Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, maßgeschneiderte Zellaussaatformen zu erstellen, mit denen selbstorganisierte Geweberinge in verschiedenen Größen hergestellt werden. Mit dieser Methode können wir dreidimensionale Geweberinge aus menschlichen Zellen herstellen, mit denen die Struktur, Festigkeit und Funktion des Gewebes bewertet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache Methode zur Herstellung von Formen für selbstmontierte Gewebe mit kundenspezifischen Abmessungen handelt.

Um den Vorgang zu starten, verwenden Sie eine computergestützte Konstruktionssoftware, um eine Zeichnung einer Form in den gewünschten Abmessungen zu erstellen. Senden Sie die CAD-Datei an einen hochauflösenden 3D-Drucker. Drucken Sie die Form in einem Kunststoff mit einer glänzenden Oberfläche, die bei 50 Grad Celsius stabil ist.

Waschen Sie die gedruckte Form gründlich mit einer Bürste, Reinigungsmittel und Wasser. Spülen Sie die Form mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie in einem Gestell an der Luft trocknen. Es ist wichtig, einen 3D-gedruckten Kunststoff zu wählen, der bei der PDMS-Aushärtungstemperatur stabil ist.

Rückstände, die während des Erhitzens auf das PDMS übertragen werden, können die Ringbildung beeinträchtigen. Messen Sie anschließend 25 Gramm PDMS-Basis in einer Einweg-Waage. Härter im Verhältnis 1:10 zugeben und kräftig umrühren, bis Basis und Härtungsmittel gründlich vermischt sind.

Befestigen Sie dann Laborband um die Seiten der Form, um eine etwa einen Zentimeter hohe Wand um das Gesicht mit den bedruckten Vertiefungen zu bilden. Stellen Sie sicher, dass keine Lücken in der Bandwand vorhanden sind. Gießen Sie die PDMS-Mischung in die 3D-gedruckte Form.

Entgasen Sie das PDMS in einer Vakuumkammer für 30 bis 60 Minuten oder bis keine Blasen mehr übrig sind. Härten Sie das PDMS bei 50 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden aus oder bis das PDMS fest genug ist, um aus der Form genommen zu werden. Entfernen Sie dann das Klebeband und trennen Sie das PDMS-Negativ vorsichtig von der Form.

Inkubieren Sie das PDMS negativ in einem Ofen bei 60 Grad Celsius für eine Stunde, um sicherzustellen, dass es vollständig ausgehärtet ist. Waschen Sie dann das Negativ gründlich mit Reinigungsmittel und Wasser. Spülen Sie die Form mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen.

Bevor Sie die Agaroseform herstellen, autoklavieren Sie das PDMS-Negativ, eine stumpfe Pinzette und alle anderen gewünschten Werkzeuge. Um mit der Herstellung zu beginnen, bereiten Sie mindestens 50 Milliliter mit zwei Prozent Agarose in DMEM vor und autoklavieren Sie sie. Bereiten Sie die Agarose-Vertiefungen einen Tag vor der Ringsaat vor.

Pipettieren Sie vier Milliliter geschmolzene Agarose in das autoklavierte PDMS-Negativ und achten Sie darauf, die Form nicht zu überfüllen. Pipettieren Sie dann geschmolzene Agarose in die Hohlräume für die Agarose-Bohrlochpfosten. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um alle Luftblasen zu entfernen.

Die endgültige Agaroseoberfläche muss eben sein. Die Agarose ca. 10 Minuten abkühlen lassen. Trennen Sie dann mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig die abgekühlte Agaroseform vom PDMS-Negativ.

Legen Sie die Form mit der Vorderseite nach oben in eine Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen. Geben Sie das entsprechende vollständige Kulturmedium in die Plattenvertiefung, so dass die Agarose-Vertiefungen vollständig untergetaucht sind. Äquilibrieren Sie die Agarose-Vertiefungen vor der Verwendung über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Zuerst werden in einer 15 Zentimeter großen Kulturschale glatte Muskelzellen der Ratte bei 37 Grad Celsius in einer 5-prozentigen Kohlendioxidatmosphäre kultiviert, bis eine 70-prozentige Konfluenz erreicht ist. Nachdem die gewünschte Agaroseform über Nacht vorbereitet und ausgeglichen wurde, spülen Sie die Kulturschale zweimal mit fünf Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung aus. Nachdem Sie PBS entfernt haben, geben Sie drei Milliliter 0,25 Prozent Tripzin in die Schüssel.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten oder bis sich die Zellen aus der Schale gehoben haben. Neutralisieren Sie das Tripzin mit drei Millilitern des vollständigen Nährmediums. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig, bis sie vollständig resuspendiert sind.

Verdünnen Sie ein Aliquat der Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau-Farbstoff und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Dann zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 200 mal G. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Kulturmedium, um eine Konzentration von 10 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.

Die wichtigsten Schritte, um eine konsistente Ringbildung zu gewährleisten, sind die Optimierung der Zellzahl und des Kulturmediums für die von Ihnen verwendete Zelllinie. Als nächstes besorgen Sie sich die äquilibrierten Agarose-Vertiefungen. Saugen Sie das gesamte Medium sowohl von der Außenseite der Agarose als auch innerhalb der Agarose-Vertiefungen vorsichtig an und achten Sie darauf, die Böden der Vertiefungen nicht zu durchstechen.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung. Geben Sie zwei Milliliter frisches Medium um die Außenseite der Agarose-Vertiefungen, ohne dass das Medium in die Vertiefungen gelangt. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit fünf Prozent CO2, damit sich die Zellen zusammenballen können.

Saugen Sie dann das Medium von außerhalb der Agarose an. Geben Sie 4,5 Milliliter frisches Medium in die Tellervertiefung, so dass die Agarose-Vertiefungen gefüllt sind und die gesamte Agaroseform vollständig untergetaucht ist. Inkubieren Sie die Platte weiter, bis die Geweberinge ausreichend entwickelt sind, und ersetzen Sie das Medium jeden Tag.

Schieben Sie dann jeden Gewebering vorsichtig mit einer Pinzette von seinem Pfosten. Befestigen Sie die Ringe sofort entweder für die Histologie, oder verwenden Sie die Ringe für funktionelle oder mechanische Beurteilungen. Der 3D-Druck ermöglichte ein flexibleres Formendesign.

Die Stiftdurchmesser ließen sich leicht variieren, wie meine glatten Muskelzellenringe der Ratte zeigten, die um Stifte mit Durchmessern von zwei, vier und zwölf Millimetern hergestellt wurden. Geweberinge wurden auch aus primären humanen SMCs, menschlichen mesenchymalen Stammzellen und SMCs hergestellt, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. Die Ringe wurden als in vitro Gewebemodelle zur Beurteilung der Gewebefunktion und der mechanischen Festigkeit verwendet.

Obwohl diese Methode ursprünglich für die Herstellung und Modellierung von Gefäßgewebe entwickelt wurde, kann sie auch zur Herstellung von Segmenten anderer Gewebetypen wie Knorpel, Skelettmuskulatur und Herzgewebe verwendet werden. Diese Methode bietet Forschern eine einfache Möglichkeit, benutzerdefinierte Formen zu erstellen, um 3D-Geweberinge mit unterschiedlichen Abmessungen herzustellen. Diese Ringe können verwendet werden, um die Struktur, die mechanischen Eigenschaften und die Funktion von künstlich hergestellten Geweben aus verschiedenen Zelltypen zu beurteilen.