Name: Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Erfahren Sie eine standardisierte Mikrodissektionsmethode zur Analyse der adulten Zebrafisch-Retinavasculatur. Diese Technik ermöglicht die schnelle Untersuchung vaskulärer Pathologien wie Neoangiogenese bei diabetischer Retinopathie.

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Die Autoren möchten Katrin Bennewitz und Marlene Hausner Zebrafisch Tierhaltung und technische Hilfe zu danken. Die Autoren erkennen die Unterstützung der Core Facility Live Cell Imaging Mannheim im Zentrum für Biomedizin und medizinischen Technik Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Diese Studie wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (International Research Training Group 1874/1 "DIAMICOM" Projekt SP5 und SP9; Collaborative Research Center SFB1118, Projekt B1 und Collaborative Research Center SFB/TR23 Projekt Z5).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Modelle der Hypoxie-induzierten retinalen Neoangiogenese zeigen erhöhten Anzahlen von Verzweigungspunkten, angiogenen Sprossen, vaskuläre Gesamtfläche und verringerte interkapilläre Abstand im Zebrafisch-20. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass der Zebrabärbling anfällig für diabetische mikrovaskulärer Komplikationen21, wie wichtige Erkenntnisse der später diabetischen Retinopathie Hypoxie-vermittelten Neoangiogenese umfassen, die stark an VEGF Ausdruck gebunden ist. Hyperglykämie-induzierten Veränderungen in der Zebrafisch Netzhaut führen zu erhöhte Dicke der Schiffe aber pflegen die insgesamt22Musterung. Eintauchen in Glukose-Lösungen für 30 Tage abwechselnd verringert auch die Dicke der IPL und INL23. Der direkte Einfluss von Glukose-Metaboliten im Zebrafisch als metabolische Befürworter der Vaskulopathie wurde auch bereits gezeigt. Weitere vaskuläre Hyperbranching wurde in das Gefäßsystem Stamm von Zebrafisch-Embryonen nach Inkubation mit Methylglyoxal24beobachtet. Im Moment gibt es kein Tiermodell bietet die wichtigsten Kriterien der diabetischen Retinopathie. Frühe Veränderungen finden sich oft, aber das Fortschreiten, proliferative diabetische Retinopathie fehlt25. Der Zebrabärbling fällt ebenfalls in diese Definition, wie wir nur Hypoxie-vermittelten Neoangiogenese oder Hyperglykämie-induzierte Veränderungen bis jetzt gesehen haben. Die aktuellen Erkenntnisse unterstützen die Idee, dass der Zebrabärbling anfällig für Hyperglykämie-vermittelten Gefäßveränderungen ist und als Tiermodell kann potenziell eine Progression, proliferative diabetische Retinopathie zeigen. Abhängig von der Stärke und Exposition gegenüber der Hyperglykämie-vermittelten Effekt Recht experimentelle Modell zu Ischämie in bestimmten Bereichen der Zebrafisch Netzhaut führen und Neoangiogenese als die wichtigsten Kriterien der proliferativen diabetischen Retinopathie fördern. Jedoch wie der Zebrabärbling ein vergleichsweise neuer Spieler auf dem Gebiet ist der Modellierung langfristiger mikrovaskulärer Pathologien, bevorstehenden Diabetes Modelle im Zebrafisch erhalten Sie weitere Informationen und ihre Bedeutung in Bezug auf andere Modelle und deren Pathologien zu klären. Beispielsweise könnte ein Kreuz tg(gata1a:DsRed) Zebrafisch mit rot-markierten Erythrozyten in die tg(fli:EGFP) Linie verwendet werden, um gleichzeitig potenzielle intraokulare Blutungen in Zukunft Zebrafisch-Modelle zeigen Mikroaneurysmen als Prädiktor für visualisieren Progression zu PDR.
Da die Netzhaut Gefäßsystem zu einer Folge von Arkaden fortschreitet, Bewertung der intervascular Abstand, Anzahl der Verzweigungspunkten und vaskuläre Gesamtfläche beziehen sich auf die Entfernung von der zentralen optischen Arterie. Um Verzerrungen in den untersuchten vaskulären Parametern zu vermeiden, ist ein Punkt der Orientierung erforderlich. Das IOC ist eine solche Struktur und ist von großer Bedeutung, da vaskulären Tätigkeitsbereiche in unmittelbarer räumlicher Nähe liegen. Für die einheitliche Bewertung sollte mehrere rechteckige Bildausschnitte mit einem einheitlichen Abstand gegenüber dem IOC der Netzhaut Scan aufgeteilt werden. Die gesamte Netzhaut sollte analysiert werden und Bilder numerisch symmetrisch verteilt. Die Zebrafisch Netzhaut zeigt Bereiche mit hohen und niedrigen Kapillardichte und eine ungleiche Verteilung von Bildausschnitten für zusätzliche Verzerrungen führen kann.
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
Abbildung 12: Beispiel-Präsentation der vaskulären Parameter als Auslesen der Netzhaut Gefäßsystem Visualisierung. Intervascular Abstandsmessung (roter Doppelpfeil) in der Nähe der inneren Optik Kreise (IOC) (A). Drei Verzweigungspunkten (rote Kreise) in der Nähe des IOC (B). Visualisierung der Zebrafisch retinalen Gefäßsystem mit einer erweiterten Fläche (rot markiert) zeigt eine sprießende Schiff (C). Schiffs Durchmesser gemessen über eine gewisse Distanz (weiße Doppelpfeil) von der central Artery (weißes Kreuz) (D). Schiff-Dichte ist der Prozentsatz der Netzhaut Fläche durch die Überlagerung von Schiffen (diagonale rote Linien) (E). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um die intervascular Entfernung zu messen, muss man eine gewisse Distanz gegenüber dem IOC als Standard (Abbildung 12A, weiße Doppelpfeil) und Zeichnen einer gedachten horizontalen Linie (Abb. 12A, horizontale weiße Linie) parallel zu den IOC. Der Abstand zwischen den Schiffen in dieser Zeile addiert und arithmetisch gemittelt entspricht der intervascular Entfernung. Verzweigungspunkten zählen innerhalb jedes Bild, wann immer ein Schiff teilt und mehr als eine vaskuläre Lumen weiter unter dem Gesichtspunkt der Herkunft. Hierzu gehören auch horizontale Verbindungen zwischen Kapillaren. Es ist wichtig, bleiben Sie konsequent mit Analyse und entscheiden, welche Verzweigungspunkten zu zählen und halten diese Regeln in das ganze Experiment, nicht mehr benötigte Variante zu reduzieren. Vaskuläre sprießen, ist wie in Abbildung 12gezeigt ein weiterer Parameter, der in jedem Bild, Einfluss auf die Netzhaut Gefäßsystem zu bewerten gezählt werden kann. Angiogenen Sprossen folgen nicht die arkadenartige Nachfolge zwischen zentralen Arterie und IOC und Fokus in der Nähe der äußeren Teile der Netzhaut. Um bestimmte Schiffs Durchmesser zu beurteilen, Orientierungspunkt ist immer erforderlich, aus denen eine festgelegte Strecke markiert die Messung vor Ort. Die zentrale Arterie Herkunft innerhalb der Netzhaut enthält solche Anleitungen für den Hauptstamm Schiffe (Abbildung 12D, weißes Kreuz). Die Fläche von Schiffen (Abbildung 12E, diagonale rote Linien), als Prozentsatz der gesamten Netzhaut Gegend ist die vaskuläre Dichte und indirekt zum Bereich avaskulären korreliert.
Ein kompletter konfokale Scan einer Probe sollte mehrere detailreiche Bilder zur Visualisierung der kleinen Kapillaren Hypersprouting zulassen zusammensetzen. Zur Optimierung von Zeit und Ressourcen aufgewendet dieser Schritt sollte ein automatisches Körper Verfahren für jede Fliese mit einer allgemeinen Scan-Tiefe verwendet werden. Ungleichmäßige Montage der Netzhaut beträchtlich die Zeit damit verbracht, um das Gefäßsystem mit einem konfokalen Mikroskop zu scannen. In ein optimaler Ansatz möchte man nur die vaskuläre Schicht (Abbildung 13 b, white-Box), aber teilweiser Einbeziehung der GCL scan ist oft notwendig.Verlassen einer Überlänge des Sehnervs nach abschneiden, als auch die Kürzungen, die flach-Mount als zu kurz, zu erreichen führen zu ungleichen Montage.
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
Abbildung 13: Vergleich der er Färbung und Autofluoreszenz in der Netzhaut Erwachsenen Zebrafisch. Netzhaut Gefäßsystem im Fokus über die GCL (A). Netzhaut Gefäßsystem (weißes Feld) zeigt grün ein EGFP Signal und Netzhaut Schichten ausstellenden starke Autofluoreszenz (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wie die richtige Vorbereitung des Zebrafisch retinalen Gefäßsystems Vorbildung benötigt, eine kleinen Stichprobe mit ungeschulten Dissectors und stark variierende Vorbereitung Ergebnisse sind eine wesentliche Einschränkung der Technik. Während die Vorbereitung des tg(fli:EGFP) Zebrafisch Augen schnell Einblick in den Stand des Gefäßsystems gibt, nutzt die Technik immer noch rund 20 Minuten Arbeitszeit pro Retina für ein erfahrener Forscher. All diese Vorbereitungsschritte für die Netzhaut Gefäßsystem unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt werden müssen und Dissectors müssen bleiben konzentriert die ganze Zeit wie ein unvorsichtiger Schritt möglicherweise Schiff Bruch hervorrufen kann. Der Sezierer sollte regelmäßig üben, wie längerer Abwesenheit von der Vorbereitung einer Sezierer Verwechslungsgefahr Schiff Integrität reduziert.
Darüber hinaus ist zusätzliche Auslesen über immunhistochemische (IHC) noch begrenzt, da nur wenige Antikörper validiert auf menschliche und Nagetier Gewebe mit Zebrafisch arbeiten. Experimentatoren interessiert IHC geraten, suchen Zebrafisch-spezifische Antikörper, vor allem bei der Arbeit mit neuen Zielen. Alternativ empfiehlt es sich, zusätzliche Zebrafisch Reporter Linien verwenden die Zellen über das Gefäßsystem in das Auge zu studieren nützlich sind. Diese Strategie ist allerdings zeitaufwendig, da es ein paar Monate dauert zu Erwachsenen Zebrafisch Linien zu erzeugen, die mehrere transgene Reporter tragen.
Der Zebrafisch stellt dennoch eine einzigartige Palette von Vorteilen. Sie sind relativ klein und leicht zu reproduzieren. Sie können zu adulten Stadien schnell wachsen und ihre Embryonen sind optimal für Drogen-Screening. Das Feld wächst leicht und weitere Literatur ist immer zugänglich. Mit der Fähigkeit, gen Knockouts mit einer schnellen Geschwindigkeit und eine Fülle von Transgen Fluoreszenz Reporter Linien zu erzeugen ist die Wahl für Zebrafisch nur durch die gewählte Forschungsfrage zurückhaltend.

Diabetes Mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie infolge gestörten Insulinsekretion oder unzureichende Gewebe Reaktion auf sekretierten Insulin definiert. Die WHO schätzt, dass 422 Millionen Erwachsene mit Diabetes Mellitus in 20141 lebten und die Prävalenz von Diabetes weltweit um ca. 8-10 % der Bevölkerung bis zum Jahr 20352 voraussichtlich, Diabetes und ist einer der wichtigsten Forschungsgebiete in der nächsten Jahrzehnten. Leben mit chronischen hohen Blutzucker führt zu langfristigen mikrovaskulärer Komplikationen, einschließlich diabetischer Retinopathie, Nephropathie und Polyneuropathie. Das Management und die Vorbeugung dieser Komplikationen sind schwer; in der Tat, Diabetes ist die häufigste Ursache von terminaler Niereninsuffizienz (ESRD), die zur Dialyse2führt, immer und Diabetes ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen mittleren Alters3.
Die ersten Ursachen für mikrovaskuläre Schäden im diabetischen Auge sind chronische Hyperglykämie sowie Stoffwechselveränderungen und bestimmte Risikofaktoren (z.B.Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörungen), führt zu vaskulären endothelialen Dysfunktion, Pericyte Dropout, und Kapillare Regression, die azellulären vaskulären Ärmel führt. Die daraus resultierende retinale Ischämie ist die Ursache der Neovaskularisation und erhöhten vaskulären Permeabilität, die Förderung der Entwicklung der proliferative diabetische Retinopathie (PDR)4. Diabetischer Retinopathie war in der Regel bei 37 % der Diabetes-Patienten entdeckt, während Anblick-bedrohlichen diabetischer Retinopathie bei 12 % der abgeschirmten weißen europäischen Kohorte in der UKADS Studie5festgestellt wurde. Die Behandlung kann nur verhindern, dass weitere Komplikationen und ist nicht in der Lage, die bereits verursachte Schäden vollständig wiederherstellen. Panretinale Photokoagulation, neben der glykämischen Kontrolle, ist die Standardtherapie für proliferative diabetische Retinopathie (PDR) wirkt sich auf das benachbarte gesunde Gewebe sowie Anti-VEGF Interventionen zeigen vielversprechende Ergebnisse als Alternative zu Laser Behandlung6,7, aber letztlich, spezielle, zielgerichtete Therapie und neue Medikamente sind erforderlich, um die wachsende Zahl von Patienten mit einem Risiko von Verlust der Sehkraft zu verwalten.
Die etablierten Tierforschung Modelle der diabetischen Retinopathie teilen nicht jeden Aspekt der menschlichen Pathophysiologie. Korrekte Verwendung an die spezifischen Anforderungen der wissenschaftlichen Fragestellung ist eines der wesentlichsten Teile des experimentellen Aufbaus. Der Zebrafischembryo (Danio Rerio) ist bereits weit verbreitet in Entwicklungsforschung und bietet einen optimale praktische Hintergrund zu Niederschlag oder Knockout spezifischer Gene über Morpholinos oder der CRISPR/Cas9-Technik-8. Diese Methoden können problemlos genutzt werden, im Zebrafisch, Gene, die durch groß angelegte genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Erzeugung von Einblicke in bestimmte Mechanismen der Progression der Erkrankung und Anfälligkeit9identifiziert wurden, zu untersuchen. Generationsübergreifende kurz, große Mengen an Nachkommen, einfach und kostengünstige Handhabung und wachsende Assay Unterstützung haben die Relevanz des Modells Zebrafisch, zumal ihr große Potenzial für die Modellierung von Stoffwechselerkrankung erhöht. Erhaltung der biologischen Mechanismen im Zebrafisch wurde als Grundlage für die pharmakologische Therapie Entwicklung gezeigt. Beispielsweise haben die antidiabetischen Medikament Metformin und Cholesterin-senkende Simvastatin nachweislich "Krankheiten" in den Modellen der cAMP/Dexamethason-induzierten hohen PEPCK Ausdruck und cholesterinreiche Diät-induzierten Hypercholesterinämie10 , 11 , 12. diese fortschreitende Einsicht in übergreifende konservierte metabolische Mechanismen wird weiter unterstützt durch die wachsende Zahl von Zebrafisch-Diabetes-Modelle durch Experimente wie z. B.: abwechselnd Inkubation in Glukose-Lösungen, Streptozotocin-induzierte Ablation von Beta-Zellen, Nitroreductase-vermittelten Beta-Zellen Ablation mit Prodrug Metronidazol, Monogene Diabetes vermittelt über pdx1 gen-Knockdown oder Ko, sowie Modelle der erhöhte Insulin-Resistenz in der Skelettmuskulatur 12. bereits etabliert diese Protokolle, die oben genannten Besonderheiten der Gattung, und die Fähigkeit, effizient zu manipulieren, das Genom in einer großen Anzahl von Proben alle zeigen die Vorteile der Zebrafisch für die Untersuchung der Mechanismen fahren komplexe Erkrankung Prozesse sowie die Fähigkeit zum Bildschirm für pharmakologische Interventionen.
Ein allgemeines Verständnis der grundlegenden Zebrafisch Auge Anatomie (Abbildung 1) ist notwendig für die Sezierer, um Zebrafisch als Modell für die Netzhaut Angiopathie nutzen. Der Zebrafisch-Auge hat sechs extraokularen Muskeln, vier Rectus und zwei schrägen Muskeln, die einfügen auf der Außenseite der Kugel auf der Sklera13. Die Hornhaut ist das transparente Gewebe für das Objektiv und geht direkt in die Lederhaut, bildet die äußere Hülle des Auges. Die Lederhaut ist undurchsichtig, hat eine teilweise Licht reflektierende Oberfläche und ist stark pigmentiert. Das Objektiv selbst ist mehr als das menschliche Gegenstück kugelförmige. Die Netzhaut besteht aus drei nukleare Schichten von neuronalen Zellen während der Sauerstoff anbietende retinale Gefäßsystem eng verbunden mit der inneren Ganglion Zellschicht ist aber keinen subretinalen Netzwerk bildet. Aderhautgefäße, im Gegensatz dazu liegen zwischen Lederhaut und Netzhaut und die Netzhaut pigmentiert Pigmentepithels (RPE) zugeordnet sind. Diese Kapillarnetzes liefert Sauerstoff auf die äußeren Teile der Netzhaut14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Auges Erwachsenen Zebrafisch. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Einfache Visualisierung der retinalen Gefäße kann durch Nutzung der transgenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Linie15erreicht werden. Das grüne fluoreszierende Protein unter Kontrolle der Fli-Promotor in Endothelzellen des Gefäßsystems ausgedrückt ist die Grundlage für die Visualisierung über einen Laser-scanning-Mikroskop in den späteren Schritten. Dies wird durch Dissektion der Zebrafisch Netzhaut und ganz-Montage des Gewebes erreicht. Diese transgenen Modell bietet eine schnelle vaskuläre Auslesen ohne jede Anwendung des intravaskulären Kennzeichnung oder ganze-Mount Immunohistochemistry. Diabetischen Retinopathie im Zebrafisch zu analysieren, sollte eine Schritt für Schritt und standardisierte Vorbereitung Routine durch jeden Sezierer verwendet werden.Das folgende Protokoll der Vorbereitung bietet anderer Forschungsgruppen die Möglichkeit, ganz einfach bewerten Gefäßveränderungen in den freiliegenden Gefäßen des Auges Erwachsenen Zebrafisch und Hilfestellung um eine optimierte Dissektion-Routine für die Netzhaut Zebrafisch zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Dihydrogenphosphat</td><td>Roth</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat Salz (MS-222,Tricain)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo-Fischer</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Greiner Bio one</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well-Platte</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Nadel</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>Mikropinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger</td><td>Carl</td><td>Roth H872.1</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr><tr><td>Scalpel</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>Epi-Illumination</td><td>Leica</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskop MZ10 F</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop SP5 DS</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop M80</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch-Linie: Tg(fli:EGFP), ABTL Wildtyp</td><td>NA</td><td>NA</td><td>siehe Referenz 15</td></tr><tr><td>Mayer' s Hämatoxylin</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Eosin</td><td>Dr. K. Hollborn & S&ouml; hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% Ethanol</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Merck</td><td>1.071.501.000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom RM 2165</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

diabetes durch die augen eines fisches zu studieren: mikrodissektion, visualisierung und analyse von den erwachsenen tg(fli:egfp) zebrafisch retinal gefäßsystem

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Die diabetische Retinopathie ist die häufigste Ursache für Erblindung bei Erwachsenen mittleren Alters. Die steigende Prävalenz des Diabetes weltweit machen die Verhinderung von diabetischen mikrovaskulärer Komplikationen eines der wichtigsten Forschungsfelder der nächsten Jahrzehnte. Spezielle, zielgerichtete Therapie und neuartige Medikamente werden benötigt, um die zunehmende Zahl von Patienten mit einem Risiko von Verlust der Sehkraft zu verwalten. Der Zebrabärbling ist ein etabliertes Tiermodell für Entwicklungsforschung Fragen mit zunehmender Bedeutung für die Modellierung von Prozessen der metabolischen multifaktorielle Erkrankung. Die Vorteile der Gattung ermöglichen optimale Visualisierung und Hochdurchsatz-Drogen-screening-Ansätze, kombiniert mit der starken Fähigkeit, knock out Gene von Interesse. Hier beschreiben wir ein Protokoll ermöglicht einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in den Einstellungen der langfristigen vaskuläre Erkrankungen Neoangiogenese oder Schiff Schäden verbunden. Dies wird durch Dissektion der Zebrafisch Netzhaut und ganz-Montage des Gewebes erreicht. Visualisierung der exponierten Schiffe wird dann durch konfokale Mikroskopie des grünen EGFP Reporters in den Erwachsenen retinalen Gefäßsystem ausgedrückt erreicht. Korrekte Handhabung des Gewebes führt zu besseren Ergebnissen und weniger interne Schiff Bruch um die Visualisierung der unveränderten vaskuläre Struktur zu gewährleisten. Die Methode kann im Zebrafisch-Modelle der Netzhaut Vaskulopathie verbunden mit Veränderungen in der Schiff-Architektur sowie die Neoangiogenese genutzt werden.

Hier zeigen wir zwei typische morphologische Beispiele für die Netzhaut Gefäßsystem im Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch: einmal visualisiert mit dem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 9A) und einmal mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (Abbildung 9). Die aufgedeckte retinale Struktur zeigt ein Muster sehr organisiert. Starke Autofluoreszenz ist in der Netzhaut Zebrafisch gesehen, wenn mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. So empfiehlt sich eine Visualisierung der nur vaskuläre Schicht über einem konfokalen Scan zu reduzieren Hintergrundfluoreszenz und Kontrast erhöhen. Für schnellere Bild Erwerb oder Situationen wo qualitative Daten ausreichen, ist das Fluoreszenzmikroskop eine attraktive Alternative.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
Abbildung 9: repräsentative Bilder von Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem. Zwei typische morphologische der retinalen Gefäße sind Beispiele für: die zentrale optische Arterie breitet sich in 5-7 wichtigsten Schiffe, die dann in eine Abfolge von Arkaden verzweigen. Alle weiteren Schiffe entwässern in die umlaufende Vene (CV) Begrenzung den äußeren Teil jedes Blütenblatt. Visualisierung über Fluoreszenz-Mikroskopie bei 2,5 x Vergrößerung (A). Visualisierung der retinalen Gefäße durch konfokale Laser-scanning-Mikroskopie durch einen kombinierten 5 x 5 Einzelbild Fliese Scan (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die optische Arterie dringt die Netzhaut am Sehnerv Kopf und breitet sich in den meisten Proben in 5-7 wichtigsten Gefäße (Abb. 10A). Die wichtigsten Schiffe dann verzweigen in eine Abfolge von Arkaden und verbinden Sie mit optischen Innenkreis (IOC), auch genannt die umlaufende Vene (CV), rings um die Papille in der Peripherie der flach montierten Retina (siehe Abbildung 10). Das IOC ist das venöse Gefäß, das das arterielle Blut am inneren Rand des okulären Globus (Bulbus Oculi) entwässert. Der Zebrafisch retinalen Gefäßsystem zeigt auch hohe vaskuläre Tätigkeitsbereichen mit Verzweigung der Kapillaren und angiogenen sprießen (Abbildung 10). Dieser Kreislauf Aktivität befindet sich meist in Nähe des IOC. Es ist wichtig zu bemerken, dass das gleiche Auge sowohl Ebbe und vaskulären Aktivitäten in den verschiedenen Regionen der Netzhaut nachweisen kann (Vergleiche Abbildung 10 und Abbildung 10). Im Allgemeinen zeigt das retinale Gefäßsystem der Zebrafisch avaskulären geräumiger und weniger Kapillaren zwischen die Hauptäste im Vergleich zu beispielsweise die Netzhaut des Mäuse-17. Beide Augen jeder Probe sollte analysiert werden, weil das Gefäßsystem zwischen variieren und singulären Inspektion kann zu Verzerrungen führen.
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
Abbildung 10: Bereiche der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem Visualisierung vergrößert. Die optische Arterie Verzweigung in die wichtigsten Schiffe (A). Retinalen Kapillaren in einem Gebiet mit geringer vaskuläre Aktivität verbinden mit optischen Innenkreis (IOC) am unteren Rand der Abbildung (B). Retinalen Kapillaren auf einer Fläche von vaskulären hochaktiver Anschluss an das IOC (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Eine hoch konserviert Architektur neuronale Schichten ist bereits im Zebrafisch von ca. 72 h post Düngung (hpf) ab18. Die Erwachsenen Zebrafisch Netzhaut zeigt die folgenden Schichten von innen nach außen (Abb. 11): Ganglion Zellschicht (GCL), inneren plexiformen Schicht (IPL), nukleare Innenschicht (INL), äußeren plexiformen Schicht (OPL), nukleare Außenschicht (ONL) Photorezeptor Schicht (PL), und des retinalen Pigmentepithels (RPE) pigmentiert. Die Schätzung der vaskulären Parameter von retinalen Gefäßsystem Visualisierung ist in Abbildung 12dargestellt. Das innere Netzhaut Gefäßsystem befindet sich auf der Ganglion Zellschicht (GCL) (Abbildung 13 b, white-Box) und die Aderhaut Kapillaren würde die Netzhaut pigmentiert Pigmentepithels (RPE) zugeordnet werden.
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
Abbildung 11: er Färbung des Auges Erwachsenen Zebrafisch. Cross-sectional Überblick über das ganze Auge nach Entfernung der Linse (A). Netzhaut Schichten von den Erwachsenen Zebrafisch Auge19 (B). Hinweis (schwarzer Pfeil) auf die natürliche Bruchstelle in der PL (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier diskutieren wir eine Methode-Protokoll ermöglicht eine einfache Analyse der Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch retinalen Gefäßsystem als eine schnelle Auslesung in Einstellungen des langfristigen vaskuläre Krankheiten Neoangiogenese und strukturelle Veränderungen verbunden.

Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Dissektionsprotokolls für das retinale Gefäßsystem des adulten Zebrafisches ist es, eine schnelle Auslesung von langfristigen vaskulären Pathologien im Zusammenhang mit Neoangiogenese und strukturellen Veränderungen mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Laserscanning-Mikroskopie zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich mikrovaskulärer Komplikationen wie der Entstehung einer diabetischen Retinopathie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gesamte Retinovaszulatur in physiologischen und Krankheitsprozessen ohne Anwendung von intervaskulärer Fluoreszenz relativ schnell und standardisiert dargestellt und analysiert werden kann.Zu Beginn werden sechs Milliliter frisch zubereitete vierprozentige PFA-PBS-Lösung pro Probe in die Vertiefungen mit sechs Well-Platten überführt. Nachdem Sie erwachsene Zebrafische gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, legen Sie sie auf frische Papiertücher und trocknen Sie sie. Schneide mit einem Skalpell die Köpfe hinter dem Operculum ab.Übertragen Sie dann die Köpfe direkt in die Vertiefungen mit frisch zubereitetem Fixiermittel. Lagern Sie die Platten mit den Fischköpfen mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in die tieferen Netzhautschichten eindringt. Mit erhitzter zweiprozentiger Agarose füllen Sie eine Petrischale bis zu einem Drittel und warten, bis der Agar fest ist.Decken Sie die Agarplatte mit einem X PBS ab, um einen Arbeitsbereich zum Sezieren der Augen zu schaffen. Übertragen Sie die fixierte Probe in die Petrischale. Und indem Sie den Kopf mit einer Pinzette an die Schnittfläche halten, führen Sie eine weitere, zusammengesteckte Pinzette unter dem Augapfel an der Augenhöhle ein.Öffnen Sie langsam die Pinzette unterhalb des Auges und greifen Sie nach dem Sehnerv. Reißen Sie dann vorsichtig das Auge ab und lösen Sie es. Um einen der vier geraden und zwei schrägen extraokularen Muskeln, die mit dem Auge verbunden sind, sowie restliches extraokuläres Gewebe, das das Auge mit der Augenhöhle verbindet, zu entfernen, halten Sie das Auge durch eine halb geschlossene Pinzette zurück und greifen Sie die Struktur mit der anderen Pinzette mit einer diametralen Bewegung, um sie sanft abzureißen.Verwenden Sie anschließend eine 27-Gauge-Einwegnadel, um die Hornhaut im äußeren Bereich zu punktieren. Durch diese Öffnung halten Sie mit beiden Pinzetten die Hornhaut fest und reißen sie leicht auf. Arbeite dann vorsichtig so vor, dass ein zentrierter Riss etwa so groß wie die jeweilige Pupille entsteht.Üben Sie Druck auf die Hornhautseite des Augenballs am äußeren Hornhautrand oberhalb der Iris aus. Dadurch entsteht eine kleine Delle und die Linse wird auf die Höhe des Hornhautrisses gedrückt. Führen Sie dann die Pinzette unter die Linse und entfernen Sie sie.Drehen Sie dann das Auge auf den Kopf, wobei der Sehnerv nach oben zeigt. Beachten Sie, dass die Sklera und die Hornhaut miteinander verbunden sind und die faserige Tunika der Augenzwiebel bilden, um die becherförmige Netzhaut zu schützen. Diese Schale, die als Corneosclera bezeichnet wird, verschont den Bereich um den Sehnerv.Führen Sie bei diesem Absetzen eine Nadel ein, um eine Öffnung zwischen Sklera und Netzhaut zu schaffen. Reißen Sie dann mit beiden Pinzetten die Sklera vorsichtig axial in Streifen, um die Öffnung um den Sehnerv herum zu vergrößern. Achten Sie darauf, dass die Hornhaut am Übergang zum Hornhautseitenumfang intakt bleibt.Bevor Sie die Korneosklera aus dem verbleibenden intraokularen Gewebe entfernen, versuchen Sie, alle Verbindungen zu verstärken, da die Befestigung an anderen Strukturen ein kritischer Punkt ist. Halten Sie dann die Sklera mit einer Pinzette fest und indem Sie mit der anderen den Sehnerv greifen und wegziehen, entfernen Sie die Corneosclera vollständig aus dem Auge und entsorgen Sie sie. In diesem Schritt entsteht eine becherförmige Struktur, die aus der Uvea und der Netzhaut besteht und das retinale Gefäßsystem enthält.Als nächstes erzeugen Sie einen Riss in der Aderhaut- und RPE-Schicht, indem Sie eine 27-Gauge-Nadel seitlich an den verbleibenden Becher halten, während Sie die Außenfläche mit dem Rand der Nadelspitze abkratzen. Verwenden Sie den Riss als Zugangspunkt, um die Aderhaut- und RPE-Schicht zu greifen, und reißen Sie ihn mit beiden Pinzetten in Streifen, wobei die Verbindung zur Iris intakt bleibt. Führen Sie anschließend eine Pinzette unter die Iris und bewegen Sie sie in einem Zirkel von außen, während Sie durch Ziehen an der eingestellten Aderhaut- und RPE-Schicht Spannung erzeugen und die kombinierte Struktur lösen.Wenn Teile der Iris nicht entfernt werden können und nach der Entfernung der Aderhaut- und RPE-Schicht mit der becherförmigen Netzhaut verbunden bleiben, nutzen Sie eine weitere natürliche Bruchstelle, die das erwachsene Zebrafischauge innerhalb der Photorezeptorschicht aufweist. In ähnlicher Weise wird gerade demonstriert, um die Iris zu entfernen. Kratzen Sie über die verbleibende becherförmige Netzhaut, um Unterbrechungen in der Photorezeptorschicht zu induzieren.Verwenden Sie dann den erstellten Zugang, um die Ebene zu entfernen, während die mögliche Verbindung zur Iris intakt bleibt. Führen Sie anschließend die Pinzette unter die Iris und fahren Sie in einem Zirkel fort, wie zuvor in diesem Video gezeigt, um die kombinierte Struktur zu lösen. Es ist wichtig, die Iris auf sinnvolle Weise vom darunterliegenden Gewebe zu trennen, da sie die Fluoreszenz direkt über dem inneren optischen Kreis während der Visualisierung der Gefäße blockiert.Eine zu direkte Annäherung kann zum Gefäßbruch führen. Verwenden Sie dann eine Mikrodissektions-Federschere mit einer geraden Schneide von zwei Komma fünf Millimetern, um den Sehnerv so nah wie möglich an der Netzhaut zu durchtrennen. Dies ermöglicht eine bessere flache Befestigung des Gewebes.Um das retinale Gefäßsystem zu befestigen und sichtbar zu machen, verwenden Sie ein X PBS, um die präparierte Netzhaut zweimal für jeweils fünf Minuten zu waschen. Geben Sie einen Tropfen PBS auf einen Objektträger. Übertragen Sie dann mit einem Laborspatel mit einem Mikrolöffelende die Netzhaut in das Tröpfchen.Halten Sie das Gewebe mit einer Pinzette an Ort und Stelle, während Sie mit einem Skalpell die becherförmige Struktur so schneiden, dass je nach Netzhautgröße eine flache Form von vier oder fünf Blütenblättern entsteht. Saugen Sie mit einem feinen Blatt Papier das übrig gebliebene PBS auf und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren. Bestreichen Sie dann die flach montierte Netzhaut mit Eindeckmedium und decken Sie sie mit dem Deckglas ab.Achten Sie darauf, keinen Schaum zu bilden, da Luftblasen die Sichtbarkeit der Netzhautgefäße verzerren können. Verwenden Sie Nagellack, um die Abdeckung zu versiegeln. Führen Sie abschließend eine Fluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskopie durch, um das retinale Gefäßsystem sichtbar zu machen.Hier ist ein morphologisches Beispiel des retinalen Gefäßsystems bei adulten transgenen Fliegen-EGFP-Zebrafischen zu sehen, das mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert wurde, und ein zweites Beispiel, das mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurde, das die Hintergrundfluoreszenz reduziert. Die sichtbare Netzhautstruktur zeigt ein hochorganisiertes Muster. Die Arteria opticus durchdringt die Netzhaut am Kopf des Sehnervs und breitet sich in den meisten Proben in fünf bis sieben Hauptgefäße aus.Die Hauptgefäße verzweigen sich dann in eine Abfolge von Arkaden und verbinden sich mit dem inneren Sehkreis oder IOC, auch Umfangsvene genannt, der die Sehscheibe in der Peripherie der flach sitzenden Netzhaut umgibt. Die Netzhaut eines erwachsenen Zebrafisches setzt sich von innen nach außen aus den folgenden Schichten zusammen. Die Ganglienzellschicht, die innere plexiforme Schicht, die innere Kernschicht, die äußere plexiforme Schicht, die äußere Kernschicht, die Photorezeptorschicht und das retinale pigmentierte Epithel.Die Schätzung von Gefäßparametern aus der retinalen Gefäßvisualisierung wird hier gezeigt. Das innere retinale Gefäßsystem befindet sich auf der Ganglienzellschicht, während die Herzkapillaren mit dem retinalen pigmentierten Epithel assoziiert sind. Einmal trainiert, kann diese Technik in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, regelmäßig zu üben, da eine längere Abwesenheit von der Vorbereitung das Ergebnis der Gefäßintegrität verringert. Nach diesem Verfahren können Diabetes und neurovaskuläre Pathologien bei erwachsenen Zebrafischen analysiert werden.

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Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

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