Diabetes durch die Augen eines Fisches zu studieren: Mikrodissektion, Visualisierung und Analyse von den Erwachsenen tg(fli:EGFP) Zebrafisch Retinal Gefäßsystem

Das übergeordnete Ziel dieses Dissektionsprotokolls für das retinale Gefäßsystem des adulten Zebrafisches ist es, eine schnelle Auslesung von langfristigen vaskulären Pathologien im Zusammenhang mit Neoangiogenese und strukturellen Veränderungen mittels Fluoreszenz- oder konfokaler Laserscanning-Mikroskopie zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich mikrovaskulärer Komplikationen wie der Entstehung einer diabetischen Retinopathie zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gesamte Retinovaszulatur in physiologischen und Krankheitsprozessen ohne Anwendung von intervaskulärer Fluoreszenz relativ schnell und standardisiert dargestellt und analysiert werden kann.

Zu Beginn werden sechs Milliliter frisch zubereitete vierprozentige PFA-PBS-Lösung pro Probe in die Vertiefungen mit sechs Well-Platten überführt. Nachdem Sie erwachsene Zebrafische gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert haben, legen Sie sie auf frische Papiertücher und trocknen Sie sie. Schneide mit einem Skalpell die Köpfe hinter dem Operculum ab.

Übertragen Sie dann die Köpfe direkt in die Vertiefungen mit frisch zubereitetem Fixiermittel. Lagern Sie die Platten mit den Fischköpfen mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das Fixiermittel in die tieferen Netzhautschichten eindringt. Mit erhitzter zweiprozentiger Agarose füllen Sie eine Petrischale bis zu einem Drittel und warten, bis der Agar fest ist.

Decken Sie die Agarplatte mit einem X PBS ab, um einen Arbeitsbereich zum Sezieren der Augen zu schaffen. Übertragen Sie die fixierte Probe in die Petrischale. Und indem Sie den Kopf mit einer Pinzette an die Schnittfläche halten, führen Sie eine weitere, zusammengesteckte Pinzette unter dem Augapfel an der Augenhöhle ein.

Öffnen Sie langsam die Pinzette unterhalb des Auges und greifen Sie nach dem Sehnerv. Reißen Sie dann vorsichtig das Auge ab und lösen Sie es. Um einen der vier geraden und zwei schrägen extraokularen Muskeln, die mit dem Auge verbunden sind, sowie restliches extraokuläres Gewebe, das das Auge mit der Augenhöhle verbindet, zu entfernen, halten Sie das Auge durch eine halb geschlossene Pinzette zurück und greifen Sie die Struktur mit der anderen Pinzette mit einer diametralen Bewegung, um sie sanft abzureißen.

Verwenden Sie anschließend eine 27-Gauge-Einwegnadel, um die Hornhaut im äußeren Bereich zu punktieren. Durch diese Öffnung halten Sie mit beiden Pinzetten die Hornhaut fest und reißen sie leicht auf. Arbeite dann vorsichtig so vor, dass ein zentrierter Riss etwa so groß wie die jeweilige Pupille entsteht.

Üben Sie Druck auf die Hornhautseite des Augenballs am äußeren Hornhautrand oberhalb der Iris aus. Dadurch entsteht eine kleine Delle und die Linse wird auf die Höhe des Hornhautrisses gedrückt. Führen Sie dann die Pinzette unter die Linse und entfernen Sie sie.

Drehen Sie dann das Auge auf den Kopf, wobei der Sehnerv nach oben zeigt. Beachten Sie, dass die Sklera und die Hornhaut miteinander verbunden sind und die faserige Tunika der Augenzwiebel bilden, um die becherförmige Netzhaut zu schützen. Diese Schale, die als Corneosclera bezeichnet wird, verschont den Bereich um den Sehnerv.

Führen Sie bei diesem Absetzen eine Nadel ein, um eine Öffnung zwischen Sklera und Netzhaut zu schaffen. Reißen Sie dann mit beiden Pinzetten die Sklera vorsichtig axial in Streifen, um die Öffnung um den Sehnerv herum zu vergrößern. Achten Sie darauf, dass die Hornhaut am Übergang zum Hornhautseitenumfang intakt bleibt.

Bevor Sie die Korneosklera aus dem verbleibenden intraokularen Gewebe entfernen, versuchen Sie, alle Verbindungen zu verstärken, da die Befestigung an anderen Strukturen ein kritischer Punkt ist. Halten Sie dann die Sklera mit einer Pinzette fest und indem Sie mit der anderen den Sehnerv greifen und wegziehen, entfernen Sie die Corneosclera vollständig aus dem Auge und entsorgen Sie sie. In diesem Schritt entsteht eine becherförmige Struktur, die aus der Uvea und der Netzhaut besteht und das retinale Gefäßsystem enthält.

Als nächstes erzeugen Sie einen Riss in der Aderhaut- und RPE-Schicht, indem Sie eine 27-Gauge-Nadel seitlich an den verbleibenden Becher halten, während Sie die Außenfläche mit dem Rand der Nadelspitze abkratzen. Verwenden Sie den Riss als Zugangspunkt, um die Aderhaut- und RPE-Schicht zu greifen, und reißen Sie ihn mit beiden Pinzetten in Streifen, wobei die Verbindung zur Iris intakt bleibt. Führen Sie anschließend eine Pinzette unter die Iris und bewegen Sie sie in einem Zirkel von außen, während Sie durch Ziehen an der eingestellten Aderhaut- und RPE-Schicht Spannung erzeugen und die kombinierte Struktur lösen.

Wenn Teile der Iris nicht entfernt werden können und nach der Entfernung der Aderhaut- und RPE-Schicht mit der becherförmigen Netzhaut verbunden bleiben, nutzen Sie eine weitere natürliche Bruchstelle, die das erwachsene Zebrafischauge innerhalb der Photorezeptorschicht aufweist. In ähnlicher Weise wird gerade demonstriert, um die Iris zu entfernen. Kratzen Sie über die verbleibende becherförmige Netzhaut, um Unterbrechungen in der Photorezeptorschicht zu induzieren.

Verwenden Sie dann den erstellten Zugang, um die Ebene zu entfernen, während die mögliche Verbindung zur Iris intakt bleibt. Führen Sie anschließend die Pinzette unter die Iris und fahren Sie in einem Zirkel fort, wie zuvor in diesem Video gezeigt, um die kombinierte Struktur zu lösen. Es ist wichtig, die Iris auf sinnvolle Weise vom darunterliegenden Gewebe zu trennen, da sie die Fluoreszenz direkt über dem inneren optischen Kreis während der Visualisierung der Gefäße blockiert.

Eine zu direkte Annäherung kann zum Gefäßbruch führen. Verwenden Sie dann eine Mikrodissektions-Federschere mit einer geraden Schneide von zwei Komma fünf Millimetern, um den Sehnerv so nah wie möglich an der Netzhaut zu durchtrennen. Dies ermöglicht eine bessere flache Befestigung des Gewebes.

Um das retinale Gefäßsystem zu befestigen und sichtbar zu machen, verwenden Sie ein X PBS, um die präparierte Netzhaut zweimal für jeweils fünf Minuten zu waschen. Geben Sie einen Tropfen PBS auf einen Objektträger. Übertragen Sie dann mit einem Laborspatel mit einem Mikrolöffelende die Netzhaut in das Tröpfchen.

Halten Sie das Gewebe mit einer Pinzette an Ort und Stelle, während Sie mit einem Skalpell die becherförmige Struktur so schneiden, dass je nach Netzhautgröße eine flache Form von vier oder fünf Blütenblättern entsteht. Saugen Sie mit einem feinen Blatt Papier das übrig gebliebene PBS auf und achten Sie darauf, die Netzhaut nicht zu berühren. Bestreichen Sie dann die flach montierte Netzhaut mit Eindeckmedium und decken Sie sie mit dem Deckglas ab.

Achten Sie darauf, keinen Schaum zu bilden, da Luftblasen die Sichtbarkeit der Netzhautgefäße verzerren können. Verwenden Sie Nagellack, um die Abdeckung zu versiegeln. Führen Sie abschließend eine Fluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskopie durch, um das retinale Gefäßsystem sichtbar zu machen.

Hier ist ein morphologisches Beispiel des retinalen Gefäßsystems bei adulten transgenen Fliegen-EGFP-Zebrafischen zu sehen, das mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert wurde, und ein zweites Beispiel, das mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurde, das die Hintergrundfluoreszenz reduziert. Die sichtbare Netzhautstruktur zeigt ein hochorganisiertes Muster. Die Arteria opticus durchdringt die Netzhaut am Kopf des Sehnervs und breitet sich in den meisten Proben in fünf bis sieben Hauptgefäße aus.

Die Hauptgefäße verzweigen sich dann in eine Abfolge von Arkaden und verbinden sich mit dem inneren Sehkreis oder IOC, auch Umfangsvene genannt, der die Sehscheibe in der Peripherie der flach sitzenden Netzhaut umgibt. Die Netzhaut eines erwachsenen Zebrafisches setzt sich von innen nach außen aus den folgenden Schichten zusammen. Die Ganglienzellschicht, die innere plexiforme Schicht, die innere Kernschicht, die äußere plexiforme Schicht, die äußere Kernschicht, die Photorezeptorschicht und das retinale pigmentierte Epithel.

Die Schätzung von Gefäßparametern aus der retinalen Gefäßvisualisierung wird hier gezeigt. Das innere retinale Gefäßsystem befindet sich auf der Ganglienzellschicht, während die Herzkapillaren mit dem retinalen pigmentierten Epithel assoziiert sind. Einmal trainiert, kann diese Technik in weniger als 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, regelmäßig zu üben, da eine längere Abwesenheit von der Vorbereitung das Ergebnis der Gefäßintegrität verringert. Nach diesem Verfahren können Diabetes und neurovaskuläre Pathologien bei erwachsenen Zebrafischen analysiert werden.