Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, zu messen, wie Nematoden und ihre Neuronen auf externe mechanische Reize reagieren, indem ein mikrofluidischer Chipaufbau mit Druckaktoren verwendet wird. Diese Methode kann Schlüsselfragen in den Bereichen Mechanobiologie und Sensorbiologie beantworten, z. B. wie Zellen, Gewebe und Tiere auf mechanische Stimulation reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beweglichkeit des Wurms auf nicht-invasive Weise ausreichend reduziert, um eine hochauflösende Bildgebung zu ermöglichen und gleichzeitig Zugang zur Kutikula des Wurms für die mechanische Stimulation zu haben.

Diese Methode kann auch verwendet werden, um den Einfluss mechanischer Signale auf die Entwicklung zu untersuchen. Es könnte sogar auf andere Systeme wie ex vivo Organexponse oder andere Tiere ähnlicher Größe wie C.Elegans angewendet werden. Richten Sie ein Mikroskopsystem zur gleichzeitigen Anregung von GCaMP und RFP ein.

Eine Möglichkeit ist eine diskrete Lichtquelle, die nur cyanfarbenes und gelbes Licht durchlässt. Verwenden Sie zum Betrachten ein 10-faches Objektiv und ein Objektiv mit hoher Vergrößerung. Senden Sie das Bild auch über eine Digitalkamera an einen Computer.

Fügen Sie als Nächstes einen Blütenwürfel und bei Bedarf einen Anregungsfilter hinzu. Fügen Sie dem Würfel einen dichroitischen Spiegel hinzu, der cyanfarbenes und gelbes Licht reflektiert und grünes und rotes Licht durchlässt. Richten Sie einen Strahlteiler mit einem dichroitischen Langpassspiegel mit einem Cutoff bei 570 Nanometern ein.

Stellen Sie außerdem einen Bandpass-Emissionsfilter für grünes Licht bei 525 Nanometern mit einer Breite von 50 Nanometern und einen Bandpass-Emissionsfilter für rotes Licht bei 632 Nanometern mit einer Breite von 60 Nanometern bereit. Projizieren Sie beide Strahlen in das Sichtfeld der Kamera. Stellen Sie sicher, dass der grüne Teil in die obere Hälfte des Bildschirms und der rote Teil in die untere Hälfte des Bildschirms projiziert wird.

Verwenden Sie immer mikrofluidische Chips, die weniger als einen Monat alt sind. Für den Aufbau wird zunächst der Schwerkraftbehälter mit gefiltertem M9 befüllt. Positionieren Sie das Reservoir etwa 60 Zentimeter über dem Chip und schließen Sie es an einen Chipauslass an. Verbinden Sie als Nächstes den anderen Auslass mit einem Abfallbehälter mit zwei Eingängen und verbinden Sie den zweiten Eingang mit dem Abfallbehälter mit einer Schlauchpumpe.

Stellen Sie alle Verbindungen mit Polyethylenschläuchen her. Montieren Sie als Nächstes Verbindungen mit einer Schlauchlänge von 50 Millimetern und Metallschlauchverbindern an beiden Enden. Einpressen und Verbinden auf jeden der sechs Betätigungsfinger und in den Schneckeneinlauf.

Positionieren Sie nun den Chip unter der Optik. Achten Sie darauf, die Verbindungen am Chip befestigt zu lassen, da sich das PDMS bei wiederholten Manipulationen schnell abnutzt. Es ist wichtig, dass der PDMS-Aktuator und die Schläuche, die den Chip mit dem Luftbehälter verbinden, ordnungsgemäß abgedichtet sind, um eine gute chromatische Betätigung der Membran zu gewährleisten.

Prüfen Sie vor dem Verladen der Tiere, ob der Mikrofluidik-Chip auf Druckverlust hinweist. Messen Sie die Auslenkung der Membran, indem Sie mehrere Betätigungszyklen mit dem gewünschten Druck durchführen. Vergleichen Sie dann die quantitativen Werte mit theoretischen Vorhersagen.

Wenn die Messwerte nicht den Erwartungen entsprechen, prüfen Sie, ob die Schläuche oder Schlauchanschlüsse undicht sind. Das PDMS kann aufgrund eines alternativen Verhältnisses von Basispolymer und Härter auch eine andere Elastizität aufweisen, oder die PD-Masse könnte alt und übermäßig vernetzt sein. Habe alterssynchronisierte C.elegans für junge Erwachsene oder Erwachsene am ersten Tag vorbereitet, wie sie von Porta-de-la-Riva und Co. in ihrer Jove-Publikation aus dem Jahr 2012 beschrieben werden.

Wählen Sie nun zwei bis fünf junge Erwachsene oder einen Tag alte Hermaphroditen. Die Auswahl von Tieren in der richtigen Größe ist entscheidend. Kleine Tiere werden nicht im Kanal eingeklemmt, und zu große Tiere sind schwer zu entfernen und können das Gerät verstopfen.

Ziehen Sie die gepflückten Würmer in einen Tropfen gefiltertes M9. Ziehen Sie sie dann mit einer Ein-Milliliter-Spritze in ein Schlauchstück, ohne sie in den Spritzenkörper selbst zu ziehen. Verbinden Sie als Nächstes den Schlauch mit der Verbindung am Schneckeneinlass des Chips. Aktivieren Sie dann die Schwerkraftströmung, indem Sie das Ventil zum Behälter öffnen und die Pumpe starten.

Beobachten Sie nun den Fangkanal bei vierfacher Vergrößerung und schieben Sie die Tiere vorsichtig in das Gerät. Nachdem Sie die Tiere in die Wartekammer geladen haben, befördern Sie eines der Tiere mit dem Kolben vorsichtig nach vorne in den Fangkanal, so dass sein Kopf in die sich verjüngende Form des Kanals eintritt. Wenn der Wurm nicht den gesamten Querschnitt des Kanals von der Nase bis zum Ende des Körpers ausfüllt, entfernen Sie den Wurm.

Oft gehen zu kleine Würmer direkt durch den Chip, ohne gefangen zu werden. Wenn ein Tier, das sich im Fangkanal verfangen hat, entfernt werden muss, drücken Sie einfach den Kolben der Spritze, bis der Wurm aus dem Kanal verschwindet, und laden Sie dann einen neuen Wurm. Sobald ein Wurm richtig geladen ist, wechseln Sie in den Floreszenzmodus und erhöhen Sie die Vergrößerung.

Um eine Sättigung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Sie die Anregungsintensität basierend auf der Fluoreszenzintensität anpassen. Prüfen Sie, ob der Neurit eines Neurons von Interesse quer über die Membran eines der Aktuatoren liegt. Dieser Aktuator muss sich auch vor dem Zellkörper des Neurons befinden.

Wenn nicht, stellen Sie die Position des Tieres ein, indem Sie am Kolben ziehen oder drücken. Wenn das nicht hilft, entfernen Sie den Wurm und laden Sie einen neuen. Wenn es eine Autofluoreszenz um das Neuron herum gibt, ersetzen Sie den Wurm.

Sobald ein Wurm richtig geladen ist, konzentrieren Sie sich auf den Zellkörper des interessierenden Neurons, bestimmen Sie dann, welcher Aktuator sich der Chip auf seiner vorderen Seite befindet, und verbinden Sie diesen Aktuator über die zugehörige Verbindung mit der programmierbaren Druckpumpe. Wenn das Experiment die Messung des Abstands zwischen dem Aktuator und dem Neuron erfordert, passen Sie beide in das Sichtfeld ein, wobei die Kanalwand parallel zum oberen und unteren Bildrand verläuft. Definieren Sie als Nächstes ein Druckprotokoll mit der programmierbaren Druckpumpe.

Beginnen Sie immer mit mindestens 50 Bildern bei null Kilopascal, um eine Basislinie zu definieren. Programmieren Sie dann die Stimuluswellenform und den Druck. Führen Sie nun das Bildgebungs- und Druckprotokoll aus.

Während der Aufzeichnung muss das Neuron von Interesse der hellste Punkt in einem 10-Quadratpixel-Bereich sein. Er darf sich in zwei aufeinanderfolgenden Bildern nicht mehr als 10 Pixel verschieben und muss im Sichtfeld bleiben. Während der Aufzeichnung können Sie Änderungen der Fluoreszenzintensität beobachten, wenn sich der Druck und die Aktuatoren ändern.

Dies deutet auf eine erfolgreiche Stimulation der Neuronen hin. Zwischen den Stimuli sollten 10 Sekunden bei einem konstanten Druck von null Kilopascal liegen. Es ist möglich, Signale von mehreren Neuronen im Sichtfeld gleichzeitig aufzuzeichnen, solange diese während der gesamten Aufnahme durch mindestens 10 Pixel getrennt sind.

Um die Würmer für weitere Untersuchungen aufzubewahren, trennen Sie die Auslässe des Späns in Richtung Schwerkraftströmung und Abfallbehälter. Drücken Sie dann vorsichtig auf den Kolben, bis der gesamte Wurm durch den Fangkanal in den Strömungskanal gedrückt wird, und drücken Sie den Kolben weiter, bis das Tier in einem Tröpfchen außerhalb des Chips erscheint. Trennen Sie nun die Spritze vom Schlauch und saugen Sie den Wurm im Tröpfchen auf eine Agarplatte ab.

Um eine Schnecke im Kanal zu entfernen und zu opfern, drücken Sie den Kolben, bis die gesamte Schnecke durch den Fangkanal in den Strömungskanal gedrückt wird. Dann fließt die Schnecke aus dem Chip in den Abfallbehälter. Nach dem Einrichten des Mikrofluidik-Chips wurde die Auslenkung der Membran getestet.

Die gemessenen Werte waren reproduzierbar mit geringfügigen Schwankungen von nicht mehr als einem Mikrometer bei einem Druck von 450 Kilopascal. Nach dem Einführen der Würmer in den Einlass des Chips wurde den sechs Aktuatoren die Haut eines einzelnen Tieres im Fangkanal präsentiert. Bei dieser Bauweise kann das PLM-Neuron in der Regel nicht vollständig immobilisiert werden, so dass es sich frei lateral und vertikal bewegen kann.

Obwohl eine erfolgreiche Aktivierung von PLM-Neuronen möglich ist, ist die Aufzeichnung von Kalziumtransienten von ihnen aufgrund der Schwanzbewegung schwierig. Sobald das Tier an Ort und Stelle war, wurde es mit einem der sechs Aktuatoren stimuliert, die so positioniert waren, dass sie mechanische Stimuli an jeden der sechs TRNs abgaben. Einer der drei verschiedenen Zwei-Sekunden-Stimuli wurde präsentiert.

Ein Halten bei 275 Kilopascal, eine Rampe auf 275 Kilopascal oder ein Summen, das aus einem 75-Kilopascal 10-Hertz-Sinus besteht, der mit dem 275-Kilopascal-Schritt überlagert wird. 10-Sekunden-Lücken ohne Druck trennen die Reize. Druckrampen und Druckstufen aktivierten TRNs nur, wenn die Stimuli einen Druck über 400 Kilopascal erreichten, während die Buzz-Stimuli alle TRN robust aktivierten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von fünf Minuten pro Wurm durchgeführt werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine schlechte Abdichtung zwischen dem Chip und dem Deckglas oder zwischen dem Chip und den Verbindungsleitungen dazu führt, dass das Gerät undicht wird und ausfällt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Spannungsbildgebung oder die gezielte Abgabe mechanischer Reize an verschiedene Neuronen durchgeführt werden, um die mechanische Reaktion von Nozizeptoren zu charakterisieren.

Da die Tiere nach diesem Verfahren geborgen werden können, könnte die Technik auch verwendet werden, um nach Mutanten zu suchen, die in ihrer Reaktion auf mechanische Reize defekt sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit komprimierten Gasen und Chemikalien äußerst gefährlich sein kann. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzkleidung und das Arbeiten in Abzügen, wenn dies erforderlich ist, um diese Gefahren zu vermeiden.