Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

Das übergeordnete Ziel ist es, den Effekt experimenteller Veränderungen auf das Zellverlängerungsrepertoire zu bestimmen und wie er mit der Zelladhäsionsfunktion bei Krebs zusammenhängt. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselrollen des Repertoires der Zellmembranverlängerung bei der Modulation des Zellverhaltens wie Zelladhäsion, Motilität und Invasion zu identifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie relativ einfach durchzuführen ist und leicht an verschiedene Versuchsbedingungen angepasst werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf unsere Therapie oder Diagnose von lokal fortgeschrittenen oder metastasierenden Krebserkrankungen, da sie dazu beiträgt, Veränderungen im Zellverlängerungsrepertoire, die mit Veränderungen der Tumorzellen in adhäsiven und invasiven Kapazitäten verbunden sind, genau zu quantifizieren. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. die Ionenkanalregulation, von der bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der Bildung von Zellerweiterungen und normalen physiologischen Prozessen spielt. Die visuelle Demonstration und Aufzeichnung dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da das Zählen der Zellverlängerungsschritte aufgrund der Feinheiten ihres Aussehens manchmal schwer zu erlernen ist.

Einen Tag vor der Bildgebung werden SW 13, SW Neo und SW DKK3 Zellen gezählt, die in einem 37 Grad Celsius heißen und fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator mit einem Hämozytometer gezüchtet wurden. Legen Sie sterile Glasdeckgläser in einzelne Vertiefungen mit drei Sechs-Well-Platten. Verwenden Sie für jede Zelllinie eine separate Platte und plättieren Sie die drei Zelllinien mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro Well in diese sechs Well-Platten.

Legen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einen Inkubator. Am nächsten Tag saugen Sie aus jeder Vertiefung das Wachstumsmedium an. Waschen Sie dann die Zellen in einem Milliliter warmem PBS.

Geben Sie anschließend einen Milliliter 3,7 Prozent Formaldehyd in jede Vertiefung, um die Zellen zu fixieren. Lassen Sie die Zellen 10 Minuten lang im Fixiermittel. Nachdem die Fixierung erfolgt ist, aspirieren Sie das Formaldehyd.

Geben Sie einen Milliliter 0,05 Prozent Kristallviolett in jede Vertiefung, um die Zellen 30 Minuten lang zu färben. Entfernen Sie anschließend den überschüssigen Fleck, indem Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter entionisiertem Wasser pro Vertiefung waschen. Geben Sie als Nächstes einen Tropfen des durchsichtigen Einbettreagenzes auf einen beschrifteten Objektträger.

dann mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig die Deckgläser heraus und legen Sie sie mit der Vorderseite nach unten über die Einbettreagenzien. Nachdem Sie alle gefärbten Deckgläser auf Objektträger montiert haben, wählen Sie unter einem Lichtmikroskop 20 zufällige Ansichten von nicht überlappenden Zellen aus jedem Deckglas aus. Nehmen Sie für jedes Sichtfeld Mikroaufnahmen mit einer Vergrößerung von 400

Beobachten und zählen Sie dann die Anzahl der Erweiterungstypen in jeder der 20 repräsentativen Zellen. Verwenden Sie die Definitionen und das Textprotokoll, um Ihre Klassifizierung der Membranerweiterung als Filopodien, Lobopodien oder Lamellipodien zu leiten. Bei der ersten Zählung von Zellerweiterungstypen kann es hilfreich sein, ein Referenzbild zur Überprüfung zur Verfügung zu haben.

Wenn möglich, sorgt eine verblindete Zählung in Bezug auf ihre experimentellen Stichproben für zusätzliche Objektivität. Bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl der Erweiterungen jedes Typs pro Zelle in jeder der drei untersuchten Zelllinien. Verwenden Sie eine Einweg-Anova, um zu testen, ob der Unterschied im durchschnittlichen Prozentsatz der Zellmembranverlängerungen zwischen den verschiedenen Zelltypen statistisch signifikant ist.

Einen Tag vor dem Assay werden mit einem Hämozytometer SW 13, SW Neo und SW DKK3 Zellen gezählt. Platten Sie diese Zellen mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Vertiefung in sechs Vertiefungsplatten, wobei eine Platte für jeden der sechs festgelegten Zeitpunkte verwendet wird, die getestet werden sollen. Legen Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in einen Inkubator.

Nehmen Sie am nächsten Tag die Platte aus dem Inkubator und waschen Sie die Zellen einmal mit warmem PBS. Geben Sie dann 0,5 Milliliter einer nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung in eine einzelne Stärke. Schwenken Sie die Platten vorsichtig, um die hinzugefügte Lösung gleichmäßig zu verteilen.

Inkubieren Sie die Platten für definierte Zeiten mit der Lösung. Saugen Sie die vorgesehene Platte am Ende jedes Zeitpunkts an. Waschen Sie die Zellen kurz nach jeder Aspiration mit einem Milliliter warmem PBS.

Klopfen Sie dann vorsichtig auf die Platte, um lose anhaftende Zellen zu lösen. Wiederholen Sie die Wäsche zusammen mit dem intermittierenden Klopfen noch zwei weitere Male. Zum Schluss aspirieren Sie das restliche PBS und fixieren die in der Platte verbliebenen Zellen mit einem Milliliter 3,7 Prozent Formaldehyd.

Nachdem die Fixierung erfolgt ist, aspirieren Sie das Formaldehyd. Geben Sie dann einen Milliliter 0,05 Prozent Kristallviolett in jede Vertiefung, um die Zellen zu färben. Sobald die Färbung abgeschlossen ist, entfernen Sie den überschüssigen Fleck, indem Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter deionisiertem Wasser pro Vertiefung waschen.

Zählen Sie mit einem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung die verbleibenden anhaftenden Zellen in jeder Vertiefung für jede Platte. Bestimmen Sie dann den Prozentsatz der Zellen, die während der verschiedenen Zeitpunkte für die drei getesteten Zelllinien abgelöst geblieben sind. Mit Hilfe einer Zwei-Wege-Anova werden die Unterschiede und die Raten der Zellablösung zwischen den drei Zelllinien statistisch signifikant getestet.

Kristallviolett gefärbte Kontrollzellen SW 13 und SW Neo bildeten hauptsächlich Filopodien und Lamellipodien. Im Gegensatz dazu bildeten DKK3-exprimierende Zellen mehr Lobopodien mit nahezu völliger Abwesenheit von Lamellipodien und sehr wenigen Filopodien. Beachten Sie auch die Polaritätsunterschiede zwischen den DKK3-exprimierenden Zellen und den Kontrollzelllinien.

Die Grafik zeigt den Anteil verschiedener Zellfortsätze in den drei getesteten Zelllinien. Zu beachten ist der signifikant höhere Anteil an Lobopodien in DKK3-exprimierenden Zellen. Liniendiagramme zeigen den Prozentsatz der Zellen, die nach der Behandlung mit der Dissoziationslösung für die in der X-Achse angegebenen Zeitpunkte an der Platte hafteten.

Zu allen Zeitpunkten bis zu 10 Minuten zeigten DKK3-exprimierende Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen eine signifikant höhere Zelladhäsionsstärke. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einem Zeitraum von ein bis zwei Tagen durchgeführt werden, abhängig von Ihrem Versuchsaufbau, wenn er richtig ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zu beurteilen, wie sich Veränderungen in der Morphologie der Zellverlängerung auf die Adhäsionskapazität auswirken.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellerweiterungen in Bezug auf Veränderungen der Adhäsionseigenschaften von Krebszellen genau quantifiziert. Viel Glück und danke fürs Zuschauen.