Name: Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie eine Mikrofluidik-Methode zur mechanischen Stimulation von C. elegans mit hochauflösender Bildgebung neuronaler Reaktionen. Diese Technik ermöglicht präzise Untersuchungen in der Mechanobiologie.

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Wir bedanken uns bei Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty und Veronica Sanchez für Unterstützung im Gerätedesign und Generierung von mutierten Tieren. Diese Forschung wurde unterstützt durch NIH-Stipendien R01EB006745 (zur BLP), R01NS092099 (zu MBG), K99NS089942 (für MK), F31NS100318 (zu ALN) und empfangene Finanzierung vom European Research Council (ERC) unter Horizont 2020 Forschung und Innovation der Europäischen Union Programm () Finanzhilfevereinbarung Nr. 715243 MK).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll veranschaulicht eine Methode für die Bereitstellung von präzisen mechanischen Stimulation der Haut ein Fadenwurm, gefangen in einem Mikrofluidik-Chip. Es soll die Integration der physikalischen Reize für biologische Fragen erleichtern und Mechanobiology Forschung im biologischen Labor optimieren soll. Diese Methode erweitert vorherigen Tests zur Beurteilung der Funktion der Mechanosensory Neuronen in C. Elegans. Vorherigen quantitative und semi-quantitativen Techniken gemessen Kräfte<sup class="...

Der Tastsinn bietet Tiere mit wichtigen Informationen über ihre Umgebung. Je nach der angewendeten Kraft wird Touch so harmlos, angenehm oder schmerzhaft empfunden. Die Gewebe-Verformung bei Berührung erkannt wird durch spezialisierte Mechanoreceptor Zellen in der Haut eingebettet, die Rezeptor-Proteine, die am häufigsten Ionenkanäle ausdrücken. Die Schritte verknüpfen Kraft Wahrnehmung mit Ionen-Kanal Aktivierung bei Berührung und Schmerz sind nicht vollständig geklärt. Noch weniger ist bekannt über das Hautgewebe filtert mechanische Verformung und ob Mechanorezeptoren erkennen von Änderungen im Stamm oder betonen,1,2,3. Diese Lücke im Verständnis ergibt sich einerseits aus einem Mangel an geeigneten Werkzeugen, präzise mechanische Reize an die Oberfläche der Haut ein lebendes Tier anzuwenden, unter Beachtung der Reaktionen auf zellulärer Ebene. Während Rasterkraftmikroskopie weitgehend verwendet worden ist, anzuwenden und messen Kräfte in isolierten Zellen4,5 und Piezo1 Rezeptoren im Leben aktivieren Zellen6, ähnliche Experimente mit lebenden Tieren, vor allem C. Elegans, wurden notorisch schwierig wegen der inhärenten Mobilität des Subjekts. Diese Herausforderung wird traditionell durch Veterinär- oder chirurgischen Klasse Cyanacrylat Klebstoff, um einzelne Tiere auf Agar-Pads1,7,8,9zu immobilisieren umgangen. Dieser Ansatz ist produktiv gewesen, aber hat Beschränkungen in Bezug auf das Geschick erforderlich für Immobilisierung durch Kleben und die weiche Agar-Oberfläche auf mechanische Compliance. Eine Mikrofluidik-Strategie ist eine kostenlose Alternative, die den Komplikationen verbunden zu kleben vermeidet.
Der Fadenwurm C. Elegans ist ein genetisches Modellorganismus mit einer völlig zugeordneten Nervensystem, das aufgrund der Größe des Tieres, eine gute Passform für Mikrofluidik-Technologie. Mikrofluidik-basierte Geräte bieten den Vorteil, dass die sonst äußerst mobilen Tiere zurückgehalten werden können, während der Durchführung hochauflösende Bildgebung und Lieferung von relevanten Neuro-modulierende reizen. Mit Hilfe von mikrofluidischen können Technologien, lebende Tiere ohne Schaden10,11, ermöglicht Überwachung des Verhaltens Aktivität über die gesamte Lebensdauer12,13 und hochauflösende immobilisiert werden Imaging von neuronaler Aktivität14,15,16,17. Weiter, viele Mechanoreceptor Neuronen benötigt für das Gefühl der Berührung und Schmerz auf ihre physiologischen1,8, mechanische4,18,19, gekennzeichnet werden kann und molekulare Level20,21,22.
C. Elegans spürt sanfte mechanische Reize an seinen Körper Wand mit sechs TRNs, von denen drei innervieren des Tieres anterior (ALML/R und AVM) und drei davon innervieren des Tieres Posterior (PLML/R und PVM). Die Ionen-Kanal Moleküle benötigt für eine ausgeübte Kraft in eine biochemische Signal transducing haben ausgiebig in seiner TRNs8untersucht. Dieser Artikel stellt eine mikrofluidischen Plattform23 , mit dem Forscher präzise mechanische Kräfte auf die Haut von einem immobilisierten C. Elegans anwenden können Fadenwurm, beim Auslesen der Verformung von seiner inneren Geweben durch optische Bildgebung. Neben der Präsentation klar definierte mechanische Reize, können Kalzium Transienten in Mechanoreceptor Neuronen mit subzellulären Auflösung aufgezeichnet und korreliert mit morphologischen und anatomischen Merkmale. Das Gerät besteht aus eine zentrale Trapping-Kanal, der hält ein einziges Tier und präsentiert seine Haut neben sechs pneumatische Betätigung-Kanälen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die sechs Kanäle befinden sich entlang der Trapping-Kanal, mechanische Reize zu jedem der sechs TRNs der Wurm zu liefern. Diese Kanäle sind aus der Trapping-Kammer durch dünne PDMS Membranen, getrennt durch eine externe Luftversorgung der Druck (Abbildung 1) gefahren werden kann. Wir kalibriert die Durchbiegung in Bezug auf Druck und liefern die Messungen in diesem Artikel. Jeder Antrieb kann individuell angesprochen und verwendet, um eine Mechanoreceptor Wahl zu stimulieren. Der Druck wird geliefert mit einem Piezo-gesteuerte Druckpumpe aber alternative Gerät verwendet werden kann. Wir zeigen, dass die Druck-Protokoll verwendet werden kann, TRNs in Vivo aktivieren und demonstrieren Betriebsgeräte geeignet für Erwachsene C. Elegansmechanische Stimuli bereitzustellen, ausgewachsene Tiere in Geräte laden, Kalzium Bildgebung durchführen Experimente und Analyse der Ergebnisse. Gerät Herstellung besteht aus zwei wesentlichen Schritten: 1) Photolithographie zu einer Form von SU-8; und 2) Guß PDMS um ein Gerät zu machen. Aus Gründen der Kürze und Klarheit gekennzeichnet Leser zuvor veröffentlichten Artikel und Protokolle24,25 für Anweisungen, wie man die Werkzeuge und Geräte zu produzieren.

<table><tbody><tr><td>Chrommaske</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', entworfen in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chrommaske</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', entworfen in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Chrommaske</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5''), entworfen in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>4'' Siliziumwafer (B-Test)</td><td>Stanford Nanofabrication Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem Spin-coater</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Belichtungstimer</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Beleuchtungscontroller</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Trichlormethylsilan (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Achtung: TCMS ist giftig und wasserreaktiv</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>PDMS Prepolymer</td></tr><tr><td>Biopsie-Stanze, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff-Plasma-Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine Metallschläuche (0,635 mm AD, 0,4318 mm ID, 12,7 mm lang); Messgröße 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Spritzenvorsatzfilter, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo</td><td>Scientific 725-2520</td><td>zum Filtern der gesamten Lösung, kleine Partikel würden den Chip verstopfen</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch; 0,9652 mm AD, 0,5842 mm ID</td><td>Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>zum Einfangen und Freisetzen von Würmern</td></tr><tr><td>Spritze, 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td><td>für schwerkraftbasierte Strömung</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, peristaltisch Pumpe</td><td>Gilson</td><td></td><td>zum Absaugen von Lösungen und Würmern aus dem Chip</td></tr><tr><td>Mikrofluidischer Durchflussregler, ausgestattet mit 0&ndash; 800 kPa Druckkanal</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td>Druckabgabe</td></tr><tr><td>Wasserdichter durchsichtiger Polyurethanschlauch, 4 mm ID und 6 mm AD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>Anschluss von der Hausluft zur Druckpumpe</td></tr><tr><td>Wasserdichter durchsichtiger Polyurethanschlauch, 2,6 mm ID und 4 mm AD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>Anschluss der Druckpumpe an kleine Schläuche</td></tr><tr><td>Push-to-Connect Schlauchverschraubung für Luft</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>metrisch - imperialer Konverter</td></tr><tr><td>Gerader Verbinder für 6 mm &times 1/4&Prime; Tubus OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B Mikroskopiesystem</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO Ölobjektiv</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digitale CMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Mit cyan und grün/gelber Lichtquelle</td></tr><tr><td>Anregungsstrahlteiler</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>im Mikroskop</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Bildaufteilungsoptik</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>zur Aufteilung von grüner und roter Emission und zur Projektion auf verschiedene Bereiche auf dem Kamerachip</td></tr><tr><td>Emissionsstrahlteiler</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>im Bildteiler</td></tr><tr><td>Emissionsfilter GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>im Bildsplitter</td></tr><tr><td>Emissionsfilter mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>im Bildsplitter</td></tr></tbody></table>

verwendung von einem mikrofluidik-gerät für mechanische stimulation und high resolution imaging von c. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Ein zentrales Ziel des Mechanobiology ist die Wechselwirkung von mechanischem Stress auf Proteine und Zellen zu verstehen. Trotz seiner Bedeutung ist der Einfluss von mechanischem Stress auf zelluläre Funktion immer noch schlecht verstanden. Unter anderem existiert diese Wissenslücke, weil einige Tools gleichzeitige Verformung von Gewebe und Zellen, Bildgebung der Zellaktivität in lebenden Tieren und effiziente Einschränkung der Beweglichkeit in ansonsten hochmobile Modellorganismen wie die Nematoden ermöglichen Caenorhabditis Elegans. Die geringe Größe von C. Elegans stellt sie eine ausgezeichnete Übereinstimmung Mikrofluidik-Forschung Geräte und Lösungen für Immobilisierung wurden mit mikrofluidischen Geräten vorgestellt. Obwohl diese Geräte hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen, ist das Tier vollständig eingehüllt in Polydimethylsiloxan (PDMS) und Glas, physischen Zugriff für die Lieferung der mechanischen Kraft oder elektrophysiologische Aufnahmen zu begrenzen. Vor kurzem haben wir ein Gerät, das pneumatische Antriebe mit einem Trapping-Design integriert, die mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie kompatibel ist. Die Betätigung-Kanal trennt sich von den Wurm-Trapping-Kanal durch eine dünne Membran PDMS. Diese Membran ist in die Seite eines Wurms abgelenkt durch Druck aus einer externen Quelle. Das Gerät kann individuelle Mechanosensitive Neuronen ausrichten. Die Aktivierung dieser Neuronen ist abgebildet bei hochauflösenden mit genetisch codierte Kalzium Indikatoren. Dieser Artikel stellt die allgemeine Methode mit C. Elegans Stämme Calcium-Sensitive Aktivitätsanzeige (GCaMP6s) in ihrer Touch-Rezeptor-Neuronen (TRNs) zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist nicht beschränkt auf TRNs noch auf Kalzium-Sensoren als Sonde jedoch, auf andere mechanisch empfindlichen Zellen oder Sensoren erweitert werden kann.

SU-8 Lithographie und Chip Bonding Die Lithographie Protokoll und PDMS-Spritzgießen folgen Standardverfahren. Details finden an anderer Stelle23,24,25,26. Die PDMS sollte nach dem Aushärten der Wafer ohne Probleme abziehen. Wenn die SU-8-Features während PDMS Peelings Abzocke, reichten die SU-8 Adhäsion Schicht oder der Silanisierung. Wenn Pl...

Neue Werkzeuge für die Mechanobiology Forschung sind erforderlich, um verstehen, wie mechanischen Beanspruchung biochemische Stoffwechselwege aktiviert und biologische Reaktionen hervorruft. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur selektiven mechanischen Stimulation der immobilisierten Tiere mit einem mikrofluidischen Trap ermöglicht hochauflösende Bildgebung der zellulären Antworten.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, zu messen, wie Nematoden und ihre Neuronen auf externe mechanische Reize reagieren, indem ein mikrofluidischer Chipaufbau mit Druckaktoren verwendet wird. Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Bereichen Mechanobiologie und Sensorbiologie beantworten, z. B. wie Zellen, Gewebe und Tiere auf mechanische Stimulation reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beweglichkeit des Wurms auf nicht-invasive Weise ausreichend reduziert, um eine hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen und gleichzeitig Zugang zur Kutikula des Wurms für die mechanische Stimulation zu haben.Diese Methode kann auch verwendet werden, um den Einfluss mechanischer Signale auf die Entwicklung zu untersuchen. Es könnte sogar auf andere Systeme wie ex vivo Organexponse oder andere Tiere ähnlicher Größe wie C.Elegans angewendet werden. Richten Sie ein Mikroskopsystem zur gleichzeitigen Anregung von GCaMP und RFP ein.Eine Möglichkeit ist eine diskrete Lichtquelle, die nur cyanfarbenes und gelbes Licht durchlässt. Verwenden Sie zum Betrachten ein 10-faches Objektiv und ein Objektiv mit hoher Vergrößerung. Senden Sie das Bild auch über eine Digita

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei...

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Forscher können On-Demand-Bewegung in C. elegans auslösen, indem sie ein elektrisches Feld anlegen, das Würmer wahrnehmen und darauf reagieren. Dieses Video stellt elektrotaktisches Verhalten vor und zeigt ein Beispielprotokoll, das in einem mikrofluidischen Gerät durchgeführt wird.

Elektrotaxis-Assay: Eine Methode zur Beobachtung der Fortbewegung bei C. elegans

Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in...

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Die Verwendung eines angepassten "olfaktorischen Chips" für die effiziente Kalzium Imaging von C. Elegans Männchen ist hier beschrieben. Studien über männliche Einwirkung von Glycerin und ein Pheromon werden ebenfalls angezeigt.

Verwenden einen angepasste mikrofluidischen olfaktorische Chip für die Bildgebung neuronaler Aktivität als Reaktion auf Pheromone in männlichen C. Elegans Kopf Neuronen

In diesem Artikel zeigen wir live Darstellung der einzelnen Würmer mit einem benutzerdefinierten mikrofluidischen Gerät. In das Gerät beschränken sich mehrere Würmer individuell separate Kammern, Multiplex längs Überwachung der verschiedenen biologischen Prozesse ermöglicht.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

Eine Reihe von Immobilisierung Methoden wurde gegründet, um die gezielte Bestrahlung von live Caenorhabditis Elegans ermöglichen Einzelpersonen mit einer neu entwickelten ultra-dünnen Polydimethylsiloxan mikrofluidischen chip mit Wassereinlagerungen. Dieser Roman auf dem Chip Immobilisierung ist auch ausreichend für imaging-Beobachtungen. Die ausführliche Behandlung und Anwendungsbeispiele des Chips werden erläutert.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Das Protokoll beschreibt ein einfaches mikrofluidisches Chipdesign und eine Mikrofabrikationsmethodik, die verwendet wird, um C. elegans in Gegenwart einer kontinuierlichen Nahrungszufuhr für bis zu 36 h zu züchten. Das Wachstums- und Bildgebungsgerät ermöglicht auch eine intermittierende langfristige hochauflösende Bildgebung von zellulären und subzellulären Prozessen während der Entwicklung für mehrere Tage.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Design, die Herstellung und die Charakterisierung eines mikrofluidischen Systems, das in der Lage ist, Hunderte von Drosophila melanogaster-Embryonen mit minimalem Benutzereingriff auszurichten, zu immobilisieren und präzise zu komprimieren. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung und Rückgewinnung von Proben für die Analyse nach der Stimulation und kann skaliert werden, um andere mehrzellige biologische Systeme aufzunehmen.

Mechanostimulation mehrzelliger Organismen durch ein mikrofluidisches Kompressionssystem mit hohem Durchsatz

Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.

Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Dieses Protokoll beschreibt die mikrofluidische Zeitraffer-Bildgebung von C. elegans über die gesamte postembryonale Entwicklung.

Hochauflösende Bildgebung von C. elegans in allen Larvenstadien

Erfahren Sie eine Mikrofluidik-Methode zur mechanischen Stimulation von C. elegans mit hochauflösender Bildgebung neuronaler Reaktionen. Diese Technik ermöglicht präzise Untersuchungen in der Mechanobiologie.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

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