Ein Mikrocontroller betrieben Gerät zur Erzeugung von flüssige Extrakte aus herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, flüssige Extrakte aus Aerosolen von elektronischen Zigaretten für die Verwendung in toxikologischen Assays zu erzeugen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu elektronischen Zigaretten zu beantworten, z. B. wie sich das Aerosol der elektronischen Zigarette auf menschliche Gefäßzellen auswirkt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Luftstrom- und Puff-Timing-Protokoll von jedem einzelnen Labor an seine spezifischen Forschungsanforderungen angepasst werden kann.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf ein besseres Verständnis der potenziellen Risiken des Konsums von elektronischen Zigaretten, da sie eine anpassbare Plattform bietet, mit der Aerosolextrakte für elektronische Zigaretten in Ihrem eigenen Labor erzeugt werden können. Diese Methode kann Aufschluss über die Risiken von elektronischen Zigaretten geben. Es kann auch auf andere Produkte angewendet werden, wie z.B. herkömmliche Tabakprodukte oder Cannabisprodukte.

Befestigen Sie zunächst einen 100-Milliliter-Buchner-Kolben auf einem Stahlringständer und stellen Sie eine Vakuumfalle her, indem Sie ihn mit 50 Gramm Calciumchlorid füllen, um ihn als Trockenmittel zu verwenden. Verschließen Sie anschließend den Kolben mit einem Gummistopfen. Wickeln Sie die Stopfenverbindung mit Paraffinfolie ein und führen Sie eine Pipette durch das Loch.

Verbinden Sie die Pipette, die sich vom Topper erstreckt, mit einem Vinylschlauch mit einem T-Schnittpunkt-Schlauchanschluss. Verbinden Sie damit dann die beiden Impinger miteinander und verbinden Sie den Ausgang des zweiten Impingers mit dem T-Kreuzungsschlauchanschluss. Verwenden Sie als Nächstes den Vinylschlauch, um den Eingangsanschluss des ersten Impingers zu verbinden, der als Inhalationsanschluss dient.

Verbinden Sie auch den Seitenarm des Buchner-Kolbens mit dem Eingangsanschluss eines Luftstromreglers. Und verbinden Sie den Auslassanschluss des Luftstromreglers mit einer Vakuumpumpe. Setzen Sie dann einen 510-Gewindesockel in eine Ringständerklemme ein und verbinden Sie das Magnetventil mit einem Vinylschlauch mit dem freien Ende des T-Kreuzungsschlauchanschlusses.

Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie, ob alle Verbindungen luftdicht sind, und bringen Sie bei Bedarf Schlauchschellen an und saugen Sie Fett ab. Bestimmen Sie zunächst die Masse jedes E-Zigaretten-Kartomizers oder -Tanks, bevor sie verwendet werden, indem Sie sie auf eine Analysenwaage legen. Der Gewichtsunterschied zwischen vor und nach dem Gebrauch bestimmt die geeignete Dosierung.

Bei kommerziellen 3R4F-Forschungszigaretten beträgt der Nikotingehalt 7 Milligramm. Bei allen anderen handelsüblichen Zigaretten sollte der Nikotingehalt mit herkömmlichen Analysemethoden bestimmt werden. Wenn Sie den Viabilitätsassay für neutrale Rotaufnahmezellen für die nachgelagerte Analyse verwenden, füllen Sie das Reservoir des primären Imlingers mit 4,3 Millilitern Endothelzellkulturmedium.

Bereiten Sie als Nächstes die elektronische Zigarette oder die herkömmliche Zigarette für die Extraktion vor. Um eine herkömmliche Zigarette für die Extraktion vorzubereiten, kleben Sie ein Stück durchsichtiges Klebeband um den Filter und setzen Sie eine gut sichtbare Markierung an die Stelle, an der das Zigarettenpapier mit dem Filter verbunden ist. Um eine E-Zigarette vorzubereiten, stellen Sie sicher, dass der Akku gut geladen ist und der Cartomizer fest mit der Batterie verschraubt ist.

Wenn Sie einen Tank für elektronische Zigaretten verwenden, stellen Sie sicher, dass eine angemessene Menge an Flüssigkeit für elektronische Zigaretten in den Tank geladen ist, und schrauben Sie den Tank auf den Gewindesockel 510. Für die herkömmliche Zigarette laden Sie diese in den Inhalationsanschluss und sichern sie mit einer Schlauchschelle. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein.

Stellen Sie den Durchflussmesser so ein, dass er 1,65 Liter pro Minute zieht, um einen 55-Milliliter-Zug über zwei Sekunden zu gewährleisten. Schalten Sie dann den Mikrocontroller ein und zünden Sie damit die Zigarette beim ersten Zug an. Lassen Sie die Pumpe laufen, bis die projizierte gewünschte Konzentration erreicht ist.

Für eine E-Zigarette beginnst du damit, sie in den Inhalationsanschluss zu laden und mit einer Schlauchschelle zu sichern. Schalten Sie wie bei der herkömmlichen Zigarette die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Durchflussmesser so ein, dass er 1,65 Liter pro Minute zieht, um einen 55-Milliliter-Zug über zwei Sekunden zu gewährleisten. Lassen Sie die Pumpe laufen, bis das projizierte gewünschte Volumen verwendet wurde.

Stoppen Sie dann das Vakuum und bestimmen Sie die Nachnutzungsmasse jedes E-Zigaretten-Kartomizers oder -Tanks mit einer Analysenwaage. Vergleichen Sie dies mit der Masse vor dem Gebrauch, um die verbrauchte Gesamtmasse zu bestimmen. Wenn nicht genügend Masse konsumiert wurde, geben Sie die elektronische Zigarette wieder in das Gerät zurück und lassen Sie die Extraktion für zusätzliche Zeit laufen.

Spülen Sie nach jeder Extraktion die Schläuche und Behälter des Geräts mit 70 % Ethanol und entionisiertem Wasser, um eine Verschleppung zwischen den Proben zu verhindern. Lassen Sie dann das leere Gerät kurz laufen, damit der Luftstrom das Trocknen der Leitungen unterstützt. Wenn der Extrakt für Zellkulturen verwendet werden soll, filtrieren Sie den Extrakt, der das Medium enthält, durch einen 0,22-Mikron-Polyethersulfon-Spritzenfilter.

Einen Tag vor der Durchführung des Assays werden Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene in 96-Well-Platten mit 10.000 Zellen pro Vertiefung in 100 Mikrolitern Endothelzellwachstumsmedium ausgesät. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Ersetzen Sie am nächsten Tag das alte Kulturmedium entweder durch 100 Mikroliter frisches Endothelzellkulturmedium, das als Kontrolle dient, oder durch 100 Mikroliter Endothelzellwachstumsmedium mit 500 Mikromol konsumiertem Nikotin, das als Behandlungsgruppe dient.

Verschließen Sie die Platte mit einer Folie, um die Vertiefungen luftdicht zu halten, und legen Sie die Platte dann für 18 bis 24 Stunden wieder in den Inkubator. Viele der Bestandteile von Zigarettenrauch und Aerosol für elektronische Zigaretten sind flüchtig, daher ist es wichtig, die Vertiefungen mit einer Folie abzudichten, damit die Vertiefungen luftdicht sind. Verdünnen Sie kurz vor der Verwendung eine 100x neutralrote Stammlösung 1 bis 100 in Zellkulturmedium zu einer 1x neutralroten Färbelösung.

Inkubieren Sie die neutralrote Färbelösung vor ihrer Verwendung mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Es ist normal, dass einige Kristalle während der Inkubation ausfallen. Um zu vermeiden, dass diese Kristalle auf die Zellkulturvertiefungen aufgetragen werden, passieren Sie die Lösung durch einen 22-Mikron-Filter.

Entfernen Sie das experimentelle Nährmedium und geben Sie 100 Mikroliter der neutralroten Färbelösung in jede Vertiefung. Verwenden Sie den überschüssigen Fleck, um mindestens drei Blank Wells für eine korrekte Quantifizierung zu erstellen. Inkubieren Sie die Platte zwei bis vier Stunden lang, entfernen Sie dann die neutralrote Färbelösung und waschen Sie die Zellen dreimal durch Eintauchen in PBS.

Tragen Sie anschließend eine neutralrote Entfärbungslösung auf und inkubieren Sie die Platte mindestens zehn Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln. Wenn Sie fertig sind, lesen Sie die Platte bei einer Absorption von 540 Nanometern ab. Innerhalb von 24 Stunden nach der Exposition menschlicher Nabelvenendothelzellen gegenüber herkömmlichem Zigarettenrauchextrakt oder elektronischem Zigarettenaerosolextrakt kommt es zu einer signifikanten Verringerung der Zellviabilität.

Zusätzlich zu Zellviabilitätsstudien können die Extrakte selbst mit Hilfe der Gaschromatographie-Massenspektrometrie analysiert werden, wenn sie in Aceton extrahiert werden. Mit dieser Methode können viele Bestandteile des Extrakts bestimmt werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Aerosolen oder Rauch gefährlich sein kann und dass alle Extraktionen in einer chemischen Schutzhaube durchgeführt werden sollten.