Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Das übergeordnete Ziel dieser kombinierten analytischen Methodik ist es, Informationen darüber zu liefern, wie sekretorische Vesikel in Zellen auf eine physikalische Kraft, wie z. B. den extrazellulären osmotischen Druck, reagieren und wie Anpassungen dieser Organellen den Exozytoseprozess weiter beeinflussen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. wie sekretorische Vesikel direkt auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung oder auf eine medikamentöse Behandlung reagieren. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes besteht darin, direkte Auswirkungen auf den vesikulären Gehalt lebender Zellen zu überwachen und Veränderungen in ihrer reh-chemischen Freisetzung vor und nach der Behandlung der Exozytose zu unterscheiden.

Um eine flache Oberfläche der Scheibenelektrode zu erhalten, legen Sie die Elektrode in die Halterung einer Mikroschleifmaschine und schrägen Sie jede Kohlefaserelektrode in einem Winkel von 45 Grad ab. Markieren Sie anschließend die Kapillare als zukünftige Referenz, um zu zeigen, wie die Oberfläche der Scheibenelektrode in einem 45-Grad-Winkel positioniert wird, wenn die Elektrode für die Exozytosemessung in der Nähe von Zellen platziert wird. Um eine amperometrische Aufzeichnung an einzelnen Zellen durchzuführen, montieren Sie die frisch abgeschrägte und geprüfte Kohlefaser-Scheiben-Mikroelektrode in den Elektrodenhalter des Kopftisches, der mit einem Potentiostaten verwendet wird.

Platzieren Sie vor dem Gebrauch jede Kohlefaser-Mikroelektrode in einer Testlösung, um den Strom im Untersuchungszustand mit Hilfe der zyklischen Voltammetrie zu überwachen. Für einen zyklischen Voltammetrie-Scan wenden Sie eine Dreieckspotentialwellenform von minus 0,2 Volt bis positiv 0,8 Volt gegen eine Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode bei 100 Millivolt pro Sekunde an, um eine gute Reaktionskinetik zu gewährleisten. Für die amperometrische Aufzeichnung der Exozytose stellen Sie die Petrischale mit kultivierten chromaffinen Zellen in isotonischem Puffer auf ein inverses Mikroskop in einen Faradayschen Käfig.

Verwenden Sie einen Mikroskop-Heiztisch, um während der Zellexperimente eine Temperatur von 37 Grad Celsius aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie anschließend ein rauscharmes Patch-Clamp-Instrument, um ein konstantes Potential von positiven 700 Millivolt an die Arbeitselektrode anzulegen. Um die Exozytose von chromaffinen Zellen aufzuzeichnen, digitalisieren Sie das Signal bei 10 Kilohertz und wenden Sie einen internen Tiefpass-Bessel-Filter bei zwei Kilohertz an, um das aufgezeichnete Signal zu filtern.

Beachten Sie, dass die ovale Scheibenelektrode flach auf den Zellen und parallel zur Oberfläche der Petrischale platziert werden muss. Außerdem werden die Elektroden am selben Tag wie die Experimente abgeschrägt, um eine saubere Elektrodenoberfläche zu gewährleisten. Um die Zellexozytose zu stimulieren, positionieren Sie eine mit fünf Millimolar Bariumchloridlösung gefüllte Glaspipette in einem Abstand von mindestens 20 Mikrometern von der Zelle.

Wenden Sie dann einen fünfsekündigen Injektionsimpuls von fünf Millimolar Bariumchloridlösung auf die Zelloberfläche an, um die Zellexozytose zu stimulieren. Legen Sie die Stammpipette in die Lösung und stimulieren Sie die Zellexozytose, indem Sie einen Barium-Injektionsimpuls anlegen, während Sie die amperometrischen Stromtransienten etwa drei Minuten lang aufzeichnen. Um die exozytotischen Reaktionen unter isotonischen Bedingungen mit hypertonen Bedingungen zu vergleichen, inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in hypertoner Pufferlösung.

Wenden Sie danach einen Barium-Injektionsimpuls an, um die Exozytose zu stimulieren, und führen Sie eine dreiminütige amperometrische Aufzeichnung durch. Für die reversible Reaktion der Zellen inkubieren Sie die Zellen erneut für 10 Minuten in einer isotonischen Pufferlösung. Stimulieren Sie die Zellen durch Anlegen eines Barium-Injektionsimpulses und führen Sie eine dreiminütige Aufzeichnung der exozytotischen Reaktion durch.

Um die Elektroden für vesikuläre quantale Größenmessungen herzustellen, bereiten Sie eine Kohlefaserelektrode mit einem Durchmesser von fünf Mikrometern vor. Schneiden Sie unter einem Mikroskop mit einem Skalpell die Kohlefaser ab, die aus der Glasspitze herausragt, so dass nur noch 30 bis 100 Mikrometer übrig sind. Verwenden Sie eine Butanflamme, um eine flammgeätzte Spitze der Kohlefaserelektrode vorzubereiten.

Um eine gleichmäßig geätzte, zylindrisch geformte Elektrodenspitze zu erhalten, halten Sie die zylindrisch geformte Kohlefaserelektrode fest, während Sie sie drehen. Und legen Sie die Kohlefaser, die sich vom Glas erstreckt, in den blauen Rand der Butanflamme, bis die Spitze des Kohlenstoffs eine rote Farbe annimmt. Legen Sie die Elektrode nach dem Flammenätzen unter ein Mikroskop, um die Elektrodenspitze zu beurteilen.

Die Größe der geätzten Elektrodenspitze sollte einen Durchmesser von etwa 50 bis 100 Nanometern haben. Führen Sie anschließend die zylindrische Nanospitzen-Mikroelektrode drei Minuten lang in die Epoxidlösung ein, gefolgt von einem 15-sekündigen Eintauchen der Elektrodenspitze in die Acetonlösung. Dadurch kann das Epoxidharz den potenziellen Spalt zwischen der Kohlefaser und der isolierenden Gaskapillarwand abdichten.

Während das Aceton das Epoxidharz von der geätzten Oberfläche der Kohlefaserelektrode entfernt. Um das Epoxidharz auszuhärten, backen Sie die Elektroden über Nacht bei 100 Grad Celsius in einem Ofen. Testen Sie vor dem Gebrauch den stationären Strom jeder Kohlefaser-Mikroelektrode mit zyklischer Voltammetrie.

Verwenden Sie für Experimente nur Elektroden, die einen Plateaustrom von etwa 1,5 bis 2,5 Nanoampere aufweisen. Für intrazelluläre Amperometrie-Messungen legen Sie die Zellen unter das Mikroskop und verwenden Sie die gleichen experimentellen Einstellungen wie der Potentiostat. Verhindern Sie signifikante physische Schäden an der Zelle.

Führen Sie die zylindrische Nanotip-Mikroelektrode durch Zugabe einer sanften mechanischen Kraft in die Zelle ein. Gerade genug, um die Elektrode mit einem Mikromanipulator durch die Plasmamembran der Zelle in das Zytoplasma der Zelle zu schieben. Nach dem Einsetzen und mit der Zellmembran, die um die zylindrische Elektrode abgedichtet ist, beginnen Sie die amperometrische Aufzeichnung in situ an der lebenden Zelle.

Bei dem an die Elektrode angelegten Oxidationspotential adsorbieren sich Vesikel an der Elektrodenoberfläche und reißen stochastisch. Es ist also keinerlei Stimulus erforderlich, um diesen Prozess in Gang zu setzen. Um die osmotische Wirkung auf die vesikuläre Quantengröße zu bestimmen, sammeln Sie die intrazellulären Zytometriemessungen von einer Gruppe von Zellen, die unter Verwendung der experimentellen Bedingung in isotonischem und hypertonem Puffer inkubiert wurden.

Die Wirkung der extrazellulären Osmolalität auf die Exozytoseaktivität wird als die Häufigkeit von Exozytoseereignissen dargestellt, wenn chromaffine Zellen mit Bariumlösung unter isotonischen, dann hypertonischen und schließlich isotonischen Bedingungen stimuliert werden. Diese Daten zeigen, dass eine Hemmung der Exozytoseaktivität bei Zellen mit osmotischem Stress erreicht werden kann und eine teilweise Erholung erreicht werden kann, nachdem die Zellen in eine isotonische Umgebung zurückgekehrt sind. Das Kontrollexperiment zeigt die Häufigkeit von Exozytoseereignissen nach drei aufeinanderfolgenden Bariumstimulationen an chromaffinen Zellen unter isotonischen Bedingungen.

Dies zeigt, dass die mehrfache Bariumstimulation innerhalb des in diesen Experimenten verwendeten Zeitrahmens zu einer Verringerung der Exozytoseaktivität durch konsekutive Zellstimulation führt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese komplementären Analysemethoden durchführen, mit denen Sie vergleichen können, wie sekretorische Vesikel und der Exozytoseprozess durch Veränderungen in der extrazellulären Umgebung beeinflusst werden.