Entwicklung der eine elektrochemische DNA-Biosensor, einem Foodborne Krankheitserreger zu erkennen

Lebensmittelbedingte Krankheitserreger tragen zu einem großen Teil der Probleme der öffentlichen Gesundheit weltweit bei, was sich erheblich auf die Mortalitätsrate und Morbidität des Menschen auswirkt. Herkömmliche Methoden zum Nachweis lebensmittelbedingter Krankheitserreger erfordern eine komplizierte Probenhandhabung und sind zeitaufwändig. In jüngster Zeit haben sich Biosensoren als vielversprechende und umfassende Nachweismethode mit den Vorteilen der schnellen Detektion und der Praktikabilität erwiesen.

Die Entwicklung von Biosensoren basiert auf einer modifizierten Elektrode mit Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln. Die siebgedruckte Kohlenstoffelektrode wurde modifiziert, um die aktive Oberfläche der Arbeitselektrode zu vergrößern. Methylenblau, das als Redoxkomplex verwendet wird, hat eine starke Bindung mit einzelsträngiger DNA immobilisierter Sonden-DNA.

Dieses Verhältnis von hoher Afinität wird durch einen hohen Spitzenstrom dargestellt. Die Hybridisierung der einzelsträngigen DNA mit ihrer komplementären Sequenz ersetzt die gebundenen Methylenblau-Moleküle, wodurch der Strom der differentiellen Pulsvoltammetrie reduziert wird. Dies könnte auf eine geringere Menge Methylenblau zurückzuführen sein, die sich auf der Oberfläche einer modifizierten Elektrode mit komplementärer doppelsträngiger DNA angesammelt hatte, die durch eine unerreichbare Wechselwirkung zwischen Guaninbasen verursacht wurde.

Die Farbe der zubereiteten Lösungen ändert sich von gelb über schwärzlich bis hin zu dunklem Rubinrot. Dies deutete darauf hin, dass das Goldsalz durch die Citrat-Ionen reduziert wurde. Die gelöste Polymilchsäure wurde mit der zuvor hergestellten Goldnanopartikellösung vermischt und dann bei Raumtemperatur homogen gerührt, was dann als polymilchsäurestabilisierte Goldnanopartikel bezeichnet wurde.

Charakterisierung der polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikel wurden die sichtbare Ultraviolettspektroskopie, die Röntgenbeugung, die Transmissionselektronenmikroskopie und die Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie mit energiedispersiver Röntgenspektrometrie eingesetzt. Etwa 25 Mikroliter der homogenen Lösung aus polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikeln wurden schnell auf die siebgedruckte Kohlenstoffelektrode pipettiert und vor der Verwendung 24 Stunden lang an der Luft getrocknet. Die modifizierten Elektroden wurden dann elektrochemisch in Kaliumferrocyanid charakterisiert, um die aktive Oberfläche, die elektrochemische Impedanzspektroskopie, die Wiederholbarkeit, die Reproduzierbarkeit und die Stabilität zu messen.

Die Optimierung der Immobilisierungsbedingungen wurde anhand von drei Faktoren bestimmt: der Konzentration der einzelsträngigen DNA im Bereich von 0,2 bis 1,4 Mikromol, der Zeit von 30 bis 220 Minuten und der Temperatur von 25 bis 75 Grad Celsius. Auf der anderen Seite wurde die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen über zwei Faktoren bestimmt, nämlich die Zeit von fünf bis 35 Minuten und die Temperatur von 25 bis 75 Grad Celsius. Die behandelten modifizierten Elektroden wurden anschließend 30 Minuten lang in 20 mikromolares Methylenblau getaucht.

Die unspezifisch resorbierte DNA und das überschüssige Methylenblau wurden durch Waschen mit Salzacetatpuffer pH 4,5 entfernt und anschließend mit deionisiertem Wasser gespült. Der Spitzenstrom der Methylenblau-Reduktion wurde mit Hilfe der Differentialpulsvoltammetrie gemessen. Die differentielle Pulsvoltammetrie-Messung wurde mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung pH 7,0 durchgeführt, die keinen Indikator enthielt.

Ein ähnliches Verfahren wurde für alle Wechselwirkungen durchgeführt. Vibrio parahaemolyticus als Referenzstämme und acht weitere Bakterienstämme, nämlich Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus und Vibrio alginolyticus des häufigen lebensmittelbedingten Krankheitserregers wurden für die elektrochemische DNA-Biosensor-Validierung in dieser Studie eingesetzt. Alle zwei Wochen wurde eine routinemäßige Subkultur von Bakterienstämmen auf dem jeweiligen Agar durchgeführt, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

Die Menge der Vibrio parahaemolyticus-Zellen wurde mit Hilfe einer Spreizplattentechnik bestimmt. Ein Millimeter der Bakterienzellkultur wurde in neun Millimeter Trypticase-Sojabrühe mit 3 % Natriumchlorid überführt, um einen Verdünnungsfaktor von 10 zu erhalten. Als nächstes wurden 0,1 Milliliter jedes Verdünnungsfaktors ausgehend von einem einmaligen Verdünnungsfaktor von 10 bis zum 10-fachen Verdünnungsfaktor von 10 auf eine Platte CHROMagar Vibrio zur Koloniezählung verteilt.

Die Herzmuscheln wurden vom Nassmarkt bezogen und dann schnell in einer Eiskühlbox zur Analyse ins Labor gebracht. Die Herzmuscheln wurden in zwei Gruppen eingeteilt, nämlich in die behandelte und die unbehandelte Gruppe, wobei davon ausgegangen wurde, dass die Herzmuscheln vom Beginn der Ernte bis zur Kühllagerung auf dem Markt gleichmäßig geerntet wurden. Die Herzmuscheln in der behandelten Gruppe wurden vorbehandelt, indem sie 24 Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurden, gefolgt von einer vierstündigen Exposition gegenüber ultraviolettem Licht bei 20 Grad Celsius vor der DNA-Extraktion.

Es wurde erwartet, dass die Gefriertemperatur und die ultraviolette Exposition, die für die Kontrollgruppe verwendet wurden, sie abtöten oder zumindest die natürlich anreichernden lebensmittelbedingten Krankheitserreger in den Herzmuscheln begrenzen würden. Ein höheres Pasteurisierungsregime von 70 Grad Celsius wurde nicht angewendet, da das Ziel der kontrollierten Bedingung in dieser Studie darin bestand, die tatsächliche Situation der frischen Herzmuscheln nachzuahmen. In der Zwischenzeit wurden die Proben aus der unbehandelten Gruppe direkt und ohne Vorbehandlung analysiert, sobald sie im Labor eintrafen.

Die Herzmuscheln wurden in destilliertem Wasser gewaschen und von Schmutz befreit, bevor das Gewebe mit einer sterilen Pinzette und einem Laminar-Flow-Schrank aus den Schalen entfernt wurde. Etwa 10 Gramm Herzmuschelgewebeproben wurden mit dem Homogenisator in 19 Millilitern steriler Trypticase-Sojabrühe mit 3 % Natriumchlorid für 60 Sekunden homogenisiert. Eine bekannte Menge lebensmittelbedingter Krankheitserreger wurde dann zu neun Millimetern der homogenisierten Probenbrühe für die dotierten Proben gegeben.

Die nicht dotierten Proben wurden als Negativkontrolle verwendet. Etwa ein Milliliter Proben wurde in ein Eppendorf-Röhrchen für die DNA-Probenextraktion pipettiert, das für den Biosensor und den Polymerase-Kettenreaktionsassay verwendet wurde. Die genomische DNA des lebensmittelbedingten Krankheitserregers wurde dann aus den mit und ohne Dots versehenen Proben extrahiert.

Die genomische DNA wurde nach einem modifizierten Boiled-Lyse-Verfahren extrahiert. Die genomische DNA wurde bei 12.000 Umdrehungen pro Minute drei Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um eine klare Suspension zu erhalten, und der Überstand für die weitere Verwendung bei minus 20 Grad Celsius gehalten. Mit einem Biophotometer wurde die Konzentration und Reinheit der extrahierten genomischen DNA bestimmt.

Die Identität aller Stämme wurde dann mit biochemischen Standardassays bestimmt und durch 16 SR RNA-Gensequenzierung verifiziert. Schließlich wurde die genomische DNA bei 92 Grad Celsius für zwei Minuten denaturiert und vor dem Einsatz des Biosensors schnell in Eiswasser abgekühlt. Eine weitere Bestätigung von lebensmittelbedingten Krankheitserregern erfolgte durch Polymerase-Kettenreaktion, die auf das jeweilige Gen abzielt.

Das amplifizierte Produkt und seine Größen wurden mittels Elektrophorese auf 1,5%igem Agarosegel bestimmt. Die Gelbilder wurden mit Hilfe eines Geldokumentationssystems aufgenommen. Die Erzeugung von Polymilchsäure-stabilisierten Gold-Nanopartikeln wurde aus den ultravioletten sichtbaren Spektren bestätigt, wodurch das Wachstum des Oberflächenplasma- und Resonanzpeaks um 540 Nanometer begründet wurde.

Die Bildung und das Vorhandensein von polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikeln wurde in Abhängigkeit von der Partikelgröße in Wellenlängenbereichen von 500 bis 600 Nanometern angegeben. Alle Kristallitpeaks von Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln wurden an den beiden Schauplätzen bei 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 und 77,7 Grad beobachtet. Die Kristallit-Peak-Intensitäten nahmen ebenfalls zu, als breitere Beugungspeaks bei 31,7 Grad eintraten, was darauf hindeutet, dass die kalten Nanopartikel in die Polymilchsäure eingebettet waren, und auf die Bildung polyphasischer Gold-Nanostrukturen hindeutet.

Aus der Partikelverteilungskurve der Transmissionselektronenmikroskopie und Bildern von polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikeln war ersichtlich, dass Goldnanopartikel eine nahezu kugelförmige Form haben. Die Größe der Nanopartikel lag im Bereich von etwa 37 Nanometern, was etwas größer ist als die aus Scherrers Formel gewonnene, was auf eine polykristalline Natur der synthetisierten Nanopartikel hindeutet. Die Hauptgröße von Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln wurde unter Verwendung der Sherrer-Gleichung berechnet, indem die Breite der 100-Grad-Bragg-Reflexion bestimmt wurde.

Aus der Tabelle wurde die Kristallitgröße von Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln mit 27 Nanometern berechnet. Aus den Rasterelektronenmikroskopie-Bildern der Feldemission und mit energiedispersiven Röntgenspektren ergab sich für die modifizierte Siebdruck-Kohlenstoffelektrode der höchste Gewichtsanteil an Gold, die größte Dichte und die größte Struktur der Nanopartikelabdeckung. Das energiedispersive Röntgenspektrum bestätigte, dass die hergestellten polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikel nur aus Gold bestanden und außer dem Peak, der Kohlenstoff und Sauerstoff entspricht, kein anderes Element aufwiesen.

Die anodischen und kathodischen Peakpotentiale waren bei unterschiedlichen Scanraten konsistent, was darauf hindeutet, dass die elektrochemische Reaktion auf der Grundlage der Peaktrennung reversibel war. Die aktive Oberfläche der modifizierten Elektroden wurde als 0,26 Zentimeter zum Quadrat und 0,41 Zentimeter zum Quadrat für die blanke Elektrode bzw. die modifizierte Elektrode berechnet. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Verbesserung durch Polymilchsäure-stabilisierte Goldnanopartikel auf der aktiven Oberfläche im Vergleich zur blanken Elektrode relativ höher war.

Der Wert des Ladungsübertragungswiderstands für die blanke Elektrode betrug 1.932 Ohm, während die modifizierte Elektrode auf 1.444 Ohm abnahm. Die Abnahme des Wertes des Ladungsübergangswiderstands in der modifizierten Elektrode könnte aus einer Abnahme der lokalen Dielektrizitätskonstante und/oder einer Zunahme der Dicke der elektrischen Doppelschicht resultiert haben, was darauf hindeutet, dass Kaliumferrocyanid durch Absorption an der Grenzfläche des Metalls oder der Lösung funktionierte. Die Spitzenströme stiegen mit der Modifikation der blanken Elektrode unter Verwendung von Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln progressiv an, was zeigte, dass eine höhere Empfindlichkeit der Kehrwert des niedrigeren Ladungsübergangswiderstands war.

Die relative Standardabweichung der modifizierten Elektrode wurde als 4,26% abgeleitet. Die Elektrode mit Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln ergab nach mehreren Messungen eine bessere relative Standardabweichung. Relative Standardabweichungswerte von 4,05 % für modifizierte Elektroden, was auf eine bessere Reproduzierbarkeit der Elektrodenherstellung für polymilchsäurestabilisierte Goldnanopartikel hinweist. Die optimierte Konzentration der DNA betrug 1,2 mikromolare einzelsträngige DNA.

Die optimale Immobilisierungszeit der einzelsträngigen DNA wurde mit 180 Minuten gewählt. Die optimale Immobilisierungstemperatur der einzelsträngigen DNA wurde mit 55 Grad Celsius gewählt. Die optimale Hybridisierungszeit der doppelsträngigen DNA wurde mit 10 Minuten gewählt.

Die optimale Hybridisierungstemperatur der doppelsträngigen DNA wurde mit 35 Grad Celsius gewählt. Komplementäre DNA wies den niedrigsten Spitzenstrom von 0,73 Mikroampere unter den untersuchten DNAs, nicht-komplementärer DNA, drei Basen nicht übereinstimmender DNA und einer nicht übereinstimmenden Base auf. Es ist offensichtlich, dass der hohe Strom der DNA, auf die abgestimmt wurde, kleiner ist als der Strom der anderen Oligonukleotidsequenzen.

Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Biosensor zur Unterscheidung mit hoher Sensitivität und Spezifität verwendet werden kann. Der konstruierte DNA-Biosensor wies eine Selektivität der Hybridisierungsdetektion über immobilisierte Sonden-DNA auf der Oberfläche der modifizierten Elektrode auf. Eine kontinuierliche Abnahme des Spitzenstroms von Methylenblau auf der modifizierten Elektrode wurde durch eine Erhöhung der Konzentration komplementärer DNA ausgelöst.

Eine lineare Korrelation zwischen dem Logarithmus verschiedener Ziel-DNA-Konzentrationen von 0,2 Pikomolar bis 0,02 Millimolar und dem Logarithmus des Methylenblau-Reduktionsspitzenstroms wird mit einem linearen Regressionskoeffizienten von 0,96 dargestellt. Die prozentuale Wiederfindung für den hergestellten DNA-Biosensor sank nach sechsmonatiger Lagerung langsam auf nicht weniger als 80 % seines ursprünglichen Signals, was darauf hindeutet, dass die Sonde der einzelsträngigen DNA auf der Oberfläche der modifizierten Elektrode sehr stabil ist. Eine gute Langzeitstabilität bei einer Temperatur unter 45 Grad Celsius könnte der Grund für die starke Reaktion zwischen polymilchsäurestabilisierten Goldnanopartikeln und einzelsträngiger DNA sein.

Die Polymerase-Kettenreaktions-Amplifikationsprodukte für neun verschiedene Bakterienarten, nämlich Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae und Vibrio parahaemolyticus, wurden gescreent. Der nach einer Kreuzreaktivitätsbewertung erhaltene differentielle Pulsvoltammetrie-Spitzenstrom zeigt einen sehr deutlichen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus im Vergleich zu anderen Bakterienarten. Dies ist zu erkennen, indem man die Anzahl der Basenpaare verringert, das beobachtete differentielle Pulsvoltammetriesignal nimmt zu.

Dies hängt mit der größeren Menge an Methylenblau-Molekülen bis hinunter zu den Sonden zusammen. Bei der Polymerase-Kettenreaktionsanalyse wurde Vibrio parahaemolyticus sowohl in den behandelten als auch in den unbehandelten Sdot-Proben gefunden, wie die Spuren sieben, acht, neun, 10, 11 und 12 zeigen. Während die behandelten und unbehandelten Proben ohne Dots auf Spur eins, zwei, drei, vier, fünf und sechs frei von Vibrio parahaemolyticus waren.

Die Detektionsergebnisse wurden mit dem entwickelten DNA-Biosensor durchgeführt, der das Vorhandensein von Vibrio parahaemolyticus in der behandelten Gruppe, bestehend aus dotierten und nicht dotierten Proben, erfolgreich bestimmte. Diese Ergebnisse korrelieren positiv mit den zuvor diskutierten Ergebnissen der Polymerase-Kettenreaktion. Die Anwendung von Polymilchsäure-stabilisierten Goldnanopartikeln hat ein großes Potenzial für die Anwendung als Modifikation für den weiteren Sinn der Herstellung.

Eine hohe Selektivität könnte erreicht werden, wenn der Redox-Komplex stärker an das unhybridisierte Bioerkennungsmolekül bindet, was eine Innovation sein könnte, die es wert ist, weiterverfolgt zu werden.