Name: Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von monozytenzielenden Peptid-Amphiphil-Micellen zur verbesserten Bildgebung der Atherosklerose. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen frühen und späten Plaques.

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Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung von der University of Southern California, das National Heart, Lung, und Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli Edythe breiten Innovationspreis und l.k. Whittier Stiftung Non-Krebs zu erkennen Translational Research Award, EJC gewährt. Die Autoren danken Zentrum für Elektronenmikroskopie und Mikroanalyse, Center of Excellence in NanoBiophysics, Kompetenzzentrum für molekulare Charakterisierung und translationale Imaging Center der University of Southern California für die Unterstützung bei Instrumental-Setups.

Hinweis: Lesen Sie das MSDS für Reagenzien und befolgen Sie alle chemischen Sicherheitsmaßnahmen gemäß lokalen Institution.
1. Vorbereitung des MCP-1 PAMs
<ol><li>
Vorbereitung von MCP-1-Peptid
	<ol>
<li>Wiegen Sie 0,25 Mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in einem Reaktionsgefäß (RV). Spülen Sie die Seite des RV mit 5 mL Dimethylforamide (DMF) in einem chemischen Abzug.</li>
		<li>Laden Sie die RV auf eine automatisierte Benchtop-Peptid-Synthesizer. Last abgepackte Aminosäure Ampullen, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", aus dem C, N-Terminus. Enthalten Sie eine Leere Phiole am Ende für den endgültigen Deprotection Schritt. Hinweis: Eine verschlüsselte Peptid mit Sequenz, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kann auch synthetisiert werden über das gleiche Protokoll.</li>
		<li>Sobald Synthese abgeschlossen ist, übertragen Sie die Peptide auf Harz von der RV auf das Funkeln Fläschchen mit ca. 2-3 mL Methanol bis alle Harze übertragen werden. Nachdem das Harz auf den Boden gesunken ist, entfernen Sie überstand das Methanol zu und verdunsten Sie, die restlichen bis trocken. Vakuum für weitere 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur trocken.</li>
		<li>12 mL Dekolleté-Lösung mit Trifluoracetic Säure (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 Vol % in einem chemischen Abzug zu machen. Schwenken Sie die Dekolleté-Lösung, um sicherzustellen, dass alles gleichmäßig vermischt ist. Achtung: Da Triisopropylsilane und Ethanedithiol luftempfindlichen, Argon purge Lager Fläschchen mit Triisopropylsilane und Ethanedithiol für 1 min vor dem Ablegen wieder.</li>
		<li>Stellen Sie die Synthese Gefäß (SV) auf einem Arm-Shaker durch Spannen der unteren Hälfte des SV. Übertragen Sie Peptid-Harz auf die SV mit 2 mL Dekolleté-Lösung, bis alle der Peptid-Harze übertragen werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Seiten des SV mit 3 mL Dekolleté-Lösung. Schließen Sie den Deckel des SV und schütteln bei 300 Schwingungen/min für 4 h.</li>
		<li>Eine leere 50 mL Zentrifugenröhrchen abwiegen. Notieren Sie die Masse.</li>
		<li>Entleeren Sie nach 4 h die gespalten Peptidlösung vom SV in der 50 mL Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die SV mehrmals mit der restlichen Dekolleté-Lösung.</li>
		<li>Verdunsten Sie gespalten Peptidlösung mit Stickstoff bis gibt es weniger als 4 mL in die Zentrifugenröhrchen bleiben.</li>
		<li>36 mL eiskaltes Äther der Peptid gespalten Projektmappe hinzufügen.</li>
		<li>Vortex ist die Lösung bis es komplett weiß oder gelb. Zentrifugieren bei 3.000 x g für 5 min bei 4 ° C, und den Überstand abgießen.</li>
		<li>Der Tube 40 mL eiskaltes Äther hinzufügen. Wirbel und beschallen wieder. Wiederholen Sie die Zentrifugation. Den Überstand abgießen.</li>
		<li>Trocknen Sie das rohe PA-Pellet mit Stickstoff Gas spülen, bis der Äther sichtbar verdunstet ist.</li>
		<li>Geben Sie 20 mL bidestilliertem Wasser, Wirbel und beschallen bis das Peptid in Lösung vollständig gelöst ist.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Peptid getrocknet ist, wiegen Sie die Masse der Zentrifugenröhrchen, das rohe-Peptid enthält. Das rohe Peptid in 5 mg/mL Wasser auflösen.</li>
		<li>25 mg von Rohöl MCP-1-Peptid in 5 mL bidestilliertem Wasser eine totale Konzentration von 5 mg/mL zu lösen. Reinigen Sie das rohe MCP-1-Peptid durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit 0,1 % TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) als mobilen Phasen auf einer C8-Reverse-Phase-Spalte. Injizieren Sie die 5 mL des Peptids in der HPLC. Hinweis: Die erste mobile Phase bestand aus 100 % Lösungsmittel A bei einer Durchflussrate von 9,0 mL/min Lösungsmittel A langsam auf 30 % in 27 min zu verringern und halten Sie in dieser Zusammensetzung für 3 min. Rückkehr der Gradient zu 100 % Lösungsmittel eine über 3 min und halten an dieser Komposition für 1 min zu geben eine Gesamtlaufzeit von 34 min. halten die Spalte Temperatur bei 55 ° C. Verwenden Sie positive Ionen Quellmodus für die Analyse. Ameisensäure kann anstelle von TFA, verwendet werden, wenn TFS zu sauer für die HPLC-Säule. Es wird empfohlen, die organische Lösungsmittel Zusammensetzung Rampe Geschwindigkeit 2%/min für bessere Trennung nicht überschreiten sollte.</li>
		<li>Jede Fraktion mit Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Massenspektrometrie für das erwartete Produkt m/Z bei 2.890 zu analysieren. Hinweis: Lösen Sie α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure bei 1 mg/mL in Acetonitril/Wasser (50: 50 Vol-% auf) als die Matrixlösung. Vor Ort 0,75 µL Matrixlösung auf den MALDI-Teller, gefolgt von 0,75 µL der einzelnen Fraktionen. Führen Sie die Analyse mit einem positiven reflektierende Ionen-Modus im Massenbereich von 500-5.000 Da.</li>
		<li>Kombinieren Sie Produkt Brüche, Abblasen Acetonitril, Einfrieren und lyophilize gereinigte Peptide bis trocken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von MCP-1 PA
	<ol>
<li>Bereiten Sie ein 1.1 molaren Überschuss von 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[Amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000) Maleimide Peptid in separaten funkeln Fläschchen. Lösen Sie beide Verbindungen in bidestilliertem Wasser machen ~ 15 mg/mL. Beschallen Sie für 15 Minuten oder bis beide Lösungen völlig klar sind. Hinweis: DSPE-PEG (2000)-Cy5 synthetisiert unter Verwendung des gleichen Protokolls mit DSPE-PEG (2000)-Amin und N-Hydroxysuccinimide (NHS) Ester funktionalisiert Cy5, mit Ausnahme von Schritt 1.2.3, wo der pH-Wert der Lösung bis 8,5 eingestellt wird.</li>
		<li>Die Peptidlösung DSPE-PEG (2000)-Maleimide-Lösung hinzufügen. Wirbel und beschallen.</li>
		<li>Fügen Sie 1 M NaOH tropfenweise (1 µL) nacheinander, bis der pH-Wert der Lösung 7 beträgt.</li>
		<li>Stickstoff-Aufräum-Lösung für 5 min. Rühren Sie die Lösung über Nacht.</li>
		<li>Frieren die Lösung und lyophilize trocknen.</li>
		<li>Sobald das Rohprodukt getrocknet ist, lösen Sie den Feststoff in 5 mg/mL Wasser auf.</li>
		<li>Reinigen Sie mit HPLC, wie oben beschrieben. Hinweis: Unconjugated Peptid und DSPE-PEG(2000) sollte zwischen 15-30 % organische Konzentration (Vol%), während DSPE-PEG eluieren (2000)-MCP-1-Konjugat sollte zwischen 40-50 % Bio Konzentration eluieren.</li>
		<li>Analysieren Sie jede Fraktion mittels MALDI Massenspektrometrie für die entsprechenden m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 eine breite m/Z-Spitze bei 5.760 haben sollte. Hinweis: 2,5-Dihydroxybenzoic Acid wird am besten als Matrix für DSPE-PEG (2000)-MCP-1 mit MALDI verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage von MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Auflösen von 1,75 mg MCP-1 PAs mit 3 mL Methanol in einem 1-Dram-Fläschchen. Beschallen Sie bis die MCP-1 PA vollständig gelöst ist. Hinweis: Cy5 amphiphilen können in einem molaren Verhältnis von 10: 90 MCP-1 PA für imaging-Anwendungen integriert werden.</li>
		<li>Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff in einer kreisförmigen Bewegung während der Seite des Röhrchens das restliche Methanol abspülen, bis ein gleichmäßiger Film an der Unterseite der Flasche entsteht. Vakuum-trockenen Film über Nacht.</li>
		<li>Den Film mit 3 mL Wasser oder Phosphat-Puffer-Hydrat Kochsalzlösung (PBS), eine 100 µM-Lösung von MCP-1 PAMs zu machen. Sanft Wirbel und beschallen die Lösung bis frei. Bei 80 ° C für 30 min inkubieren. Hinweis: Die erhöhte Temperatur hat gezeigt, dass die Selbstmontage Prozess beschleunigen und ermöglicht es der Peptid-Komponente, die stabilste Sekundärstruktur zu bilden, während die Senkung der kritischen Micelle Konzentration (CMC)42,43.</li>
		<li>Die resultierende Dispersion auf Raumtemperatur abkühlen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Charakterisierung von MCP-1 PAMs
<ol><li>
Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzial
	<ol>
<li>Platz 100 µM von MCP-1 PAM oder Rührei PAM in eine Küvette gemäß den Anweisungen des DLS oder Zeta potential Instruments. Hinweis: DLS und Zeta potential Küvetten können unterschiedlich sein auf der Grundlage des Instruments Anweisungen.</li>
		<li>Equilibrate das Instrument auf Raumtemperatur. Messen Sie die Größe und die Oberflächenladung der PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
	<ol>
<li>Fügen Sie 7 µL von 50 µM MCP-1 PAM oder Rührei PAM auf ein TEM-Raster ausgesetzt in eine selbstschließende Pinzette für 5 min. Docht das Tröpfchen mit einem heiklen Aufgabe abwischen.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL Wasser um das Raster zu waschen. Docht entfernt das Droplet.</li>
		<li>Fügen Sie 7 µL 1 wt % Phosphotungstic Acid für 2 min. Docht entfernt das Droplet. Wiederholen Sie Schritt 2.2.2.</li>
		<li>Trocknen Sie die TEM-Raster vor TEM Analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kreisförmigen Dichroismus (CD) Spektroskopie
	<ol>
<li>Schalten Sie den Stickstoff für 5-10 min vor dem Gebrauch des Gerätes.</li>
		<li>Küvette 300 µL des Rohlings (Wasser oder PBS) entgegenbringen.</li>
		<li>Spektren bei 190-265 nm, 0,2 mm-Länge mit einem 1 s Integrationszeit und 1 nm Bandbreite bei Raumtemperatur zu messen. Sammeln Sie 3 Wiederholungen.</li>
		<li>Maßnahme 100 µM-MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, kletterte Peptid und Rührei PAM unter den gleichen Bedingungen im Schritt 2.3.3 beschrieben. Subtrahieren Sie vom Rohling.</li>
		<li>Passen Sie die Daten über eine lineare Interpolation von Polylysin Grundlage Spektren.</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät. Warten Sie 10 Minuten vor dem Ausschalten des Stickstoffs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. in-vitro- Analyse der MCP-1 PAMs
<ol><li>
In-vitro- Biokompatibilität
	<ol>
<li>Kultur und erweitern WEHI 274,1 murine Monozyten in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in 37 ° C weniger als 5 % CO2 , Abschnitt 5. Hinweis: WEHI 274,1 sind Aussetzung Zellen. Bei der Kultivierung, sollten die Medien alle 2-3 Tage wieder aufgefüllt.</li>
		<li>Pipettieren Monozyten in den Medien in einem sterilen 50 mL Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Die alten Medien Aspirieren und in 10 mL frische Medien in die Zentrifugenröhrchen Aufschwemmen. Mischen, langsam, bis die Zellen in den Medien gleichmäßig verteilt sind. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau Färbung und eine Hemocytometer.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Zellen so, dass es 4.000 Monozyten pro 90 µL Medien pro Bohrloch. Fügen Sie 90 µL Zellen in Brunnen eine 96-Well-Platte. 24 h inkubieren. Hinweis: Vermeiden Sie die Verwendung der Brunnen auf der Außenkante der Platte, um Unterschiede bei der Verdunstung und thermische Veränderungen in der Platte zu vermeiden. Füllen Sie die äußere Vertiefungen mit 100 µL PBS.</li>
		<li>0,15 µmol MCP-1-Peptid, MCP-1 PAM, Rührei Peptid oder Rührei-PAM in 150 µL PBS in separaten, sterilisierte Mikrozentrifugenröhrchen auflösen. Führen Sie serielle Verdünnung um 65 µL 1, 10 und 100 µM jeder Probe zu machen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL PBS für jede Konzentration in Brunnen mit WEHI 274,1 (Gesamtvolumen: 100 µL pro gut, 6 Zeilen, insgesamt 96 Wells). 72 h inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in jede Vertiefung. 1 h inkubieren.</li>
		<li>Analysieren Sie die Absorption mit einem Teller Reader auf 490 nm oder basierend auf den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In-vitro- Micelle Bindung
	<ol>
<li>Samen 500.000 Monozyten in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte in 2 mL Medium mit 100 µM Cy5-Label MCP-1 PAM (10: 90 Molverhältnis von DSPE-PEG (2000)-Cy5 und MCP-1 PA). 1 h inkubieren.</li>
		<li>Sammeln Sie WEHI 274,1 durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die Medien.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie und waschen Sie die Zellen in 2 mL PBS. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 2 mL kalten 4 % Paraformaldehyd, die Zellen zu beheben. Bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Pipettieren der fixen Zellen auf einem sterilen Glas Deckgläschen in Brunnen von einem 6-Well-Platte. 400 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Paraformaldehyd. Waschen und Spülen mit 2 mL PBS einmal. Mit 1 mL PB Aufschwemmen Hinweis: Beim Spülen, nicht zu stören die Zellen auf das Deckglas.</li>
		<li>Setzen Sie 10 µL von 90 % Glycerin mit PBS-Puffer auf eine Folie. Benutzen Sie eine Nadel und Pinzette um zu holen das Deckglas. Trocknen Sie den Rand des Deckglases. Legen Sie vorsichtig das Deckglas auf einer Folie verdeckt.</li>
		<li>Versiegeln Sie vorsichtig den Rand des Deckglases mit klaren Nagellack. Legen Sie in den Kühlschrank bis bereit für die Bildgebung.</li>
		<li>Verwenden einen konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) installiert mit Lasern für Cy5 bei λErregung = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

MCP-1 PAMs sind eine vielversprechende molekulare Bildgebung-Plattform, bestehend aus einer hydrophilen targeting Peptid und hydrophobe Endstück, das treibt die selbstgebaute Natur der Nanopartikel. Diese Monocyte-targeting Micelle kann durch einfache Synthese und Reinigungsschritte der MCP-1-Peptid und DSPE-PEG (2000)-MCP-1 hergestellt werden. PAMs haben viele vorteilhafte Eigenschaften für molekulare Bildgebung in Vivo wie ihre Selbstmontage unter milden Bedingungen, intrinsische biologische Abbaubarkeit und s...

Herz-Kreislauf-Krankheiten bleiben die führenden Todesursachen weltweit mit etwa 17,3 Millionen Todesfälle weltweit1. Herz-Kreislauf-Krankheiten sind durch Arteriosklerose, eine Bedingung trugen in denen Plaques in den Arterien, dadurch hemmende Blut- und Sauerstoffzufuhr zu den Zellen des Körpers2,3bauen. Die Progression der Atherosklerose beinhaltet die Verdickung und Verhärtung der Arterien durch eine entzündliche Reaktion, unregelmäßige Fettstoffwechsel und Plaquebildung, führt zu Plaque Ruptur und Myokardinfarkt4,5. Endothelzellen express Zytokine und Adhäsion Moleküle, die MCP-1, die an den C-C Chemokin-Rezeptor (CCR2 enthalten) auf der Oberfläche der Monozyten6,7,8bindet. Oxidiertes Cholesterin wandelt Monozyten zu Makrophagen in der frühen Phase der Plaquebildung, die verstärkt der entzündlichen Reaktion in der Region und führt zu Gewebeschäden und die Bildung von Plaques instabil oder gefährdeten9, 10.
Traditionell wird Arteriosklerose durch die Beurteilung der luminalen Stenose durch anatomische Bildgebung mit Ultraschall oder Angiographie11,12ausgewertet. Diese Methoden können aber nur feststellen starke Verengung der Arterienwand und nicht die frühen Stadium der Arteriosklerose, wie erste Gedenktafel Wachstum führt zu arteriellen Umbau um Arterie Größe beizubehalten und blood Flow Rate12,13, 14. Daher underrepresent Angiogramme Atherosklerose Prävalenz. Darüber hinaus nicht-invasive bildgebende Verfahren wie single Photonenemission berechnet Tomographie, Positronen-Emissions-Tomographie und Magnetresonanz-Bildgebung vor kurzem wurden verwendet, um Plaque-Morphologie zu charakterisieren, da sie erste Details bieten können und Charakterisierung von Plaques. Aber diese Modalitäten sind oft begrenzt durch den Mangel an Sensibilität, räumliche Auflösung, oder erfordern die Verwendung von ionisierender Strahlung, machen bildgebende Plaque Fortschreiten in den verschiedenen Phasen viel mehr herausfordernde15,16, 17. Ein bildgebendes System der Lieferung, das speziell Plaques in den verschiedenen Phasen der Atherosklerose identifizieren würde bleibt entwickelt werden.
Nanopartikel haben eine neue Plattform für in Vivo Plaque-targeting und Diagnostik18,19,20,21gezeigt. Insbesondere sind PAMs vorteilhaft aufgrund ihrer chemischen Vielfalt und die Fähigkeit, eine Vielzahl von Moieties, Kompositionen, Größen, Formen und Oberflächen Funktionalisierung22unterbringen. Peptid amphiphilen (PAs) bestehen aus einem hydrophilen, Peptid "Headgroup" befestigt eine hydrophobe Schwanz, die in der Regel sind Lipide; Diese amphiphile Struktur verleiht selbstorganisierende Funktionen und ermöglicht eine multivalente Anzeige der Peptide auf der Oberfläche der Partikel22,23,24. Die Peptid-Headgroups beeinflussen die Kornform durch Falt- und Wasserstoffbindung zwischen Peptide25. Peptide, die durch die Interaktion der β-Blatt Falten haben gezeigt, dass längliche Micellen zu bilden, während α-helikale Bestätigung sowohl sphärische und längliche Micellen22,23,24, bilden kann 25,26,27. Polyethylenglykol (PEG) linker, die Oberflächenladung des Peptids schützen können zwischen der hydrophilen Peptid und das hydrophobe Ende der PAMs, Verbesserung der Verfügbarkeit der Nanopartikel im Körperkreislauf28, platziert werden 29 , 30 , 31. PAMs sind auch vorteilhaft, weil sie biokompatibel sind und gezeigt haben, dass ein breites Spektrum von Anwendungen32,33. Die Wasserlöslichkeit von Micellen bietet einen Vorteil gegenüber anderen Nanopartikel-basierten Systemen wie z. B. bestimmte Polymere Nanopartikel, die nicht in Wasser löslich und in Lösungsvermittler für Injektionen34ausgesetzt werden. Darüber hinaus macht die Fähigkeit zum Erstellen von PAMs, das Zerlegen in Reaktion auf bestimmte Reize PAMs einen attraktive Kandidaten für kontrollierte intrazellulären Droge Lieferung35.
Durch Bindung an den Rezeptor CCR2 und akkumulieren in den Aortenbogen, wurden zuvor PAMs für Monocyte gezielt zur Überwachung der verschiedener Phasen von atherosklerotischen Läsionen in der Aorta9entwickelt. ApoE- / - Mäusen Monocyte Ansammlung steigt proportional zu Plaque Fortschreiten36. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Patienten mit Ruptur neigende, Spätstadium Plaques höhere Mengen an Monozyten37 enthalten. Daher ist die Änderung der PAMs, MCP-1 einzubeziehen nützlich, denn es größere targeting Spezifität und Differenzierung zwischen frühen und späten Stadium atherosklerotische Läsionen ermöglicht. Diese Proof-of-Concept-Studien überprüft auch, ob PAMs sind sicher genug vorklinisch verwendet werden und renally38deaktiviert sind. Da Monozyten und Entzündungen charakteristisch für andere Krankheiten sind, haben MCP-1 PAMs das Potenzial, für therapeutische und diagnostische Anwendungen in anderen Krankheiten über Arteriosklerose8,39,40 verwendet werden , 41.
Hier berichten wir über die Herstellung von hoch skalierbare und selbst-zusammengebauten MCP-1 PAMs, die optimale Größe, Oberflächenladung und gezielte Ausrichtung auf Monozyten für erweiterte imaging-Anwendungen in Atherosklerose des Teilchens nachgewiesen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>10 mL serologische Einwegpipetten</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen, Polypropylen</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>für verschiedene Anwendungen</td></tr><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoesäure, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>für MALDI</td></tr><tr><td>25 mL Einweg serologische Pipetten</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>5 mL serologische Einwegpipetten</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>für verschiedene Anwendungen</td></tr><tr><td>75 cm2 Kulturkolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>für Zellkulturen</td></tr><tr><td>75 mL Reaktionsgefäß</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>96-Wells Zellkulturplatte</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>für MTS-Assay</td></tr><tr><td>Acetonitril, HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>für die HPLC-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Borosilikatglas, 1 Dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>für die PAM-Synthese</td></tr><tr><td>Borosilcat-Glaspipette, lange Spitzen</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>für verschiedene Anwendungen</td></tr><tr><td>Deckglas, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>für die konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>Cy5-Amin</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>Diethylether, ACS-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>für die Peptidfällung</td></tr><tr><td>Einweg Spritzen, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>für die HPLC-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Doppeltes Neubauer-Regel-Hämozytometer</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>für die Zellzählung</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) Amin</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) Maleimid</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS-Ester&nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>für die Konjugation mit Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertem Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziertes, hitzeinaktiviertes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang Harz, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Ameisensäure, optima LC/MS-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>für die HPLC-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>für konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>Handzähler</td><td>Fisher</td><td>Scientific S90189</td><td>für die Zellzählung</td></tr><tr><td>Magnetrührstäbchen, eiförmiges</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>für die Peptidkonjugation</td></tr><tr><td>Methanol, ACS-zertifiziert</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>für die PAM-Synthese</td></tr><tr><td>kolorimetrisches MTS-Zellproliferations-Assay-Kit</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>für MTS-Assay</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid, Sequenzierqualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholin</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>Scientific AC416780250</td><td>für die Fixierung von Zellen</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>für verschiedene Anwendungen</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin, 10.000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Peptidsynthesegefäß, 25 mL& nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Phosphotungstinsäure&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>für TEM</td></tr><tr><td>Piperidin</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>für die Peptidsynthese</td></tr><tr><td>Objektträger aus einfachem Glas 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>für konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>Reagenzreservoire, steril&nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>für Zellkultur</td></tr><tr><td>Selbstschließende Pinzette</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>für TEM</td></tr><tr><td>TEM Trägerfolie</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>für TEM</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>für die Peptidspaltung und HPLC-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>für die Peptidspaltung</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>für die Zellzählung</td></tr><tr><td>Pinzette, universell gezahnt</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>für die konfokale Mikroskopie</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CRL-1679</td><td>Maus-Monozyten</td></tr><tr><td>automatisierter Tisch-Peptidsynthesizer</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Tisch-Peptidsynthesizer</td></tr><tr><td>&alpha;- Cyano- 4- Hydroxyzimtsäure, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>für MALDI</td></tr></tbody></table>

synthese von monocyte-targeting peptid amphiphile micellen für die bildgebung der atherosklerose

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Atherosklerose ist ein wesentlicher Faktor für kardiovaskuläre Erkrankungen, die häufigste Todesursache weltweit, der jährlich 17,3 Millionen Todesopfer fordert. Atherosklerose ist auch die häufigste Ursache des plötzlichen Tod und Myokardinfarkt, angestiftet von instabilen Plaques, die platzen und verdecken das Blutgefäß ohne Vorwarnung. Aktuelle bildgebende Modalitäten kann nicht unterscheiden zwischen stabilen und instabilen Plaques, die platzen. Peptid amphiphilen Micellen (PAMs) können diesen Nachteil überwinden, wie sie können, mit einer Vielzahl geändert werden von targeting Moieties, die speziell auf erkranktes Gewebe zu binden. Monozyten haben gezeigt, zu frühe Marker für Arteriosklerose, während große Ansammlung von Monozyten Plaques anfällig für Bruch zugeordnet ist. Daher können Nanopartikel, die Monozyten abzielen kann verwendet werden, verschiedene Stadien der Arteriosklerose zu unterscheiden. Zu diesem Zweck hier beschreiben wir ein Protokoll für die Vorbereitung des Monocyte-targeting PAMs (Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sind selbst zusammengebaut durch Synthese unter milden Bedingungen, Form Nanopartikel von 15 nm im Durchmesser mit in der Nähe von neutralen Oberflächenladung. In Vitro, PAMs erwiesen sich biokompatible und hatte eine hohe Bindungsaffinität für Monozyten. Die hier beschriebenen Methoden zeigen, Versprechen für ein breites Anwendungsspektrum in Atherosklerose sowie anderen entzündlichen Erkrankungen.

Vorbereitung von MCP-1 PAM Das CCR2-Bindung-Motiv (Rückstände 13-35) der MCP-1 Protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] oder Rührei Peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] wurde modifiziert, indem ein Cystein-Reste auf dem N-Terminus. Das MCP-1-Peptid wurde durch eine Fmoc-vermittelten Festphasen-Methode unter Verwendung eines automatisierten Peptid-Synthesizers synthetisiert. Das rohe-Peptid wurde gereinigt, durch Reverse-Phase-HPLC auf eine Spalte C8 bei 50 ° C mit 0,1 % TFA in Ace...

Dieses Papier stellt eine Methode, mit der Synthese und Charakterisierung von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen und den entsprechenden assays für Biokompatibilität und Fähigkeit der Micelle binden an Monozyten zu testen.

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Synthese von auf Monozyten abzielenden amphiphilen Peptidmizellen für die Atherosklerose-Bildgebung. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zur diagnostischen Bildgebung von atherosklerotischen Plaques zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Einbau von amphiphilen Peptidmizellen mit MCP-1 eine größere Targeting-Spezifität und Differenzierung zwischen atherosklerotischen Läsionen im Früh- und Spätstadium ermöglicht.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Plaque in verschiedenen Stadien der Atherosklerose, da Patienten mit rupturanfälligen Plaques im Spätstadium eine höhere Anzahl von Monozyten enthalten. Obwohl diese Methode Aufschluss über Atherosklerose geben kann, kann sie auch auf andere Krankheiten wie Krebs angewendet werden. Jonathan Wang, ein Doktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren mit mir demonstrieren.Beginnen Sie mit dem Abwiegen von 0,25 Millimol fmach-L-Lysin-bach-wong-Harz in einem Reaktionsgefäß. Füllen Sie das Gefäß in einen chemischen Abzug und spülen Sie die Gefäßseiten mit fünf Millilitern Dimethylforamid aus. Laden Sie das Reaktionsgefäß und die vorverpackten Aminosäurefläschchen vom C-zu-N-Terminus auf einen automatisierten Tisch-Peptidsynthesizer, einschließlich eines leeren Fläschchens am Ende für das abschließende Entschützungssetp.Nach der Synthese werden die Peptide und das Harz aus dem Reaktionsgefäß in ein Szintillationsfläschchen mit zwei bis drei Millilitern Methanol überführt, bis das gesamte Harz übertragen wurde. Wenn das Harz auf den Boden des Fläschchens gesunken ist, entfernen Sie das Supernan und lassen Sie das Harz an der Luft trocknen, gefolgt von einer Vakuumtrocknung für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur. Wenn das Fläschchen vollständig getrocknet ist, befestigen Sie die untere Hälfte eines Synthesegefäßes mit einer Klemme auf einem Armschüttler und geben Sie zwei Milliliter Spaltlösung in das Szintillationsfläschchen.Übertragen Sie das gesamte Volumen des Peptidharzes in das Synthesegefäß und waschen Sie die Seiten des Gefäßes mit drei Millitern frischer Spaltlösung. Schütteln Sie dann das Gefäß mit Deckel vier Stunden lang mit 300 Schwingungen pro Minute. Am Ende der Schüttelinkubation wird die gespaltene Peptidlösung in ein ausgewogen gewogenes konisches 50-Milliliter-Röhrchen abgelassen und das Synthesegefäß mehrmals mit der restlichen Spaltlösung gespült.Verdampfen Sie die gespaltene Peptidlösung mit Stickstoff, bis weniger als vier Milliliter Lösung im Zentrifugenröhrchen verbleiben, und fügen Sie der gespaltenen Peptidlösung 36 Milliliter eiskalten Ether hinzu. Wirbeln Sie die resultierende Lösung ein. Wenn die Suspension vollständig weiß oder gelb wird, pelletieren Sie die Peptide durch Zentrifugation.Resuspendieren Sie das Peptid in 40 Millilitern eiskaltem Äther und Wirbel und beschallen Sie das Peptid erneut. Nach einer zweiten Zentrifugation und dem Dekantieren des Überstands wird das rohe Peptid-Amphiphil-Pellet mit Stickstoffgasspülung getrocknet. Wenn der Äther sichtbar verdampft ist, geben Sie 20 Milliliter doppelt destilliertes Wasser in das Röhrchen, wirbeln Sie das Röhrchen und beschallen Sie es, bis das Peptid vollständig in Lösung aufgelöst ist.Frieren Sie die Lösung ein und lassen Sie sie trocknen. Wiegen Sie dann das Röhrchen erneut und lösen Sie das Rohpeptid in fünf Milligramm pro Milliliter Wasser auf. Injizieren Sie anschließend das gesamte Volumen des rohen MCP-1-Peptids in ein Hochleistungs-Flüssigchromographie- oder HPLC-Instrument.Analysieren Sie jede Fraktion mit Hilfe der matrixgestützten Laserdesorptionsionisations-Massenspektroskopie auf die erwartete Produktmassenladung bei 2.890. Kombinieren Sie dann die Produktfraktionen. Blasen Sie das Acetonitril ab und frieren Sie die gereinigten Peptide ein und lifelisieren Sie sie, bis sie trocken sind.Um die MCP-1-Peptidamphiphile oder PAs herzustellen, lösen Sie zunächst das lifelisierte Peptid in 15 Milligramm pro Milliliter Wasser auf und kombinieren Sie die Peptidlösung mit 15 Milligramm pro Milliliter DSPE PEG 2000 Millimidlösung. Fügen Sie tropfenweise ein Mol Natriumhydroxid hinzu, bis der pH-Wert der Lösung sieben beträgt. Dann wird der Stickstoff fünf Minuten lang gespült, gefolgt von einem Rühren über Nacht.Am nächsten Morgen frieren Sie die Lösung ein und leben sie. Wenn das Rohprodukt trocken ist, lösen Sie den Feststoff in fünf Milligramm pro Milliliter Wasser auf und reinigen Sie das Peptid durch HPLC, wie gerade gezeigt. Um die PA-Membranen zusammenzusetzen, lösen Sie 1,75 Milligramm der MCP-1 PA in drei Millilitern Methanol in einem Ein-Dram-Fläschchen und beschallen Sie, bis das MCP-1 PA vollständig aufgelöst ist.Verdampfen Sie das Methanol unter Stickstoff, während Sie das Fläschchen in kreisenden Bewegungen bewegen und das restliche Methanol von den Seiten des Fläschchens abspülen, bis sich am Boden ein gleichmäßiger Film bildet. Trocknen Sie die Folie über Nacht. Am nächsten Morgen hydratisieren Sie den Film mit drei Millilitern Wasser, um eine 100 Mikromolare MCP-1 PAM-Lösung herzustellen, und wirbeln und beschallen Sie die Lösung vorsichtig, bis sie klar ist.Inkubieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius und kühlen Sie dann die resultierende Dispersion ab. Im folgenden repräsentativen Experiment wurden MCP-1 und das Rührpeptid durch Umkehrphasen-HPLC auf einer CA-Säule bei 50 Grad Celsius unter Verwendung von 0,1%Trifluoressigsäure in Acetonitril-Wassergemischen aufgereinigt. Und charakterisiert durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie, wie gerade gezeigt.Die verzichtenden Peptide wurden auf DSPE PEG 2000 Milliamid konjugiert, um DSPE PEG 2000 Peptidkonjugate über eine Thioetherbindung zu erhalten, und durch HPLC unter Verwendung einer C4-Säule aufgereinigt. Die dynamische Lichtstreuungsanalyse und die transmissionselektronenmikroskopische Bildgebung der Monozyten-Targeting-PAMs zeigten gut dispergierte sphärische Nanopartikel mit leicht positiven Zetapotentialen. Die spektroskopieische Analyse der Zirkulardikroismen bestätigte, dass der Einbau des MCP-1-Peptids in die Mizelle die Sekundärstruktur verbesserte.Die Inkubations-Amalse-Monozyten mit bis zu 100 mikromolaren Konzentrationen von MCP-1-Peptid, MCP-1-PAM, Scramble-Peptid und Scramble-PAM für 72 Stunden zeigten die Lebensfähigkeit und Biokompatibilität der Peptide. Die spezifische Bindung der Monozyten an MCP-1 PAMs im Vergleich zu Crambled PAMs wird dann durch konfokale Mikroskopie festgestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man durch die Synthese und Reinigung des MCP-1-Peptids und die Herstellung der MCP-1-Peptid-Amphiphil- und Mizellenassemblierung Monozyten-Targeting-Peptid-Amphiphil-Mizellen vorbereitet.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Reagenzien extrem gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesen Materialien immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Lesen des Sicherheitsdatenblatts und das Arbeiten in einem chemischen Abzug.

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Forschung

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Biotechnik

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Erfahren Sie die Synthese von monozytenzielenden Peptid-Amphiphil-Micellen zur verbesserten Bildgebung der Atherosklerose. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung zwischen frühen und späten Plaques.

Synthese von Monocyte-targeting Peptid Amphiphile Micellen für die Bildgebung der Atherosklerose

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