Name: μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Lernen Sie die µTongue-Methode zur funktionellen Bildgebung von Geschmackszellen in vivo bei lebenden Mäusen mit intakter Durchblutung und neuronalen Verbindungen. Diese mikrofluidische Plattform ermöglicht präzise funktionelle Analysen unter physiologischen Bedingungen.

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Diese Arbeit wurde vom Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), dem von der koreanischen Regierung finanzierten Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) (NRIT) (Nr. 2019M3A9E2061789) und von der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (Nr. 2019M3E5D2A01058329). Wir danken Eunsoo Kim und Eugene Lee für ihre technische Unterstützung.

Alle chirurgischen Eingriffe wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Sungkyunkwan University und der Seoul National University genehmigt.
1. Herstellung von Lösungen: künstlicher Speichel und Geschmacksstoffe
<ol><li>Künstlichen Speichel durch Auflösen von 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mMK2HPO4, 0,12 mM KH2PO4und 1,8 mM HCl in destilliertem Wasser (>1 L) vorbereiten und den pH-Wert der Lösung auf 7 einstellen (siehe Materialtabelle)12.</li>
	<li>Bereiten Sie Tastantien wie sauer vor: 10 mM Zitronensäure; salzig: 400 mM NaCl, optional mit 50 μM Amilorid; süß: 40 mM Acesulfam K; bitter: eine Mischung aus 5 mM Chinin, 5 mM Denatonium und 20 μM Cycloheximid, indem die Geschmackschemikalie im künstlichen Speichel, der in Schritt 1.1 hergestellt wird, gelöst wird.</li>
</ol>2. Herstellung des mikrofluidischen Systems
HINWEIS: Tastants wurden mit einem unter Druck stehenden mehrkanaligen fluidischen Verabreichungssystem an die Mauszunge abgegeben (siehe Abbildung 1 und Materialtabelle).
<ol><li>Füllen Sie die Reservoirs des unter Druck stehenden Durchflussperfusionssystems mit dem künstlichen Speichel und den Geschmacksstoffen.</li>
	<li>Schließen Sie die Druckluftleitung an den Reglereingang an und stellen Sie den Luftdruck im fluidischen Fördersystem zwischen 30 und 50 psi ein.</li>
	<li>Stellen Sie den Ausgangsdruck des Reglers auf 0,4 psi ein und prüfen Sie, ob unter diesem Druck Flüssigkeit aus dem Rohr kommt.</li>
	<li>Schließen Sie den Verteiler von den Reservoirs an den Eingangsport von μTongue an.</li>
	<li>Schließen Sie den Ausgangsanschluss von μTongue an eine Spritzenpumpe an und entnehmen Sie Flüssigkeit mit ~300 μL∙min-1, um den stationären Zustand herzustellen. Beobachten Sie das konstante Volumen eines hängenden Tröpfchens unter der μTongue. Passen Sie den Wert des Einstellparameters in Abhängigkeit von der Probenhöhe an.</li>
	<li>Trennen Sie die Druckluftleitung und stoppen Sie die Spritzenpumpe, bis Protokollschritt 3 abgeschlossen ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Maus auf die In-vivo-Bildgebung (Abbildung 2).
HINWEIS: Alle tierexperimentellen Vorbereitungen wurden tagsüber unter aseptischen Bedingungen auf einer Laborwerkbank durchgeführt.
<ol><li>Mausanästhesie<ol>
<li>Bereiten Sie eine 7 Wochen alte oder ältere Maus beiderlei Geschlechts vor. Verwenden Sie eine genetisch veränderte Mauslinie, die kalziumempfindliche Fluoreszenzproteine in den Geschmackszellen exprimieren.</li>
		<li>Die Maus wird zur Anästhesie zurückgehalten. Eine Mischung aus 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin wird intraperitoneal in die Maus injiziert13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TRITC-Dextran (500 kDa) in 2,5% W/V Phosphatpuffersalzlösung wird intravenös über einen retroorbitalen Weg in die Maus eingelassen, um die Blutzirkulation während einer Bildgebungssitzung zu beobachten.</li>
	<li>Befestigen Sie einen Kopffixierer am Mausschädel, um Bewegungsartefakte zu minimieren.<ol>
<li>Der Mauskopf wird mit 70% ETOH besprüht, während die Maus in Rückenlage gebracht wird. Heben Sie die Kopfhaut leicht mit einer Zette an und schneiden Sie ca. 7 mm2 mit einer Schere ab.</li>
		<li>Reinigen Sie die Haare um die Kopfhaut, entfernen Sie das Periost unter der Haut, tragen Sie einen sofortigen Klebstoff auf den Schädel auf und befestigen Sie einen maßgeschneiderten Kopffixierer.</li>
		<li>Nachdem der Sofortkleber ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnkleber um den Kopffixierer auf und beleuchten Sie mit einem blauen Licht, um den Zahnkleber zu verfestigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Mauszunge auf die untere Einheit von μTongue.<ol>
<li>Befestigen Sie die Unterlippe der Maus mit einem Sofortkleber an der Unteren Einheit von μTongue.</li>
		<li>Setzen Sie die Maus auf die Platine (Mausvorbereitungsplatine in Abbildung 1B)und setzen Sie die untere Einheit der μTongue an die Pfosten (μTongue Hold-Pfosten in Abbildung 1B). Stellen Sie sicher, dass die Löcher am Rand der Bodeneinheit am Pfosten ausgerichtet sind.</li>
		<li>Ziehen Sie den Mauskopffixierer an der Kopffixiererhalterung am Board fest. Passen Sie dann den Abstand zwischen dem Mauskopf und dem Gerät an. Drehen Sie den Mauskopf mit dem Kopffixiererhalter sanft um ca. 45°. Dieser Prozess verhindert den physischen Kontakt der Mausnase mit Mikroskopobjektiv.</li>
		<li>Ziehen Sie die Mauszunge vorsichtig mit einer Kunststoffpinzette und befestigen Sie die bauchige Seite der Zunge an der Oberseite der unteren Einheit der μTongue. Wischen Sie dann die Oberfläche der Mauszunge mit einem nassen Wattestäbchen ab.</li>
		<li>Tränken Sie ein Stück Papier in den künstlichen Speichel und legen Sie es auf die freiliegende Oberfläche der Mauszunge, um einen nassen Zustand zu erhalten.</li>
		<li>Legen Sie die gekrümmten Unterlegscheiben auf die Pfosten, die beide Enden des unteren Teils von μTongue halten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie das Mauspräparat auf den Mikroskopstand. Positionieren Sie die freiliegende Mauszunge unter der ungefähren Mitte des Objektivbereichs des Mikroskops. Achten Sie darauf, nicht vom Dynamikumfang der Bühne abzuweichen. Dann ziehen Sie das Mausbrett auf der Bühne mit Schrauben fest.</li>
	<li>Legen Sie das Heizkissen unter den Mauskörper und halten Sie die Temperatur bei 36,5 °C-37,5 °C. Überwachen Sie die Körpertemperatur der Maus mit einem Temperatursensor und steuern Sie die Temperatur des Heizkissens über ein Feedback-Signal des Temperatursensors.</li>
	<li>Drehen Sie ein dünnes Stück Papier und legen Sie es in den Mund der Maus, um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Luftröhre der Maus gelangt.</li>
	<li>Entfernen Sie das nasse Gewebe von der Mauszunge und legen Sie die vorbereitete μTongue auf die Mauszunge. Legen Sie einen mikrofluidischen Kanal auf die Zunge und passen Sie ihre Position an, um die Oberfläche der Zunge durch das Bildfenster zu beobachten.</li>
	<li>Befestigen Sie die μTongue, indem Sie beide Enden mit minimalem Druck vorsichtig anschrauben.</li>
</ol>4. Bilderfassung
<ol><li>Schalten Sie den 920 nm Zwei-Photonen-Laser und das Mikroskop vor dem Gebrauch ein.</li>
	<li>Montieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv (16x, NA 0,80 oder 25x, NA 1.1) am Mikroskop. Lassen Sie das destillierte Wasser auf das Bildfenster der μTongue fallen und tauchen Sie das Objektiv ein.</li>
	<li>Schalten Sie im Kameramodus das Licht mit quecksilberfarbener Lampe ein und beleuchten Sie die Oberfläche der Zunge.</li>
	<li>Durch Einstellen der Z-Achse durchsuchen Sie das autofluoreszierende Signal der filiformen Papillen, um die ungefähre Fokusebene zu finden. Suchen Sie dann mit dem X- und Y-Einstellknopf eine Geschmacksknospen.</li>
	<li>Wechseln Sie in den Multiphotonen-Modus. Stellen Sie die Bildaufnahmebedingungen wie folgt ein: Anregungswellenlänge: 920 nm; Emissionsfiltersatz: 447/60 nm, 525/50 nm und 607/70 nm; bidirektionaler Raster-Scan-Modus, Rahmengröße: 512 x 512.</li>
	<li>Passen Sie die X- und Y-Positionen an, um die Geschmacksknospen in der Mitte des Bildfensters zu platzieren.</li>
	<li>Durchsuchen Sie die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, in etwa zwei Dritteln Höhe der Geschmacksknospen. Visualisieren Sie die Durchblutung durch TRITC-Dextran (500 kDa) Injektion aus Protokollschritt 3.2. Wenn der Blutfluss verstopft, lösen Sie die Befestigungsschrauben leicht, um den Blutfluss zu ermöglichen.</li>
	<li>Stellen Sie die Z-Achse ein und finden Sie die Z-Ebene der Geschmacksknospen, die eine ausreichende Anzahl von Geschmackszellen enthält.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Calcium-Bildgebung mit 2-6 Hz für 80 s fort. Bieten Sie eine Geschmackslösung von 20 s, indem Sie das Reservoir des fluidischen Systems nach Beginn der Bildgebung einschalten. Nach 20 s Geschmacksstimulation schalten Sie das Reservoir wieder auf künstlichen Speichel um.</li>
	<li>Nachdem die sequenzielle Bildgebung abgeschlossen ist, warten Sie ca. 3-4 Minuten bis zur nächsten Bildgebungssitzung. Lassen Sie den künstlichen Speichel zur Mauszunge fließen, um das Tastant-Remanent aus der vorherigen Bildgebungssitzung wegzuwaschen. Je nach Design des Experiments wiederholen Sie die Sitzung nach Bedarf.</li>
	<li>Wenn die In-vivo-Kalziumbildgebung abgeschlossen ist, euthanasieren Sie die Maus nach dem IACUC-Verfahren. Die Maus unter Betäubung wird in der CO2-Kammer geopfert. HINWEIS: Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenquetschreflex. Während einer bildgebungsgebenden Sitzung sollte konsequent künstlicher Speichel aus den Reservoirs bereitgestellt werden. Wenn Blasen am Abbildungsfenster der μTongue auftreten, entfernen Sie die Blasen, indem Sie sie mit starkem Flüssigkeitsdruck durch den Eingang oder den Ausgang der μTongue drücken.</li>
</ol>5. Bildanalyse (Abbildung 3)
<ol><li>Bildkonvertierung<ol>
<li>Öffnen Sie die Rohbilddateien mit Fiji14 oder einer ähnlichen Bildanalysesoftware.</li>
		<li>Konvertieren Sie die Bilddatei in eine RGB-Stack-Datei, um den NPL Bud Analyzer-Code zu verwenden.<ol>
<li>Bild > Farb- > Geteilte Kanäle</li>
			<li>
Bild > Farb- > Kanäle zusammenführen und wählen Sie das Bild aus Schritt 5.2.1 aus.</li>
			<li>Bild > Farb->-Stack zu RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildregistrierung HINWEIS: Verwenden Sie den benutzerdefinierten Code für die Datenanalyse. Bitte beachten Sie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>Führen Sie den Codenamen Taste_GUI.maus. Ein GUI-Fenster mit dem Namen NPL Bud Analyzer wird angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Analyse in der oberen rechten Ecke und laden Sie dann das konvertierte Bild aus Schritt 5.1. Stellen Sie die Bildrate über dem geladenen Bild ein.</li>
		<li>Zeichnen Sie den Interessenbereich (ROI) über das geladene Bild zur Registrierung. Doppelklicken Sie auf den ausgewählten ROI und eine automatisch berechnete Registrierung beginnt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erhalten Sie die relativen Änderungen der Fluoreszenzintensität (ΔF/F)<ol>
<li>Gehen Sie zurück zum NPL Bud Analyzer-Fenster, um das registrierte Bild aus Schritt 5.2 automatisch anzuzeigen. Wenn der Benutzer bereits über eine Reg-Datei verfügt, klicken Sie auf die Schaltfläche Daten laden und wählen Sie die _reg.tif Datei aus.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche CIRCLE oder POLYGON und positionieren Sie den ROI der Geschmackszelle über dem Geschmacksknospenbild.</li>
		<li>Diese stellt die rohe Fluoreszenzintensität unddie Calciumspur (ΔF/F)der ausgewählten Geschmackszelle automatisch unter dem Geschmacksknospenbild dar.</li>
		<li>Klicken Sie auf Save Trace, um die Calciumspur (ΔF/F) auf der rechten Seite der GUI anzuzeigen, während der ROI über dem Geschmacksknospenbild angezeigt wird. Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2-5.3.4, bis die ROI-Auswahl abgeschlossen ist. HINWEIS: Klicken Sie auf die Schaltfläche Trace löschen, wenn der ROI falsch ausgewählt ist, um den zuletzt ausgewählten ROI und Den Calcium-Trace zu eliminieren.</li>
		<li>Nachdem die ROI-Auswahl abgeschlossen ist, schreiben Sie den Dateinamen in die rechte untere Ecke und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um die ΔF/F Calcium-Spur als .xls Format und das Tase-Bud-Bild mit ROIs in einem .bmp Format zu exportieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse der Calciumspur<ol>
<li>Analysieren Sie die aus Schritt 5.3 erhaltene Kalziumspur. Bedenken Sie, dass Geschmackszellen auf Tastant reagiert haben, wenn die Fluoreszenzintensität um mehr als zwei Standardabweichungen der Baseline ansteigt, nachdem das Tastant4abgegeben wurde, und p-Wertekleiner als 0,01 sind, wobei gepaarte oder ungepaarte t-Tests10verwendet werden.</li>
		<li>Betrachten Sie die Geschmackszelle als Responderzelle, wenn sie mehr als zweimal von drei Versuchen (~ 60%) auf ein bestimmtes Tastant reagiert15.</li>
		<li>Erhalten Sie die repräsentativen Calciumspuren durch Mittelung einzelner Calciumspuren, die aus Schritt 5.4.1 gewonnen wurden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen: J. Han und M. Choi sind Erfinder der in diesem Artikel beschriebenen patentierten μTongue-Technologie, und das μTongue-System ist über SciTech Korea kommerziell erhältlich.

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Anwendung von μTongue auf die Untersuchung funktioneller Aktivitäten von Geschmackszellen in vivo beschrieben. In diesem Protokoll wird die funktionelle Bildgebung an den Geschmackszellen mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren durchgeführt. Neben der Verwendung transgener Mäuse kann die elektrophoretische Belastung von Calciumfarbstoffen (oder Spannungsmessfarbstoffen) auf die Geschmackszellen eine alternative Option sein.
Alle Geschmacksl...

Das intravitale Fluoreszenzmikroskop wird häufig verwendet, um die raumzeitliche Dynamik an lebenden Geweben zu untersuchen. Forscher entwickeln schnell genetisch kodierte Sensoren, die spezifische und empfindliche Umwandlungen der biologischen Prozesse in Fluoreszenzsignale liefern - die mit fluoreszierenden Mikroskopen, die weit verbreitet sind, leicht aufgezeichnet werden können1,2. Obwohl die meisten inneren Organe bei Nagetieren mit dem Mikroskop untersucht wurden, war seine erfolgreiche Anwendung auf der Zunge noch nicht erfolgreich3.
Frühere Studien zur Calciumbildgebung von Geschmackszellen wurden ex vivo durch Dünnschnitt eines Zungengewebes durchgeführt, um zirkumvallate Geschmacksknospen zu erhalten4,5,6 oder durch Abziehen des Geschmacksepithels, um fungiforme Geschmacksknospen zu erhalten7,8. Die Vorbereitung dieser Proben war zwangsläufig invasiv, so dass die natürlichen Mikroumgebungen wie Nerveninnervation, Permeabilitätsbarrieren und Durchblutung weitgehend gestört waren. Das erste intravitalen Zungenbildgebungsfenster wurde 2015 von Choi et al. berichtet, aber eine zuverlässige funktionelle Aufzeichnung war aufgrund der Bewegung und der optischen Artefakte, die durch fluidische Tastantreize verursacht wurden, nicht erreichbar9.
Vor kurzem wurde die Mikrofluidik-auf-einer-Zunge (μTongue)eingeführt 10. Dieses Gerät integriert ein mikrofluidisches System mit einem Bildgebungsfenster auf der Mauszunge. Durch das Erreichen eines quasi-stationären Flusses von Tastantreizen während des gesamten Bildgebungszeitraums konnten Artefakte aus fluidischen Bewegungen minimiert werden (Abbildung 1). Der Eingangsanschluss wird von einer Reihe von Mehrkanal-Druckreglern gespeist, während der Ausgangsanschluss an eine Spritzenpumpe angeschlossen ist, die 0,3 ml / min hält. Zusätzlich wurden optische Artefakte, die durch den Unterschied in den Brechungsindizes von Tastantlösungen verursacht wurden, durch ratiometrische Analyse minimiert, die einen calcium-unempfindlichen Indikator (tdTomato) sowie den Kalziumindikator (GCaMP6)11einführte. Dieses Design bot eine mikroskopische Stabilität der Geschmackszellen in vivo auch bei abruptem Umschalten zwischen fluidischen Kanälen. Folglich implementieren die μTongue ein zuverlässiges funktionelles Screening mehrerer Tastantien auf die Mausgeschmacksknospen in vivo.
In diesem Protokoll werden die experimentellen Verfahren zur Calciumbildgebung der Mauspilzformen Geschmacksknospen in vivo unter Verwendung von μTongue ausführlich erläutert. Zunächst wird die Herstellung von künstlichem Speichel und Geschmackslösungen beschrieben. Zweitens wird der Aufbau des mikrofluidischen Systems eingeführt, um den quasi-stationären Fluss zu erreichen. Drittens werden die Verfahren zur Montage der Mauszunge auf der μTongue zur Bildaufnahme umrennt. Schließlich wird jeder Schritt für die Bildanalyse, einschließlich der Korrektur von lateralen Bewegungsartefakten und der Ratiometrie, spezifiziert. Dieses Protokoll kann leicht an jedes Forschungslabor mit einer Mauseinrichtung und einem Zwei-Photonen-Mikroskop oder gleichwertigen Geräten angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Acesulfam K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhafte</td></tr><tr><td>Calciumchloridlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhafte</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhaftes</td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhaft</td></tr><tr><td>denatonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhaft</td></tr><tr><td>Zahnkleber</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Tierpräparation</td></tr><tr><td>Bild J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Datenanalyse</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhaft</td></tr><tr><td>Sofortklebstoff</td><td>Loctite</td><td>Loctite 4161, Henkel</td><td>Tierpräparat</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td></td><td>Ketamin Yuhan</td><td>Ketamin 50</td><td>Tierpräparat</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Künstlich Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Datenanalyse</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>Mutiphoton Mikroskop</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp; Bergamo II</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Fluidische Steuerung</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td></td></tr><tr><td>PH-Messgerät</td> für fluidische Steuerung <td>Thermowissenschaftliches</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Künstlicher Speichel / Geschmack</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhaftes</td></tr><tr><td>Chinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Künstlicher Speichel / schmackhafte</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Fluidische Steuerung</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Tierpräparat</td></tr><tr><td>Ultraschneller Faserlaser</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer Korea</td><td>Rompun</td><td>Tierpräparat</td></tr></tbody></table>

μtongue: eine mikrofluidikbasierte funktionelle bildgebungsplattform für die zunge in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Die intravitale Fluoreszenzmikroskopie ist ein Werkzeug, das häufig verwendet wird, um die mehrzellige Dynamik bei einem lebenden Tier zu untersuchen. Es wurde jedoch nicht erfolgreich im Geschmackssinnsorgan eingesetzt. Durch die Integration der Mikrofluidik in das intravitaale Zungenbildgebungsfenster liefert die μTongue zuverlässige funktionelle Bilder von Geschmackszellen in vivo unter kontrollierter Exposition gegenüber mehreren Tastantien. In diesem Artikel wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung des μTongue-Systems vorgestellt. Es gibt fünf Unterabschnitte: Vorbereitung von Lösungen, Aufbau eines mikrofluidischen Moduls, Probenmontage, Erfassung funktionaler Bilddaten und Datenanalyse. Einige Tipps und Techniken zur Lösung der praktischen Probleme, die bei der Verwendung der μTongue auftreten können, werden ebenfalls vorgestellt.

Die Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus wurde verwendet, um ein Geschmacksknospenbild zu erhalten. Die Oberfläche der Mauszunge war mit autofluoreszierenden filiformen Papillen bedeckt. Geschmacksknospen sind spärlich über die Oberfläche der Zunge verteilt (Abbildung 4A). Die Bilder der Geschmacksknospen und ihrer Struktur wurden mit drei verschiedenen Filterdetektoren aufgenommen. Mit dem 607/70 nm Filterset wurde das tdTomato-Signal aus den Geschmackszellen für die ratiometrische Analyse erhalten (...

Der Artikel stellt das μTongue-Gerät (Microfluidics-on-a-Tongue) für die funktionelle Geschmackszellbildgebung in vivo vor, indem die Mikrofluidik in ein intravitalen Bildgebungsfenster auf der Zunge integriert wird.

μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, die Funktionen von Geschmackszellen in einer natürlichen Mikroumgebung mit neuronalen Verbindungen und intakter Blutzirkulation zu beobachten. Mit dieser Technik kann die Zell-zu-Zell-Kommunikation in vivo untersucht werden. Füllen Sie zunächst die Reservoirs des unter Druck stehenden Durchflussperfusionssystems mit künstlichem Speichel und Geschmacksstoffen.Schließen Sie die Druckluftleitung an den Reglereingang an und stellen Sie den Luftdruck im fluidischen Fördersystem auf 30 bis 50 Pfund pro Quadratzoll ein. Stellen Sie den Ausgangsdruck des Reglers auf 0,4 Pfund pro Quadratzoll ein und überprüfen Sie, ob Flüssigkeit aus dem Rohr ausströmt. Verbinden Sie den Verteiler von den Reservoirs mit dem Eingangsanschluss der Mikrozunge, verbinden Sie dann den Ausgangsanschluss der Mikrozunge mit einer Spritzenpumpe und ziehen Sie Flüssigkeit mit etwa 300 Mikrolitern pro Minute ab, um einen stationären Zustand herzustellen.Vergewissern Sie sich, dass das Volumen des unter der Mikrozunge hängenden Tröpfchens konstant bleibt, und stellen Sie den Luftdruck und die Durchflussrate ein, um die gewünschte Probenhöhe zu erhalten. Sobald das mikrofluidische System eingerichtet ist, trennen Sie die Druckluftleitung und schalten Sie die Spritzenpumpe aus, bis die Maus für die In-vivo-Bildgebung vorbereitet ist. Nach der Verabreichung der Anästhesie an die Maus intravenös TRITC-Dextran über einen retroorbitalen Weg injizieren, um die Blutzirkulation während der Bildgebung zu beobachten.Wenn die Maus in Rückenlage gebracht wird, sprühen Sie 70% Ethanol auf den Kopf. Verwenden Sie eine Zette, um die Kopfhaut leicht anzuheben, und verwenden Sie dann eine Schere, um etwa sieben Quadratmillimeter Haut abzusetzen. Nachdem Sie die Haare um die Kopfhaut gereinigt haben, entfernen Sie das Periost unter der Haut und tragen Sie einen sofortigen Klebstoff auf den Schädel auf.Befestigen Sie dann den kundenspezifischen Kopffixierer. Sobald der Sofortkleber gehärtet ist, tragen Sie Zahnkleber um den Kopffixierer auf und erstarren Sie ihn durch Beleuchtung mit blauem Licht. Mit Sofortkleber die Unterlippe der Maus auf die untere Einheit der Mikrozunge kleben, dann die Maus auf die Mausvorbereitungsplatte legen und die Untereinheit an der Mikrozunge an den Haltepfosten befestigen, indem die Löcher am Rand der Mikrozunge mit den Pfosten ausgerichtet werden.Ziehen Sie den Mauskopffixierer an der Kopffixiererhalterung an der Platine fest und passen Sie den Abstand zwischen dem Mauskopf und dem Gerät an. Drehen Sie dann mit dem Kopffixiererhalter den Mauskopf sanft um ca. 45 Grad. Nachdem Sie die Maus am Brett bewischt haben, verwenden Sie eine Kunststoffpinzette, um die Zunge sanft zu ziehen.Befestigen Sie dann mit Sofortkleber die ventrale Seite der Zunge an der Oberseite der unteren Einheit der Mikrozunge. Um die Zunge feucht zu halten, wischen Sie die Oberfläche mit einem nassen Wattestäbchen ab und legen Sie dann ein in künstlichem Speichel getränktes Stück Gewebe auf die freiliegende Oberfläche der Zunge. Legen Sie die gekrümmten Unterlegscheiben auf die Pfosten, halten Sie den unteren Teil der Mikrozunge und bewegen Sie dann das Mauspräparat in den Mikroskopstadium.Positionieren Sie die freiliegende Zunge der Maus unter der ungefähren Mitte des Objektivbereichs des Mikroskops, achten Sie darauf, nicht vom Dynamikbereich der Bühne abzuweichen, und ziehen Sie dann die Schrauben fest, um das Mausbrett fest auf der Bühne zu befestigen. Legen Sie ein Heizkissen unter die Maus, um ihre Körpertemperatur zwischen 36,5 und 37,5 Grad Celsius zu halten. Um zu verhindern, dass Flüssigkeit in die Luftröhre der Maus gelangt, legen Sie ein dünnes Stück verdrehtes Papier in den Mund der Maus, entfernen Sie dann das nasse Gewebe auf der Oberfläche der Zunge und legen Sie die vorbereitete Mikrozunge auf die Mauszunge, so dass die Oberfläche der Zunge durch das Bildfenster sichtbar ist.Befestigen Sie die Mikrozunge, indem Sie beide Enden mit minimalem Druck vorsichtig verschrauben. Um mit der Aufnahme von Bildern zu beginnen, öffnen Sie die Mikroskopsoftware und schalten Sie dann den 920 Nanometer-Zwei-Photonen-Laser ein. Montieren Sie das Wasserimmersionsobjektiv auf dem Mikroskop, senken Sie das Objektiv dann auf das Abbildungsfenster der Mikrozunge und tauchen Sie das Objektiv ein.Beleuchten Sie im Kameramodus die Oberfläche der Zunge, indem Sie das blaue Licht einer Quecksilberlampe einschalten. Um die ungefähre Fokusebene zu finden, stellen Sie die Z-Achse ein und suchen Sie nach einem Autofluoreszenzsignal aus den filiformen Papillen. Suchen Sie dann mit dem X- und Y-Einstellknopf eine Geschmacksknospen.Wechseln Sie in den Multiphotonenmodus und stellen Sie dann die Anregungswellenlänge, den Emissionsfiltersatz, den Scanmodus und die Rahmengröße für die Bildaufnahme ein. Mit der Geschmacksknospen in der Mitte des Bildgebungsfensters lokalisieren Sie die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, auf etwa zwei Dritteln der Höhe der Geschmacksknospen und visualisieren Die Durchblutung. Wenn der Blutfluss verstopft ist, lösen Sie die Befestigungsschrauben leicht, um den Blutfluss wieder aufzunehmen.Stellen Sie die Z-Achse ein, um die Z-Ebene einer Geschmacksknospen zu finden, die eine ausreichende Anzahl von Geschmackszellen enthält, und fahren Sie dann 80 Sekunden lang mit der Kalziumbildgebung bei zwei bis sechs Hertz fort. Schalten Sie nach Beginn der Bildgebung das Reservoir des fluidischen Systems ein, um 20 Sekunden lang eine Geschmackslösung bereitzustellen. Nach 20 Sekunden Geschmacksstimulation schalten Sie das Reservoir wieder auf künstlichen Speichel um.Warten Sie während der Bildgebung etwa drei bis vier Minuten zwischen den Sitzungen und liefern Sie konsequent künstlichen Speichel, um die Zunge feucht zu halten und das von der vorherigen Sitzung verbleibende Tastant wegzuwaschen. Die Zungenoberfläche der Pirt-GCaMP6f-tdTomato Maus ist mit autofluoreszierenden filiformen Papillen und spärlich verteilten Geschmacksknospen bedeckt. Die filiformen Papillen in Gelb werden mit einem Photodetektor bei 500 bis 550 Nanometern eingefangen und können von der Oberfläche der Zunge bis zu etwa 25 Mikrometer Tiefe beobachtet werden.Die vom 500 bis 550 Nanometer Filter detektierten GCaMP-Signale in Grün und die tdTomato-Signale in Rot, die vom 607 bis 670 Nanometer Filter detektiert werden, repräsentieren die Geschmackszellen. Das tdTomato-Signal wird für die Analyse der Verhältnismetrik erhalten. Die Blutgefäße, die die Geschmacksknospen umgeben, werden mit dem 500 bis 550 Nanometer Filter im Kollagen-Bindegewebe erfasst, der die Geschmacksknospen strukturell unterstützt und mit dem 447 bis 460 Nanometer Filterset erfasst wird.In diesem repräsentativen Beispiel des In-vivo-Geschmacksscreenings mittels Calcium-Bildgebung wird jede Geschmackszelle durch gestrichelte Linien abgegrenzt. In dieser Studie reagierte Zelle 2 sowohl auf süße als auch auf Umami-Tastants. Und Zelle 3 reagierte sowohl auf niedrige als auch auf hohe Salzschmessantien.Keine der Zellen in dieser Geschmacksknospen reagierte auf saure Geschmäcker. Da der Zweck dieses Experiments darin besteht, die Zellfunktion des Geschmacks in der natürlichen Umgebung zu beobachten, ist es wichtig, die Fluoreszenzen beim Zubereitungsschritt in die Blutgefäße zu geben und ihre Zirkulation während des Experiments zu bestätigen.

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μTongue: Eine mikrofluidikbasierte funktionelle Bildgebungsplattform für die Zunge in vivo

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