Name: Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Erfahren Sie ein Live-Imaging-Assay zur Phagozytose von Astrozyten mit pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für Neurowissenschaften.

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Die Autoren danken Yeon-Joo Jung für ihre experimentelle Unterstützung während Synaptosome Reinigung und Jungjoo Park für Bilder von Synaptosomes mit PS-Exposition. Darüber hinaus danken wir allen Mitgliedern in chungs Labor für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschuss finanziert von der koreanischen Regierung (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 und NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden für einen langfristigen live-Imaging in Vitro Phagozytose-Assay mit gereinigtem Gliazellen und pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes. Wir zeigen, dass im Vergleich zu Mikroglia, Astrozyten besitzen unterschiedlichen Engulfment und Abbau Kapazität während der Phagozytose von Synaptosomes. Darüber hinaus unsere Daten deuten darauf hin, dass Astrozyten abgesondert Faktoren, die Überbrückung Moleküle wie GAS6, Proteine und MEGE8 enthalten, entscheidend für effiziente PS-abh...

Gliazellen, die nicht leicht erregbaren Zellen im Gehirn beziehen, sind die wichtigen Zelltyp in das zentrale Nervensystem (ZNS). Zuvor galten Gliazellen als bloße Stützzellen, die vor allem passive Rollen bei der Aufrechterhaltung neuronaler überleben und basalen synaptischen Eigenschaften spielen. Anzeichen dafür ergab jedoch, dass Gliazellen in verschiedene Aspekte der Neurobiologie, wie Gehirn Homöostase, Vermittlung von Synapse Bildung1,2,3 und Synapse eine aktivere Rolle spielen Beseitigung4,5, und modulierenden synaptische Plastizität6,7. Gliazellen des ZNS gehören Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Zwischen diesen Zellen, Astrozyten und Mikroglia haben gezeigt, dass phagocytic Rollen zu spielen, indem Sie verschlingen Synapsen4,5, apoptotischen Zellen8, neuronale Trümmer9und Pathogene Proteine wie Amyloid beta Plaketten10,11. In das sich entwickelnde Gehirn beseitigen Astrozyten Synapsen im dorsalen seitlichen gekniet Nucleus (CGN) durch MERTK und MEGF10-abhängige Phagozytose4. In ähnlicher Weise Mikroglia auch beseitigen C1q-beschichtete Synapsen während Entwicklungsstadien durch die klassische Ergänzung Kaskade5. Interessanterweise wurde vermutet, dass Mängel in Synapse beschneiden einer der Initiatoren von verschiedenen neurologischen Störungen sein können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Mutationen in Ergänzung Komponente 4 (C4), die Ergänzung-vermittelten Synapse Beschneiden von Mikroglia zunimmt, eng mit der Prävalenz von Schizophrenie in Menschen12 sind. Eine neuere Arbeit hat auch gezeigt, dass die klassische Ergänzung Bahn Überaktivierung in der Einleitung von AD und frühem Verlust der Synapse in dieser Krankheit13induziert.
Verglichen mit Mikroglia-vermittelten Phagozytose, ob Astrozyten vermittelt Phagozytose, die Initiierung und Progression von verschiedenen neurologischen Erkrankungen beiträgt, ist weniger klar. Eine neuere Arbeit legt jedoch nahe, dass Faktoren, die die Rate der normalen Synapse Beschneidung von Astrozyten verändern können Gehirn Homöostase zu stören und zu AD Anfälligkeit und Pathologie14beitragen. Die Rate der Synapse Beschneidung von Astrozyten steuert kraftvoll ApoE -Isomere, mit einer schützenden Allel für AD (ApoE2) stark erhöhen die Rate und eine Risiko-Allel für AD (ApoE4) die Rate deutlich zu senken. Darüber hinaus angesammelt transgene Mäuse, die mit dem Ausdruck ApoE4 viel mehr synaptische C1q als Kontrolle oder ApoE2 Mäuse14. Diese Daten deuten darauf hin, dass Sehbehinderte Astrozyten vermittelt Phagozytose in den frühen AD Gehirn kann induzieren die Anhäufung der alternde C1q-beschichtete Synapsen/synaptische Trümmer, die Ergänzung-vermittelten Mikroglia Phagozytose, fahren synaptischen Degeneration aktiviert . Die beeinträchtigte phagocytic Kapazität der Astrozyten in ApoE4 Trägern kann auch die unkontrollierte Anhäufung von Beta Amyloid-Plaques im Gehirn AD betroffen beitragen.
Darüber hinaus hat gezeigt, dass Gliazellen im Gehirn im Alter von Drosophila ihre phagocytic Kapazität aufgrund der verringerten Übersetzung von Draper, ein Homolog des Megf10 , die Astrozyten verwenden verlieren für phagocytosing Synapsen. Wiederherstellen von Draper Ebenen gerettet phagocytic Kapazität von Gliazellen, die effizient beschädigte axonalen Schutt im alten Gehirn in ähnlichem Ausmaß wie im jungen Gehirn darauf hinweist, dass Altern ausgeglichen-induzierte Veränderungen in der phagocytic Kapazität von Astrozyten können zu Störungen des Gehirns Homöostase15beitragen.
Möglicherweise modulieren die phagocytic Kapazität der Astrozyten basierend auf diese neuen Erkenntnisse, eine attraktive therapeutische Strategie zur Vorbeugung und Behandlung von verschiedenen neurologischen Erkrankungen. In diesem Zusammenhang gab es mehrere Versuche, phagocytic Astrozyten, beispielsweise verstärkt durch Induktion Versauerung der Lysosomen mit sauren Nanopartikel16 und überexprimierenden Transkriptionsfaktor EB (TFEB), die erhöhen können Lysosomen Biogenese17. Trotz dieser Bemühungen ist noch unklar, wie Astrozyten und Mikroglia-Zellen unterscheiden sich in ihrer phagocytic Kinetik und ob wir erhöhen oder verringern Sie ihre phagocytic Kapazitäten bei verschiedenen Erkrankungen sollten.
In diesem Beitrag präsentieren wir eine neuartige in-vitro- Test zur Erkennung von phagocytic Kapazität der Astrozyten in Echtzeit. Die Daten zeigen unterschiedliche Kinetik der Engulfment und Abbau in Astrozyten und Mikroglia. Astrozyten konditioniertes Medium (ACM), die von Astrozyten sezernierten Faktoren enthält, ist essentiell für effektive Phagozytose von Astrozyten und Mikroglia. Darüber hinaus spielt Megf10, einen phagocytic Rezeptor in Astrozyten und ein Homolog von Ced-1 und Draper, wichtige Rollen in Astrozyten vermittelt Phagozytose8,18.

<table><tbody><tr><td>Synaptosomen-Aufreinigung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2</td><td>BIO-RAD</td><td>5000202</td><td></td></tr><tr><td>pHIndikator-Konjugation</td>Dimethylsulfoxid (DMSO)LPS-Lösung <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>DMSO100</tr><tr><td>pHrodo rot, Succinimidylester</td><td>Molecula Sonden</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Immunopanning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Earle' s ausgewogene Salzlösung (EBSS)</td><td>Sigma</td><td>E7510</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Bovogen</td><td>BSA025</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyrebonuklease 1 (DNase)</td><td>Worthington</td><td>Is002007</td><td></td></tr><tr><td>(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>(dPBS)</td><td>Welgene</td><td>LB001-02</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1)</td><td>Vector Labs</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG+IgM(H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-044</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgM (&mu;-kette)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-bindender epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Sigma</td><td>E4643</td><td></td></tr><tr><td>Humaner HepaCAM-Antikörper</td><td>R& D-Systeme</td><td>MAB4108</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Integrin-Beta-5-Antikörper (KN52)</td><td>eBioscience</td><td>14-0497-82</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetly-L-Cytein (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasale Medien</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>O4 Hybridom überstand(Maus IgM)</td><td>Bansal et al.23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>Is003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluristrainer 20 &mu; m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescindihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Ratte Anti-Maus CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigte Maus Anti-Ratte CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Natriumselenit</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>Ultraklares Rohr (Rohr, dünnwandig, ultraklar)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Collect IP-ACM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran (10k)</td><td>PALL</td><td>MAP010C37</td><td></td></tr><tr><td>Macrosep Advance Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran (30k)</td><td>PALL</td><td>MAP030C37</td><td></td></tr><tr><td>Phagozytose-Live-Imaging-AssayJuli-Tisch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NanoEntek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Time Series Analyzer V3 Plugins</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein neuartiges in vitro- live-imaging assay astrozyten vermittelt phagozytose mittels ph indikator konjugiert synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Astrozyten sind die wichtigen Zelltyp im Gehirn und Synapsen und Blutgefäße direkt zu kontaktieren. Obwohl Mikroglia-Zellen die wichtigsten Immunzellen und nur Fresszellen im Gehirn betrachtet, haben neuere Studien gezeigt, dass Astrozyten auch Teilnahme an verschiedenen phagocytic Prozesse, z. B. Entwicklungsstörungen Synapse Beseitigung und Clearance von Beta Amyloid-Plaques bei Alzheimer-Krankheit (AD). Trotz dieser Erkenntnisse ist die Effizienz der Astrozyten Engulfment und Abbau ihrer Ziele unklar im Vergleich mit der Mikroglia. Dieser Mangel an Informationen ist meist aufgrund des Fehlens von einem Testsystem, in denen die Kinetik der Astrozyten und Mikroglia vermittelt Phagozytose sind leicht vergleichbar. Um dieses Ziel zu erreichen, entwickelten wir einen langfristige live-Imaging in Vitro Phagozytose Assay zur Bewertung der phagocytic Kapazität der gereinigten Astrozyten und Mikroglia. In diesem Test ist Echtzeit-Erkennung von Engulfment und Abbau möglich mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes, die leuchtend rote Fluoreszenz in sauren Organellen, wie Lysosomen abgeben. Unsere neuartige Assay bietet einfache und effektive Erkennung von Phagozytose durch live-Imaging. Darüber hinaus kann dieser in-vitro- Phagozytose Assay als Screening-Plattform verwendet werden, um zu identifizieren, Chemikalien und Substanzen, die zu verbessern oder hemmen die phagocytic Kapazität der Astrozyten. Wie synaptic Pruning Fehlfunktion und Pathogene Protein Akkumulation gezeigt wurden, psychischen Störungen oder neurodegenerativen Erkrankungen verursachen, sollte Chemikalien und Substanzen, die die phagocytic Kapazität von Gliazellen modulieren hilfreich bei der Behandlung von verschiedenen neurologische Erkrankungen.

In dieser in Vitro Phagozytose Assay mit langfristigen live-Imaging verwendeten wir Synaptosomes von Erwachsenen Maus Gehirn Homogenates, die in der gradient Lösung zwischen 23 % Steigung und 10 % Steigung Lösung, durch Ultrazentrifugation getrennt waren ( ( Abbildung 3). Nach der Zubereitung ausgesetzt Synaptosomes PS in der äußeren Membran (Abbildung 4), was darauf hindeutet, dass sie ihre Funktion verloren und durch P...

Dieses Protokoll stellt einen in-vitro- live-Imaging Phagozytose Assay phagocytic Kapazität von Astrozyten zu messen. Gereinigte Ratte Astrozyten und Mikroglia sind zusammen mit pH-Indikator-konjugiert Synaptosomes verwendet. Diese Methode kann in Echtzeit Engulfment und Abbau Kinetik erkennen und bietet eine geeignete Screening-Plattform für Astrozyten Phagozytose modulierende Faktoren zu identifizieren.

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Verschlingungs- und Abbaukinetik von Gliazellen wie Astrozyten und Mikroglia in Echtzeit durch in vitro Live-Bildgebung der Phagozytose von pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen zu detektieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie die Gliazellphagozytose in gesunden und kranken Gehirnen reguliert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die phagozytäre Kinetik von Gliazellen in Echtzeit durch Live-Bildgebung von in vitro kultivierten Zellen effektiv überwachen und analysieren können.Diese Methode kann auch verwendet werden, um nach Faktoren und Verbindungen zu suchen, die die Verschlingungs- und Abbaukapazität von Gliazellen regulieren. Beginnen Sie mit der Zentrifugation der aufgetauten Synaptosomenproben für drei bis vier Minuten bei 21,092 g und vier Grad Celsius. Nach dem Aspirieren der Überstände werden die Pellets in 200 Mikrolitern 0,1 molaren Natriumcarbonat pro Röhrchen wieder suspendiert und jeder Probe zwei Mikroliter pH-Indikator zugesetzt, nachdem sie gründlich gemischt wurden.Schützen Sie die Lösungen nach einem sanften Vortex

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Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt, wie zu Synapse Anzahl sowohl in dissoziierten neuronalen Kultur und in Hirnschnitten mittels Immunzytochemie quantifizieren. Mit Fach-spezifische Antikörper, label wir präsynaptischen Terminals sowie Standorte der postsynaptischen Spezialisierung. Wir definieren Synapsen als Punkte der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von dieser Marker erzeugt.

Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

In diesem Video führen wir den mikroglialen Phagozytose-Assay für Neuroblastome mit induzierten pluripotenten Stammzellen durch. Der Assay hilft bei der Beurteilung der Beeinträchtigung der Mikrogliafunktion bei neurodegenerativen Erkrankungen.

Mikroglia-Phagozytose-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Etablierung eines Mikroglia-Phagozytose-Modells für Neuroblastomzellen unter Verwendung von iPSC-Makrophagen

In diesem Video bewerten wir die phagozytische Kapazität von gereinigten Astrozyten in vitro durch Live-Imaging-Assays. Der Assay dient als effektive Screening-Plattform zur Identifizierung chemischer Verbindungen, die die phagozytische Kapazität von Astrozyten erhöhen oder hemmen können.

In-vitro-Phagozytose-Assay: Eine auf Live-Bildgebung basierende Methode zur Untersuchung der Echtzeit-Astrozyten-vermittelten Synaptosomen-Phagozytose

Quelle: Funes, S., et. al., Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay unter Verwendung humaner Synaptosomen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der phagozytischen Kapazität von Mikroglia-ähnlichen Zellen unter Verwendung von pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff-markierten Synaptosomen.

Lebendzell-Phagozytose-Assay von Mikroglia-ähnlichen Zellen unter Verwendung humaner Synaptosomen

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die...

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia - Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für  In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Hier stellen wir zwei Protokolle zur Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von vGLUT1-positiven Synapsen und pHRodo Red markierten rohen Synaptosomen mittels Durchflusszytometrie vor.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Erfahren Sie ein Live-Imaging-Assay zur Phagozytose von Astrozyten mit pH-Indikator-konjugierten Synaptosomen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für Neurowissenschaften.

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

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