase. In the presence of oxygen, luciferase derives energy from ATP and converts luciferin into oxyluciferin. Byproducts of this reaction are pyrophosphate, which is two phosphate groups obtained from ATP—converting it to adenosine monophosphate or AMP—carbon dioxide, and light or luminescence. Luminescence is read by a luminometer, a machine that quantifies light emission. Since the amount of luminescence produced is directly proportional to the amount of ATP, this serves a good indicator of cell viability and metabolism.

Now that you understand the principles behind the ATP bioluminescence assay, let’s outline a general protocol.

First, cells are seeded in a 96-well plate containing culture media. Cells are plated at various densities in triplicate, to account for density-dependent variation. Since the outer-most wells are not surrounded by other wells on all four sides, the temperature and evaporation rate in these wells may be variable. Therefore, cells are not plated in the outer wells, and instead they are filled with water to avoid plate-wide evaporation and temperature variation that may affect the reaction. Plates are then incubated overnight at 37°C to allow the cells to adhere to the culture plates.

Then, the media is removed, luciferase and luciferin are added to each well, and the plate is placed on a shaker for 5–15 minutes to facilitate the reaction. Next, a portion of the mixture from each well is transferred to a white 96-well plate; white plates are often used as they reflect light upwards, allowing for more accurate luminescence readings. In addition, bubbles should be avoided, as they could interfere with subsequent analyses. As the luminescence signal can decrease over time, the plate is read within 10–12 minutes on a luminometer.

To analyze the luminometer results, an average luminescence value is calculated from wells with the same cell density. By comparing luminescence data collected in this manner from both healthy control samples and treated cells, researchers can evaluate the effects of a specific treatment on viability and metabolism—specifically by looking for decreased luminescence in the experimental group.

Now that you’ve seen how to perform an ATP bioluminescence assay, let’s discuss its research applications.

Scientists are always trying to develop new antivirals that don’t harm or kill host cells. In this study, mammalian cells were seeded in a multiwell plate and infected with a specific virus. Various antiviral compounds were added to these samples, and log concentration-response curves were generated to calculate the effective concentration fifty or EC50. EC50 is the concentration of compound at which cell viability is 50 percent. This is a commonly used parameter to assess a compound’s cytotoxicity.

ATP levels can also yield clues about mitochondrial activity under various conditions. Here, the ATP bioluminescence assay was performed on preparations of mitochondria derived from rodent liver and muscle cells, which helped researchers assess the extent of mitochondrial function in normal tissues. Importantly, this protocol could be extended to provide a way to examine mitochondrial function in disease states.

Scientists are also using this assay to investigate potential cancer treatments in in vivo systems. In this example, human tumor cells were modified to express luciferase and injected into the brains of living mice. After the tumor cells became established in these animals, they were treated with an anti-cancer drug. A subsequent in vivo ATP bioluminescence assay revealed that tumor cells in drug-exposed mice had lower ATP levels.

You’ve just watched JoVE’s introduction to the ATP bioluminescence assay. You should now be familiar with the cellular respiration pathways and the protocol used to measure ATP, which is the end product of these pathways. The ATP bioluminescence assay serves as an excellent screening tool for cell biologists interested in studying the effect of physiological and pathological factors on cell metabolism and viability. As always, thanks for watching!

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