Mit der phylogenetischen Analyse zu eukaryotischen Gens Herkunft untersuchen
14. August 2018
Eine Methode des Konstruierens einer phylogenetischen Stammbaum basierend auf Sequenzhomologie von Süßigkeiten von Eukaryoten und SemiSWEETs von Prokaryoten wird beschrieben. Phylogenetische Analyse ist ein nützliches Werkzeug für die Erklärung der evolutionären Verwandtschaft zwischen Homologen Proteine oder Gene aus verschiedenen Organismengruppen.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im phytogenetischen Bereich zu beantworten, z. B. wie man Sequenzen sammelt und wie man das richtige Berechnungsmodell auswählt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr einfach zu erlernen ist. Im Allgemeinen können diejenigen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, einfach weil sie nicht wissen, wie sie mit den Daten umgehen sollen, weil es an grundlegenden Kenntnissen der Prinzipien und Methoden der Phylogenie mangelt.
Diese Methode wurde erstmals entwickelt, als wir das Alignment von eukaryotischen SWEET-Genen analysierten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es eine Vielzahl von Auswahlmöglichkeiten und Einstellungen für verschiedene Aspekte der Ausrichtung gibt. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Auswahl von 35 SWEET-Kandidatenproteinen aus einzelligen eukaryotischen Organismen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Richte die 35 SWEET-Sequenzen aus, indem du sie in Clustal Omega eingibst. Kopieren Sie die Proteinsequenzen im FASTA-Format und fügen Sie sie in das Eingabefeld ein oder laden Sie eine Sequenzdatei im FASTA-Format hoch. Geben Sie an, dass es sich um eine Aminosäuresequenz handelt, indem Sie auf das Symbol unter dem Pulldown-Menü im ersten Schritt klicken.
Geben Sie bei Bedarf das Ausgabeformat und andere Parameter im zweiten Schritt an. Legen Sie für diese Studie das Ausgabeformat auf Clustal ohne Zahl fest, und belassen Sie die anderen Parameter auf den Standardeinstellungen. In den meisten Fällen funktionieren die Standardparameter ohne Angabe gut.
Übermitteln Sie die Ausrichtung, und führen Sie sie im dritten Schritt aus. Es kann zwischen mehreren Sekunden und Minuten dauern, bis die Ausrichtung abgeschlossen ist. Klicken Sie im Bereich Ergebniszusammenfassung mit der rechten Maustaste auf den Link unter dem Format Ausrichtung im CLUSTAL-Format, und speichern Sie die ausgerichteten Sequenzen als 35.clustal.
Um die Alignment-Ergebnisdatei in BioEdit zu öffnen, klicken Sie auf Sequenz und wählen Sie Edit Mood im ersten Pulldown-Menü im Hauptfenster von BioEdit aus. Klicken Sie dann im Untermenü auf Rückstände bearbeiten. Wählen Sie mit dem Cursor die hervorstehenden Sequenzen auf der linken Seite der Ausrichtung aus und klicken Sie auf das Symbol Löschen im Menü Bearbeiten, um die ausgewählten Sequenzen zu entfernen.
Markieren und löschen Sie die Sequenzen auf der rechten Seite der ersten MtN3-Speicheldomäne und speichern Sie die getrimmten ersten MtN3-Speicheldomänensequenzen als 35-1.fas. Löschen Sie auf ähnliche Weise die linke und rechte Seitensequenz der zweiten MtN3-Speicheldomäne und speichern Sie sie als 35-2.fas. Die erste und die zweite MtN3-Speicheldomänensequenz können mit Rhythmus oder TMHMM im Voraus vorhergesagt werden.
Öffnen Sie die Datei 35-1. fas mit MEGA und klicken Sie auf Ausrichten, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Klicken Sie im Menü Bearbeiten auf Alle auswählen.
Klicken Sie dann auf Sequenzen auswählen. Die Namen und Sequenzen der Taxa werden schwarz markiert. Wählen Sie im Menü Bearbeiten die Option Kopieren, um die Sequenzen in die Zwischenablage zu kopieren, und fügen Sie die kopierten Sequenzen dann in eine Dokumentdatei ein.
Ersetzen Sie in der doc-Datei alle Nummernzeichen durch das Größer-als-Zeichen und löschen Sie dann alle nicht zusammenhängenden Zeichen, um sie in das FASTA-Format zu konvertieren. Fügen Sie 1 am Ende jedes Taxonnamens hinzu, um sie als erste MtN3-Speicheldomänensequenzen zu markieren. Verarbeiten Sie die zweite MtN3-Speicheldomänensequenz nach der gleichen Methode und fügen Sie nach jedem Taxonnamen 2 hinzu.
Kombinieren Sie nun die erste und zweite MtN3-Speicheldomänensequenz im FASTA-Format in einer doc-Datei. Laden Sie dazu die kombinierten Sequenzen erneut in Clustal Omega und richten Sie die Sequenzen wie zuvor aus. Speichern Sie das Ergebnis als 35realigned.clustal.
Öffnen Sie die Datei 35realigned. clustal in BioEdit. Löschen Sie die unebenen Aminosäurereste an beiden Enden der ausgerichteten Sequenzen, und speichern Sie die Sequenzen dann als 35realigned.fas.
Klicken Sie auf Ja, wenn Sie gewarnt werden, dass einige nicht standardmäßige Zeichen nicht gespeichert werden können. Öffnen Sie 35neu ausgerichtet. fas in MEGA.
Klicken Sie auf das Menü Daten und wählen Sie Ausrichtung exportieren aus. Speichern Sie dann die Ausrichtung im POP-Format als 35. als nächstes für die spätere Verwendung in MR Base.
Klicken Sie in der Zwischenzeit auf das Symbol Modelle im Hauptfenster von MEGA. Wählen Sie "Beste DNA-Proteinmodelle suchen" und klicken Sie im Popup-Fenster auf OK. Klicken Sie auf Berechnen, um die Modellsuche zu starten.
Ein neues Fortschrittsfenster wird geöffnet. Dieser Vorgang dauert mehrere Minuten bis mehrere Tage, abhängig von der Komplexität der geladenen Sequenzen und der Leistung des Computers. Eine Tabelle mit den Ergebnissen wird geöffnet, nachdem die Modellsuche abgeschlossen ist.
Der kleinste BIC-Score wird zuerst aufgeführt, gefolgt von einer Reihe verschiedener Modelle mit allmählich steigenden BIC-Scores. Das erste Modell LG+G+F mit dem kleinsten BIC-Score ist das empfohlene Modell für den ML-Baum auf Basis der 35realigned. FAS-Datei.
Klicken Sie anschließend auf das Phylogenie-Symbol im Hauptfenster von MEGA. Klicken Sie auf Maximum-Likelihood-Baum erstellen/testen, und klicken Sie dann im Popup-Bereich auf Ja. Es öffnet sich ein neues Fenster, in dem verschiedene Parameter angezeigt werden, die angegeben werden müssen.
Legen Sie zunächst den Bootstrap-Wert im Test der Phylogenie-Box fest. 500 oder 1.000 ist in den meisten Fällen ausreichend. Wählen Sie unter Substitutionsmodell die Option Aminosäure als Substitutionstyp aus.
Der Zweck der Auswahl eines Substitutionsmodells besteht darin, die wahre Differenz zwischen Sequenzen auf der Grundlage ihres aktuellen Zustands zu schätzen. Wählen Sie LG mit Freqs-Modell im Feld Modell und Methode aus. Wählen Sie im Feld Raten und Muster die Option Gamma verteilt aus, um Ratenvariationen zwischen Standorten zu beschreiben, z. B. um Änderungen an sich langsam entwickelnden Standorten mehr Gewicht zu verleihen.
Wählen Sie im Feld Datenteilmenge die Option Vollständiges Löschen aus, um alle Spalten mit Bindestrichen zu entfernen. Behalten Sie alle anderen Parameter in ihrem Standardzustand bei. Nachdem Sie diese Parameter angegeben haben, klicken Sie auf das Symbol Berechnen, um die Berechnung zu starten.
Ein phylogenetischer ML-Baum wird vorgestellt, wenn die Berechnung mit MEGA abgeschlossen ist. Wählen Sie im Pulldown-Menü des Dateisymbols im Strukturbereich die Option Aktuelle Sitzung speichern aus, um das Ergebnis zu speichern. In der vorliegenden Studie wurde das Ergebnis als 35.mas gespeichert.
Im Baumbereich werden viele Parameter angezeigt, darunter die Länge der Klade, der Baumstil, die Baumtopologie, die Schriftart des Taxonnamens, die Größe und die Farbe, und können auf verschiedene Optionen eingestellt werden. Speichern Sie die endgültige Baumdatei, indem Sie auf das Bildsymbol klicken, und speichern Sie die Abbildung in verschiedenen Formaten oder kopieren Sie das Bild als Quelle für die Fotobearbeitung. Fahren Sie fort mit der Analyse der Beziehung von SWEETs und semiSWEETs sowie unter Verwendung der phylogenetischen Baumkonstruktion der Sequenzausrichtung mit MR Base, wie im Textprotokoll beschrieben.
Phylogenetische Bäume zeigen, dass alle ersten MtN3-Speicheldomänen der 35 SWEET-Sequenzen als eine Klade geclustert sind und die zweiten MtN3-Speicheldomänen der SWEET-Sequenzen als eine weitere Klade geclustert sind. Darüber hinaus zeigen die Alignment-Ergebnisse der SWEETs und semiSWEETs, dass einige semiSWEETs von Alpha-Proteobakterien mit der ersten MtN3-Speicheldomäne der SWEET-Sequenzen übereinstimmten, während semiSWEETs von Methanobakterien mit der zweiten MtN3-Speicheldomäne der SWEET-Sequenzen übereinstimmten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die beiden MtN3-Speicheldomänen, die SWEETs enthalten, aus einer evolutionären Fusion eines bakteriellen semiSWEET und eines Archaeums stammen könnten.
Einmal gemeistert, kann diese Technik je nach Komplexität der Daten in einer Stunde bis zu mehreren Tagen durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, im Voraus qualitativ hochwertige Sequenzen zu sammeln. Nach seiner Entwicklung ebnete dieses Protokoll den Weg für Evolutionsforscher, um die Beziehungen zwischen homologen Genen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen phylogenetischen Baum erstellt.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Erstellung eines phylogenetischen Baums basierend auf der Sequenzhomologie von SWEETs aus Eukaryoten und SemiSWEETs aus Prokaryoten beschrieben. Die Technik ist benutzerfreundlich und hilft beim Verständnis der evolutionären Beziehungen zwischen homologen Proteinen oder Genen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Phylogenetik
- Proteinevolution
- Sequenzanalyse
Hintergrund
- Die phylogenetische Analyse hilft, die evolutionäre Verwandtschaft zu erklären.
- Das Verständnis von SWEET- und SemiSWEET-Proteinen ist entscheidend für evolutionäre Studien.
- Neulinge können Schwierigkeiten mit der Datenverarbeitung haben, da ihnen grundlegendes Wissen fehlt.
- Visuelle Demonstrationen verbessern das Verständnis der Methode.
Zweck der Studie
- Eine klare Methodik für die Erstellung phylogenetischer Bäume bereitstellen.
- Die Auswahl geeigneter computerbasierter Modelle erleichtern.
- Forscher bei der Sammlung und Analyse von Sequenzdaten unterstützen.
Verwendete Methoden
- Auswahl von 35 kandidaten SWEET-Proteinen aus einzelligen Eukaryoten.
- Ausrichtung eukaryotischer SWEET-Gene.
- Verwendung verschiedener Einstellungen für Ausrichtungsaspekte.
- Visuelle Demonstrationen zur Anleitung der Nutzer durch den Prozess.
Hauptergebnisse
- Die Methode vereinfacht den Prozess der phylogenetischen Analyse.
- Sie bietet einen Rahmen zum Verständnis der Proteinevolution.
- Benutzer können Sequenzdaten mit geeigneter Anleitung effektiv verarbeiten.
- Visuelle Hilfsmittel verbessern die Lernergebnisse erheblich.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode ist für Forscher zugänglich, die neu in der Phylogenetik sind.
- Sie schließt die Lücke zwischen theoretischem Wissen und praktischer Anwendung.
- Zukünftige Studien können auf dieser grundlegenden Methodik aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die phylogenetische Analyse von Proteinfamilien wie den SWEET-Transportern ermöglicht eine mechanistische Risikominderung in der frühen Entdeckungsphase, indem sie die evolutionären Ursprünge und funktionellen Divergenzen klärt. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er konservierte Domänen von linienabhängigen Innovationen unterscheidet und so die Unsicherheit bei der Hypothesenbildung verringert. Erkenntnisse über Genfusionen leiten translationsorientierte Biomarkerstrategien und die Auswahl präklinischer Modelle für transportassoziierte Signalwege an.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, indem die Domänenarchitektur bis zu ihren prokaryotischen und archaealen Vorfahren zurückverfolgt wird.
- Operationaler Wert: Klärt die funktionelle Zielvalidierung durch die evolutionäre Erhaltung der MtN3-Saliva-Domänen in SWEET-Proteinen auf.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem evolutionär konservierte Regionen identifiziert werden, die weniger anfällig für kompensatorische Mechanismen sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme vor, indem Domänengrenzen für die Konstruktion chimärer Proteine definiert werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays durch sequenzalignierte MtN3-Domänen als quantitative Messgrößen für Transporteraktivität.
- Skalierbarkeit: Erleichtert die Wiederverwendung von Plattformen mittels Clustal-Omega- und MEGA-Pipelines für die Screening-Analyse der SWEET-Genfamilie über Arten hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem die Erhaltung von Domänen über Eukaryoten und Prokaryoten hinweg bestätigt wird.
- Biomarker-Korrelation: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Divergenz der SWEET-Domäne mit phänotypischen Zuckeraufnahmeprofilen in Beziehung gesetzt wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Leitet Go/No-Go-Entscheidungen durch die Betonung evolutionärer Zwänge bezüglich der mutationalen Toleranz des Targets ab.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen bis hin zur Identifizierung von Leitstrukturen, indem sie einen evolutionären Kontext für die Proteinfunktion bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem geklärt wird, ob die beobachtete SWEET-Funktion auf vertikale Vererbung oder horizontalen Gentransfer zurückgeht.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft von Assays anhand ausgerichteter MtN3-Domänen als stabile, quantifizierbare Einheiten für Hochdurchsatz-Screenings.
- Analytik: Hebt Maximum-Likelihood- und Bayes’sche Inferenzausgaben als statistische Maße für die Kladen-Konfidenz zur Priorisierung von Zielstrukturen hervor.
- Translationale Forschung: Schließt an die präklinische Kontinuität an, indem die Erhaltung von Domänen als Proxy für die funktionelle Erhaltung in Krankheitsmodellen validiert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt den Clustal-Omega–MEGA–MrBayes-Workflow als wiederverwendbare Methode zur Risikominimierung von Transporterfamilien über verschiedene Projekte hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielstrukturauswahl durch evolutionäre Absicherung mechanistischer Annahmen.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch feste Alignierungsparameter und Modellselektionskriterien (LG+G+F).
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung des Risikos spätzeitiger Fehlschläge aufgrund falscher Zuordnung des Zielmechanismus.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf evolutionären Restriktionswerten, abgeleitet aus der phylogenetischen Klade-Unterstützung.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Sequenzalignierung, der phylogenetischen Modellprüfung und der Bauminterpretation.
- Hängt von dem Zugang zu Clustal Omega, MEGA und MrBayes für die Alignierung und Baumkonstruktion ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich der Sequenzkuration und der Auswahl von Modellen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf Nicht-Transporter-Proteinfamilien mit unterschiedlichen Domänenarchitekturen.
- Ist durch die Unfähigkeit begrenzt, die funktionelle Äquivalenz der rekonstruierten ancestralen Zustände ohne experimentelle Validierung zu bestätigen.
