In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein Protein von Interesse zu verifizieren, das SUMOyliert werden kann oder ein SUMO E3-Lygas ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der SUMOylierung zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von SUMO E3-Lygas. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zur Untersuchung der SUMO E3-Lygasspezifität gegenüber verschiedenen SUMO-Isoformen verwendet werden kann.

Das Verfahren wird von Wan-Shan Young, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um den Tag K-bZIP zu reinigen, inkubieren Sie zunächst 10 Milliliter zelluläres Lysat mit 50 Mikrolitern antikörpermarkierten magnetischen Kügelchen in einem 14-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Drehen Sie dann den Schlauch mit 50 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius für drei Stunden in einem Schwebemischer.

Sobald das Protein eingefangen ist, zentrifugieren Sie die Probe bei 800 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius, um die Kügelchen zu pelletieren. Entsorgen Sie alle bis auf einen Milliliter Überstand, um die Kügelchen wieder aufzuwirbeln. Und geben Sie die aufgelösten Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Um die eingefangenen Proteine zu waschen, stellen Sie das Röhrchen mit den Kügelchen auf einen Magnetständer. Warten Sie etwa drei Sekunden, bis die Kügelchen an den Seitenwänden der Tube haften, und entfernen Sie dann den Überstand. Um die Kügelchen zu waschen, geben Sie einen Milliliter Lysepuffer in das 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Dann drehen Sie das Rohr zehnmal um. Legen Sie dann das 1,5-Milliliter-Röhrchen auf den Magnetständer und entfernen Sie den Überstand, sobald die Kügelchen an den Wänden haften. Um die Kügelchen erneut zu waschen, geben Sie einen Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung in das 1,5-Milliliter-Röhrchen und drehen Sie es zehnmal um.

Setzen Sie dann das Rohr auf den Magnetständer und entfernen Sie den Überstand, sobald die Perlen an den Seitenwänden befestigt sind. Um die K-bZIP-markierten Proteine aus den Antikörper-markierten magnetischen Kügelchen zu eluieren, fügen Sie 100 Mikroliter à 150 Mikrogramm pro Milliliter Octapeptid hinzu, das in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt ist, in das 1,5-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie dann das Rohr auf einem Schwebemischer zehn Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 Umdrehungen pro Minute.

Setzen Sie das Rohr auf den Magnetständer um. Und dann sammeln Sie den K-bZIP-Überstand, der den Überstand enthält. Als nächstes wird zur Analyse des gereinigten K-bZIP-Tags ein bis fünf Mikroliter des gereinigten Proteins der SDS-Seite unterzogen, gefolgt von einer Coomassie-Blau-Färbung.

Laden Sie 0,5, 1 und 2 Mikrogramm Rinderserumalbumin als Standards auf das Gel zur Quantifizierung der K-bZIP-Konzentration. Während der Verarbeitung des Bildes auf Bild J.Als nächstes verdünnen Sie das gereinigte K-bZIP in phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Um eine Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen.

Und bei minus 80 Grad Celsius in kleinen Aliquots lagern. Fügen Sie drei Mikroliter mit 100 Nanogramm pro Mikroliter gereinigtem markiertem K-bZIP in der In-vitro-SUMOylierungs-Mastermix-Reaktion hinzu. Anschließend den Inhalt des Mastermixes vorsichtig mischen und drei Stunden bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Fügen Sie als Nächstes 20 Mikroliter 2X SDS-Seite mit Ladepuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius, um das Protein zu denaturieren. Laden Sie als Nächstes 20 Mikroliter der Probe auf ein 10%iges SDS-Seitengel.

Und lassen Sie das Gel etwa 120 Minuten lang bei 80 Volt laufen, bis der Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Sobald die Elektroparese vorbei ist, trennen Sie das Gelgerät. Und übertragen Sie das Gel fünf Minuten lang in halbtrockenen Transferpuffer

Weichen Sie dann die PVDF-Membran eine Minute lang in einem anderen mit Methanol gefüllten Behälter ein. Entfernen Sie die PVDF-Membran vom Methanol und weichen Sie es in halbtrockenem Transferpuffer ein. Bewegen Sie dann die Membran fünf Minuten lang vorsichtig.

Entfernen Sie die Sicherheitsabdeckung des halbtrockenen Elektrophoresegeräts. Befeuchten Sie ein Filterpapier vor. Und bereiten Sie ein Gelsandwich auf der Unterseite der Platinanode vor.

Nachdem Sie die Kathodenplatte in der Sicherheitsabdeckung befestigt haben, lassen Sie den Blot 90 Minuten lang mit 15 Volt Konstantstrom laufen. Schalten Sie dann die Stromversorgung aus und nehmen Sie die PVDF-Membran heraus, nachdem Sie das halbtrockene Gerät getrennt haben. Blockieren Sie nun die PVDF-Membran mit Blocking-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler bei 30 Umdrehungen pro Minute.

Als nächstes hybridisieren Sie die PVDF-Membran mit Anti-p53-Antikörpern und Blockierungspuffer für 12 bis 16 Stunden bei vier Grad Celsius auf einem Schwebemischer bei 30 Umdrehungen pro Minute. Nehmen Sie dann die PVDF-Membran heraus und geben Sie sie in einen Behälter, der mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween 20 gefüllt ist. Als nächstes tränken Sie die PVDF-Membran 30 Minuten lang in Tris-gepuffertem Kochsalz-Tween 20 auf dem Orbitalschüttler bei 45 Umdrehungen pro Minute.

Hybridisieren Sie dann die PVDF-Membran mit Anti-Kaninchen-Antikörpern, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, verdünnt in Blockpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Suspensionsmischer bei 30 Umdrehungen pro Minute. Waschen Sie anschließend die PVDF-Membran dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung zwischen 20. Nach dem Waschen die PVDF-Membran in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween 20 für 30 Minuten auf dem Schwebemischer bei 45 Umdrehungen pro Minute einweichen.

Ersetzen Sie dann die Tris-gepufferte Kochsalzlösung Tween 20 durch phosphatgepufferte Kochsalzlösung. Um die PVDF-Membran bis zu 12 Stunden lang bei vier Grad Celsius zu konservieren. Mischen Sie als Nächstes die verbesserten Chemilumineszenz-Substratreagenzien eins und zwei in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis.

Entfernen Sie dann die PVDF-Membran von der phosphatgepufferten Kochsalzlösung und tupfen Sie sie kurz mit den Stanztaschen ab, um die überschüssige Feuchtigkeit aufzunehmen. Geben Sie sofort 400 Mikroliter des Chemilumineszenz-Reagenzes auf die Membranoberfläche und warten Sie drei bis fünf Minuten. Tupfen Sie es kurz ab, um das überschüssige Chemilumineszenz-Reagenz abzulassen, damit die Membran nicht vollständig austrocknet.

Verwenden Sie das Bildgebungssystem von Luminescent, um den Blot freizulegen. Hier wurde eine Immun-Blot-Analyse durchgeführt, um die Konzentration des Ubc9-Enzyms zu zeigen, die für die SUMOylierung der p53-Ziele erforderlich ist. Dies zeigt, dass 1/2 und 1/5 der Konzentration des Ubc9-Enzyms das p53-Enzym in einem in vitro SUMOylierungsassay mit SUMO 1 und SUMO 2 Peptiden ausreichend SUMOylieren kann.

Um das SUMOylierte p53 zu analysieren, wurde die Membran mit anti-p53-Antikörpern untersucht. Eine ähnliche Immuno-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um zu zeigen, dass die Hälfte der E1- und 1/10-Konzentration von Ubc9-Enzymen erforderlich ist, um das p53-Ziel in einem in vitro SUMOylierungsassay mit SUMO 1-, SUMO2- und SUMO 3-Peptiden zu SUMOylieren. Hier wurde die Membran mit Coomassie gefärbt, um das gereinigte K-bZIP-Protein zu zeigen.

Das Baculovirus-Expressionssystem wurde verwendet, um das gereinigte K-bZIP zu exprimieren, das auf der SDS-Seite mit Rinderserumalbumin als Standard zum Vergleich analysiert wurde. Es wurde auch eine zusätzliche Immun-Blot-Analyse durchgeführt, die zeigte, dass bei Erhöhung der Konzentration von K-bZIP die SUMOylierung von p53 in Gegenwart der Hälfte der Menge an E1 bzw. 1/10 der Menge an Ubc9-Enzymen katalysiert wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das gesamte Reagenz für den in vitro SUMOylierungsassay auf Eis zu halten und die Serienverdünnung und nicht in einer riesigen Verdünnung durchzuführen. Mit diesem Verfahren können andere Methoden wie die Überexpression von SUMOlygase durchgeführt werden, um die SUMOylierung in vitro zu überprüfen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der SUMOylierung, mehr SUMOlygas zu erforschen und ihre Spezifität zu validieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein SUMO e3-Lygas mit Hilfe eines In-vitro-Simulationsassays identifiziert.