Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Verschlingungs- und Abbaukinetik von Gliazellen wie Astrozyten und Mikroglia in Echtzeit durch in vitro Live-Bildgebung der Phagozytose von pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen zu detektieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie die Gliazellphagozytose in gesunden und kranken Gehirnen reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die phagozytäre Kinetik von Gliazellen in Echtzeit durch Live-Bildgebung von in vitro kultivierten Zellen effektiv überwachen und analysieren können.

Diese Methode kann auch verwendet werden, um nach Faktoren und Verbindungen zu suchen, die die Verschlingungs- und Abbaukapazität von Gliazellen regulieren. Beginnen Sie mit der Zentrifugation der aufgetauten Synaptosomenproben für drei bis vier Minuten bei 21,092 g und vier Grad Celsius. Nach dem Aspirieren der Überstände werden die Pellets in 200 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumcarbonat pro Röhrchen wieder suspendiert und jeder Probe zwei Mikroliter pH-Indikator zugesetzt, nachdem sie gründlich gemischt wurden.

Schützen Sie die Lösungen nach einem sanften Vortex mit Aluminiumfolienabdeckungen vor Licht und legen Sie die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren in einen Drehschüttler. Am Ende der Inkubation fügen Sie einen Milliliter Dulbecco's PBS oder DPBS hinzu und sammeln Sie die Synaptosomen durch Zentrifugation, wobei das Pellet in einem Milliliter frischem DPBS pro Waschgang wieder suspendiert wird. Nach der letzten Zentrifugation wird das nicht funktionsfähige Synaptosomen-Pellet in 200 Mikrolitern DPBS, ergänzt mit 5 % DMSO, erneut suspendiert.

Für eine Live-Bildgebung des Synaptosomen-Engulfments entfernen Sie zunächst den Überstand aus jeder Vertiefung einer konfluenten Astrozytenkultur und waschen die Zellen dreimal schnell mit einem Milliliter DPBS pro Waschgang. Fügen Sie nach der letzten Wäsche 300 Mikroliter immunpaniertes Astrozyten-Basismedium und fünf Mikroliter der pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen sowie alle zusätzlichen Faktoren hinzu, die die Phagozytose der Gliazellen modulieren können. Lassen Sie die Synaptosomen sich am Boden der Vertiefungen absetzen und sich bei 37 Grad Celsius und 5 % Co2 an Phosphatidyl-Serinrezeptoren auf den Astrozyten binden.

Entsorgen Sie nach 40 Minuten die Überstände und waschen Sie die Vertiefungen schnell, aber vorsichtig dreimal mit einem Milliliter DPBS pro Waschgang. Nach dem letzten Waschen 500 Mikroliter frisches Medium, ergänzt mit den interessierenden Faktoren, in die entsprechenden Vertiefungen geben und die Platte in ein Live-Imaging-Instrument überführen. Wählen Sie die Bildgebungspositionen aus, passen Sie den Fokus, die Belichtungszeit, die Helligkeit und die LED-Leistung an und stellen Sie das Bildformat, das Zeitintervall und die Gesamtzahl der Zyklen für die Live-Bildgebung nach experimenteller Eignung ein.

Beginnen Sie dann mit der Live-Bildgebung der Phagozytose-Experimente. Öffnen Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt ein imagine-Analyseprogramm und importieren Sie die Zeitraffer-Bildsequenz. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit-Graustufen und initiieren Sie eine Hintergrundsubtraktion mit einem Rollbalkenradius von 50 Pixeln.

Öffnen Sie als Nächstes das Time Series Analyzer V3-Plug-in und ziehen Sie den Interessenbereich in das Plug-in. Klicken Sie im Manager für die Interessenregion auf Hinzufügen. Klicken Sie im Time Series V3-Plug-in auf Gesamtintensität abrufen.

Speichern Sie dann die Ergebnisse und integrieren Sie die Daten. Nach ihrer Präparation exprimieren die Synaptosomen Phosphatidylserin auf ihren äußeren Membranen, was auf einen Funktionsverlust hindeutet, was an Phosphatidylserinrezeptoren auf Astrozyten und Mikroglia zu erkennen ist. Da die pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen phagozytiert werden, emittieren sie hellrote Fluoreszenzen.

Um die Phagozytose von Gliazellen zu quantifizieren, kann die Fläche des roten Fluoreszenzsignals oder des phagozytären Index gemessen werden. Obwohl Astrozyten effizient darin sind, eine große Anzahl von pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen zu phagozytieren, sind Mikroglia schneller darin, die Synaptosomen zu verschlingen und abzubauen. Interessanterweise sind Astrozyten-sekretierte Faktoren, die in Astrozyten-konditioniertem Medium enthalten sind, essentiell für die Erhöhung sowohl der Astrozyten- als auch der Mikroglia-vermittelten Phagozytose.

Darüber hinaus zeigten MEGF10-Knockout-Astrozyten der Maus im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine signifikant beeinträchtigte phagozytische Kapazität. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der Gliazellbiologie, um die Mechanismen zu erforschen, die an der Modulation der Gliazellphagozytose beteiligt sind, als potenzielle Methode zur Behandlung verschiedener neurologischer Störungen.